تحسين تحرير الجينوم عبر تقنية التثقيب الكهربائي في الجسم الحي القائمة على توصيل الأحماض النووية في الجسم الحي لتوليد الفئران بالضربة القاضية

نطاق أبحاثنا هو تبسيط توليد فئران الإغراق من خلال استخدام التعرض الكهربائي للرحم في الرحم، حيث يتم توصيل مكونات تحرير الجينوم مباشرة إلى قنوات البيض لدى الإناث الحوامل. تتطلب الحقن الدقيقة في الزيجوت الاحتفاظ بعدد كبير من، بما في ذلك الإناث المتبرعات والمتلقيات والذكور المدمنة بالمستوى. لذلك، يفضل استخدام البروتوكولات التي تقلل من استخدام.

يوفر استخدام نظام Nepa21 لعملية التثقيف الكهربائي للزيغوت فرصة فريدة لتوليد فئران جينية مستهدفة في خطوة واحدة، بكفاءة مماثلة لتقنيات الحقن النووي القياسية. للبدء، استخدم أدوات التحليل الحسابي لتحديد تسلسلات RNA ذات الدليل الواحد المحتملة التي تستهدف الجين المختار. اختر التسلسلات الموجودة في الإكسونات تكون أقرب ما يمكن إلى موقع الطفرة المطلوب. استخدم متصفح الجينوم لمقارنة بنية الإكسوم وتحديد أولويات التسلسلات الموجودة في معظم أشكال التشابك.

حلل النشاط المتوقع خارج الهدف لكل تسلسل دليل باستخدام نظام التسجيل المتكامل في الأداة. اختر تسلسلات تظهر أقل احتمال للارتباط خارج الهدف. لإنتاج قالب DNA خطي مزدوج السلسلة، حضر خليط PCR الرئيسي باستخدام المكونات المحددة في الجدول المعطى.

أضف البوليميراز أخيرا وأبق الخليط الرئيسي على الثلج للحفاظ على الاستقرار الإنزيمي. ثم شغل جهاز PCR باستخدام شروط الدورة الحرارية التالية. بعد ذلك، جهز خليط النسخ الرئيسي في المختبر باستخدام المكونات المعطاة وحضانة التفاعل لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية باستخدام جهاز دورة حرارية للتحكم المستمر في درجة الحرارة.

ثم أضف ميكرولترين من DNase I إلى التفاعل. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية لهضم قالب الحمض النووي، ثم قم بإيقاف الإنزيم عند 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تنقية تريزول للحمض النووي الريبي، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيف وفحص نسب A260 إلى A280 وA260 إلى A230.

لتحضير مركب الريبونوكليوبروتين للنقل، قم بتخفيف مخزن Tris-HCl بضرس واحد إلى تركيز 100 ملليمول باستخدام ماء خال من النوكليز. قم بتصفية المحلول باستخدام فلتر حقنة بحجم مسام 0.022 ميكرومتر. قم بتقسيم Aliquot إلى 10 ميكرولتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

بعد ذلك، جهز خليط النقل باستخدام نوكلياز spCas9، وRNA موجه واحد، وتريس-HCl مخفف بماء DEPC في أنبوب خال من النوكليز. حضن خليط النقل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بتكوين مركب الريبونوكليوبروتين. ثم قسموا خليط النقل إلى أحجام صغيرة مناسبة لجلسات I-GONAD فردية وحافظوا عليه عند أربع درجات مئوية للحفاظ على نشاط الكاشف.

بعد تزاوج إناث فئران اليوم الأول مع ذكور من الفئران ذات المبيت الأول خلال الليل، افحص كل أنثى بحثا عن وجود سدادة تزاوج. انقل فقط الإناث اللاتي لديهن سدادات مرئية إلى قفص جديد لإجراء إجراءات تجريبية إضافية. استخدم جميع أدوات الجراحة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في التعقيم لضمان التعقيم قبل الاستخدام.

ثم قم بوزن المؤشر المختار=الفئران الإناث الموجبة باستخدام ميزان إلكتروني قبل تخديرها. راقب الفئران المخدرة بحثا عن فقدان رد فعل قرص إصبع القدم للتأكد من وجود تخدير كاف. ضع الفأرة على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الإجراء.

ثم ضع مرهما بيطريا على العينين لمنع الجفاف. باستخدام مقص دقيق، قم بعمل شق طولي بقطر 0.7 سنتيمتر في جلد منطقة أسفل الظهر. ثم افرد أطراف المقص المفتوحة قليلا جانبيا لتمديد الشق الجلدي بلطف إلى حوالي 1.3 سنتيمتر.

