طريقة طفيفة التوغل لتوليد نموذج فأر تقويمي متزاوي لسرطان الرئة

يركز بحثنا الحالي على فهم أمراض سرطان الرئة وكيفية تطوير طرق علاجية جديدة تتوافق مع العلاج القياسي، بما في ذلك العلاج الكيميائي، والإشعاعي، والعلاج المناعي. لم نتمكن من العثور على نموذج سرطان رئة تقويمي يحدد معايير لدراسة سرطان الرئة في المراحل المبكرة تحديدا. نعمل على توفير إرشادات واضحة وقابلة للتكرار لسد هذه الفجوة في هذا البروتوكول.

هذا البروتوكول بسيط التوغل وسهل التنفيذ. بالإضافة إلى المعايير التي قدمناها، يسمح هذا البروتوكول بفحص زرع الورم الدقيق ويتيح الكشف المبكر عن الورم عبر التصوير المضيء الحيوي. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة سرطان الرئة في المراحل المبكرة في نسيج المضيف، مما يسمح بتطوير علاجات جديدة للسرطان قبل سريريا ودراسة البيئة الدقيقة للورم.

سنستخدم هذه التقنية لتقييم آليات وفعالية العلاجات الجديدة المثيرة لسرطان الرئة قبل السريرية، ونأمل أن تؤدي إلى رعاية مستقبلية للمرضى. للبدء، ضع الفأر المخدر في مخروط أنف في وضعية الاستلقاء على جهاز تدفئة، ووضع مرهم العيون على كلتا عيني الفأر. بمجرد تأكيد التخدير، استخدم مقصات كهربائية لإزالة الفراء من منطقة مستطيلة بحجم سنتيمترات في ثلاثة سنتيمترات على الجانب الظهري الأيسر من الفأر.

احلق من العمود الفقري وسطيا، والطاولة من الجانب، والضلع الأخير من الأسفل والحافة العلوية لللوح باتجاه الرأس حتى لا يظهر فرو. ضع الفأرة في قفص فارغ على جهاز تدفئة. راقب نمط التنفس حتى يستعيد الفأر يقظته ثم أعده إلى قفصه المنزلي حتى إجراء الجراحة.

في يوم حصاد الخلايا، أضف وسط طازج يحتوي على 50 ملليغرام لكل ملليلتر من جنتامايسين إلى طبق الزراعة قبل الجمع بثلاث إلى أربع ساعات. استنشق الوسط من لوحة الزراعة واغسل الخلايا المتصلة ب 1x PBS. ثم حضن الخلايا بمحلول EDTA التريبسين لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

أضف وسائط جديدة لتعادلها التريبسين. قم بتشتت الخلايا عن طريق النقر اللطيف أو التوصيل بأنبوب على اللوحة. ثم اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي بسعة 50 ملليتر.

الآن، قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب المخروطي بحرارة 1,200 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التأكد من وجود حبيبة مضغوطة في الأسفل، استنشق السوبرنينت واغسل الحبيبة ب PBS. أعد تعليق الحبيبات المغسولة في PBS لتحقيق تركيز يقارب مليون إلى مليوني خلية لكل ملليلتر للعد.

قم بترشيح التعليق عبر مصفاة خلايا بقياس 40 ميكرومتر قبل المتابعة. بعد ذلك، اجمع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان. حمل العينة الملونة في جهاز قياس الدم وعد الخلايا.

احسب العدد الكلي للخلايا ومدى بقاء الخلية. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 1,200 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة واسحب PBS تاركا الحبيبة. أعد تعليق حبيبات الخلية بمقدار 0.5 ملليغرام لكل ملليتر من جل الميترا في PBS.

قم بضبط عدد الخلايا المطلوب بحجم حقن إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر. حافظ على تعليق الخلية على الجليد لمنع تصلب المادة. نظف موقع الجراحة على المخدر ثلاث مرات باستخدام شاش معقم، بالتناوب بين البيتادين والإيثانول بنسبة 70٪.

يضع ستائر جراحية معقمة مع فتحة بحجم ثلاثة في أربعة سنتيمترات فوق الفأر ويضع أدوات جراحية معقمة فوق الستيرة. باستخدام الملقط، حدد الحافة القمجمة لللوح والحافة اللطيفة لقفص الصدري الصدري. مع تثبيت الجلد بين إبهام الجراح والسبابة، قم بعمل شق جلدي سطحي بعمق خمسة مليمترات مباشرة تحت لوح الكتف باستخدام شفرة مشرط بحجم 10.

ثم استخدم مقصا مستقيما بحجم 115 ملم لفصل الدهون تحت الجلد بعيدا عن الأضلاع والعضلات بين الأضلاع دون قطعها. لإيقاف أي نزيف خفيف ناتج عن تلف الشعيرات الدموية، اضغط بلطف على جهاز تطبيق مقطن معقم على منطقة النزيف. أمسك الشق مفتوحا باستخدام الإعلانات الدقيقة والملاقط.

بدءا من الضلع الحقيقي السابع، استخدم ملقط النقطة الوسطى المنحنية للعد للأعلى وتحديد موقع الأضلاع الرابعة والخامسة. ضع علامة على هذه المنطقة كموقع الحقن. الآن، اقلب أنبوب تعليق الخلية بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلطه.

قبل الحقن مباشرة، اسحب 50 ميكرولتر من التعليق في حقنة أنسولين معقمة بسعة 300 ميكرولتر و31 قياس بقياس 8 ملم، مع التأكد من عدم وجود فقاعات. ضع شريطا من شريط معدني معقم بسماكة أربعة مليمترات مصففا على الحقنة ليعمل كحاجز وتحكم في عمق الحقن. حقن نظام تعليق الخلية بسعة 50 ميكرولتر بزاوية 90 درجة في الفراغ بين الأضلاع الرابعة والخامسة مباشرة تحت الضلع الرابع، واثبت الإبرة في مكانها لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان.

اسحب الإبرة ببطء من نفس الزاوية التي تم إدخالها وتخلص منها في حاوية القطع الحادة. وأخيرا، أغلق الشق الجلدي باستخدام غرزتين إلى ثلاث غرز مربعة معقودة ووضع لاصق جراحي بيطري على الغرز لتعزيز إغلاق الجرح. رصد التصوير التلألئي الحيوي إشارات مرتبطة بالورم في الفئران التجريبية في وقت مبكر بعد يوم واحد من الحقن، وزاد الإشعاع بشكل ملحوظ مع مرور الوقت لكل من 25,000 و50,000 خلية لكل مجموعة فئران، مع ملاحظة شدة أكبر في مجموعة ال 50,000 خلية.

زاد تدفق الورم الكلي بشكل أسي في كل من مجموعتي الخلية 25,000 و50,000، ليصل إلى أكثر من 10 أضعاف 10 إلى قوة ثمانية فوتونات في الثانية بحلول اليوم 21 في مجموعة الخلايا 50,000. أظهرت فئران الشامية عدم وجود توهج أو ورم مرئي في الرئتين المقطعتين، بينما أظهرت الفئران التجريبية توهجا عاليا وكتل ورم حمراء في أنسجة الرئة. بعد 21 يوما من الحقن، أظهرت الفئران المشمولة أورام محصورة في الفص الرئوي الأيسر دون أي غزو للمناطق المحيطة.