بعد ذلك، قم بعمل شق بعمق 0.7 سنتيمتر في الصفاق بحذر لكشف تجويف البطن. قم بتمديد الشق البريتوني إلى 1.1 سنتيمتر، مع الدفع الثنائي بأطراف المقص المفتوحة قليلا. حدد موقع وسادة الدهون المتصلة بالمبيض واسحبها برفق للخارج باستخدام الملقط حتى تتعرض المبيض وقناة البيض والرحم.

باستخدام مشبك الأوعية، ثبت وسادة الدهون لتثبيت البنى التناسلية. بعد ذلك، قم بتحميل اثنين ميكرولترات من خليط حقن الريبونوكليوبروتين في شعيرات شعرية بلاستيكية قابلة للتخلص مرة واحدة باستخدام ماعلى جرد. باستخدام المقص الدقيق، قم بعمل شق بعمق 0.2 سنتيمتر في جدار قناة البيض على بعد بضعة مليمترات أعلى من الأمبولا.

أدخل الشعيرة الدموية البلاستيكية المثبتة على جهاز الإزالة في شق قناة البيض وطرد خليط الحقن بحذر دون إدخال الهواء. اسحب الشعيرات الدموية البلاستيكية من قناة البيض بلطف لإكمال الحقن. شغل جهاز الكهرباء بالضغط على مفتاح الطاقة في اللوحة الأمامية.

اضبط معايير التعرض الكهربائي على الجهاز كما هو موضح على الشاشة. باستخدام أقطاب كهربائية من نوع الملقط، أمسك قناة البيض بلطف واضغط زر الكيلو أوم لقياس المقاومة. مباشرة بعد قياس المقاومة، اضغط على زر البدء لبدء التثقيف الكهربائي وانتظر ظهور إشارة النهاية على زر الأوم.

بعد الحفر الكهربائي للقناة الأولى، أعد الجهاز التناسلي بلطف إلى تجويف البطن. أغلق الشق باستخدام خياطة جراحية 4-0 بحمض بولي غليكوليك. لعملية التصنيف الجيني، صمم من 18 إلى 21 بادئرا نيوكليوتيدا طويلا بدرجة انصهار تقارب 60 درجة مئوية لإنتاج منتج PCR من 300 إلى 600 زوج قاعدي.

لتأكيد خصوصية كل برايمر، قم بإجراء بحث BLAST على قاعدة بيانات جينوم الفأر لإزالة خطر التضخيم غير المحدد. بعد ذلك، لاستخراج الحمض النووي، باستخدام ثقب الأذن، اجمع عينة نسيج صغيرة بحجم حوالي مليمترين من أذن الفأر. أضف 100 ميكرولتر من مخزن التحلل.

حضن العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، مع الدوران كل 20 دقيقة لضمان تفكيك فعال. بعد إجراء تسلسل سانجر، قم بتحليل النتائج لتقييم نتائج تحرير الجينوم. لاستخدام تحليل ICE، قم بتحميل ملفي تسلسل سانجر، وأدخل تسلسل الحمض النووي الريبي الدليلي، واختر النوكليز المناسب المستخدم في تجربة كريسبر.

بعد ذلك، لاستخدام TIDE، قم بتحميل ملفات التحكم والتسلسل التجريبي بصيغة AB1 وأدخل تسلسل RNA الدليل. كشف تحليل ICE عن ثلاثة متغيرات مميزة من نوع إندل في موقع قطع Cas9، وحذف زوج قاعدة واحد في 42٪ من التسلسلات، وحذف ثلاثة أزواج قواعد في 25٪ من التسلسلات، وحذف 23 زوج قواعد في 27٪ من التسلسلات. كانت قيمة ملاءمة النموذج 0.94 ودرجة الإقصاء 69، مما يشير إلى ارتباط متوقع قوي واحتمال وجود جين يختفي.

أكدت كروماتوغرامات التسلسل وجود اضطراب في موقع قطع Cas9 في العينة المعدلة، بينما أظهر كروماتوجرام التحكم تسلسلا سليما في نفس الموقع. من بين ستة فئران كهربائية، أنتجت أربعة فقط جراء بها طفرات، مما أدى إلى كفاءة تحرير إجمالية 60٪. أظهرت جميع الولادات عبر الفئران الستة التي تم إضفاؤها بالكهرباء انخفاضا في أعداد الجراء، حيث كان هناك فقط ثلاثة إلى أربعة جراء لكل فأر.