بروتوكول محدث لتجميع واستخدام مصفوفة المفاعلات الحيوية المصغرة (MBRA)

لذلك يركز بحثنا على ميكروبيوم الأمعاء ، وتحديدا كيف يمكن هندستها لمنع استعمار مسببات الأمراض الضارة. في الوقت نفسه ، نحن مهتمون أيضا بفهم القواعد والآليات البيئية الكامنة وراء مقاومة الاستعمار هذه. تعمل التكنولوجيا ، مثل تسلسل الجيل التالي ، والمعلوماتية الحيوية المتقدمة ، والفئران الخالية من الجراثيم ، ونماذج الأمعاء في المختبر ، على تغيير الطريقة التي ندرس بها المجتمعات الميكروبية ودورها في الصحة والمرض.

أحد أكبر التحديات مع نماذج الأمعاء في المختبر هو تشغيلها بإنتاجية عالية. ما نحتاجه هو أنظمة تسمح بالاستجواب الوظيفي للمجتمعات الميكروبية على نطاق واسع. مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر عبارة عن نظام ثقافة تدفق مستمر تم تصميمه لمعالجة نقص قدرة الإنتاجية في الأنظمة الأخرى.

يسمح لنا بتوسيع نطاق التجارب مع الاستمرار في التقاط سلوك المجتمع الميكروبي المعقد والقابل للتكرار. للبدء ، تأكد من أن شرائط مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر مطبوعة ثلاثية الأبعاد وتحتوي على ست غرف مفاعل حيوي مستقلة. رتب جميع المكونات المطلوبة للتجميع.

باستخدام صنبور كسر 1/4 بوصة 28 NF مع مفتاح ربط بمقبض T. قم بربط المنافذ الثلاثة مقاس 1/4 بوصة في كل غرفة لإدخال التركيبات. بعد غسل الغرفة بالماء ، ضع قضيب تحريك مغناطيسي مقاس 10 × 3 ملم في كل غرفة وأضف مليلترا واحدا من الماء المقطر.

ثم ضع غسالة مطاطية أعلى كل منفذ للمفاعل الحيوي. لكل غرفة ، قم بربط إغراء ذكر ملولب من قش الوسائط ، وإغراء ذكر ملولب بقش نفايات ، وإغراء ذكر ملولب فارغ في المنافذ. الآن أدخل ستة حواجز مطاطية على انتقادات لاذعة للإغراء الأنثوية مقاس 3/32 بوصة وقم بطي الكم العلوي لكل حاجز لأسفل لتغطية الرقبة.

قم بإرفاقها بالمنافذ المخصصة لكل غرفة. قطع شرائط أنابيب C-flex بالطول والعدد المطلوبين. قم بتوصيل شوكة إغراء أنثوية مقاس 1/8 بوصة بأحد طرفيها وموصل قفل إغراء ذكر بالطرف المقابل لكل طول من الأنابيب.

ثم أدخل شوكة إغراء أنثوية مقاس 1/16 بوصة في كل طرف من طرفي أنبوب المختبر الإلكتروني الأحمر ثنائي التوقفات بقطر داخلي يبلغ 1.14 ملم ، وأنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ثنائي التوقف بقطر داخلي يبلغ 0.89 ملم. قم بتوصيل أنبوب المختبر الإلكتروني المحضر بأنبوب C-flex وتأكد من توصيل كل من أطوال الأنابيب C-flex الستة بخط E-lab أحمر وبرتقالي واحد عبر السحر الأنثوي. بعد ذلك ، قم بقص أنبوب C-flex بأطوال مختلفة حسب الحاجة.

قم بتوصيل شوكة إغراء أنثى مقاس 1/8 بوصة وموصل قفل إغراء ذكر على طرفي قطعة واحدة مقاس 3 بوصات وقطعة 12 بوصة من أنابيب C-flex. قم بتوصيل موصلات قفل الإغراء الذكور على طرفي القطع المتبقية. قم بتجميع شجرة خط النفايات وفقا للرسم التخطيطي ثلاثي الأبعاد.

قم بتوصيل الأطراف المكشوفة لأنبوب E-lab الأحمر ثنائي التوقف بأقفال إغراء الذكور الطرفية على شجرة خط النفايات بترتيب تصاعدي بناء على طول الأنبوب C-flex. ثم قم بتوصيل أنبوب C-flex مقاس 3 بوصات بشوكة الإغراء الأنثوية مقاس 1/8 بوصة وموصل قفل إغراء الذكور بالجزء العلوي من شجرة خط النفايات. قم بتجميع شجرة خط التغذية وفقا للرسم التخطيطي ثلاثي الأبعاد.

قم بجسر الأطراف المكشوفة لأنابيب المختبر الإلكتروني البرتقالية ذات التوقفين إلى أقفال إغراء الذكور الطرفية على شجرة خط التغذية بترتيب تصاعدي بناء على طول الأنبوب C-flex ، وقم بتوصيل أنبوب C-flex مقاس 12 بوصة بالجزء العلوي من شجرة خط التغذية. قم بتوصيل الأنبوب C-flex متغير الطول في نهاية شجرة خط التغذية بالمفاعل الحيوي ، وترتيبها بترتيب تصاعدي من أقصر خط على اليسار إلى الأطول على اليمين. قم بتوصيل أنبوب C-flex متغير الطول في نهاية شجرة خط النفايات بشريط المفاعل الحيوي بترتيب تنازلي مع أطول خط على اليسار والأقصر على اليمين لاستيعاب وضع المضخة.

قم بتجميع جميع خطوط تغذية C-flex معا على الجانب الأيسر من الشريط وقم بتثبيتها برباط ملتوي. قم بتشكيل حلقة باستخدام أنبوب E-lab البرتقالي ثنائي التوقف بين خطوط C-flex وقم بتأمين الحلقة باستخدام شريط الأوتوكلاف ، وكرر العملية لأنابيب المختبر الإلكتروني الحمراء ثنائية التوقف على جانب النفايات من شريط المفاعل الحيوي. قم بتغطية الإغراء الأنثوي في نهاية النفايات وأشجار خط التغذية بورق الألمنيوم لمنع التلوث.

قم بفك السحر الملولب للذكور باستخدام الحاجز على كل غرفة مفاعل حيوي للسماح للبخار بالخروج أثناء التعقيم. بعد وضع المجموعة في صندوق الأوتوكلاف ، قم بتمديد أشجار خط التغذية والنفايات في صناديق منفصلة مجاورة للحاوية التي تحتوي على شرائط MBRA. لتوصيل النظام بالمضخات، قم بإزالة شريط الأوتوكلاف الذي يثبت أنبوب المختبر الإلكتروني لكل من خطوط النفايات والتغذية، وفك حزم الأنابيب C-flex.

ضع MBRA بين المضختين أعلى لوح التحريك. قم بتثبيته باستخدام الحوامل المطبوعة ثلاثية الأبعاد وقم بمحاذاته مع مواضع التحريك المحددة على اللوحة. الآن قم بتوصيل أنبوب E-lab لخط التغذية بخراطيش المضخة التمعجية وضع نقاط توقف الأنابيب في فتحات الخرطوشة.

كرر العملية لأنبوب المختبر الإلكتروني لخط النفايات على المضخة الموجودة على يمين لوحة التحريك. ثم قم بقفل خراطيش المضخة التمعجية في المضخة. رتب الأنابيب C-flex بدقة باستخدام حاملات الأنابيب المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

قم بتوصيل نهاية شجرة خط النفايات بالأنبوب المتصل بزجاجات النفايات. بعد ذلك ، قم بتوصيل الإغراء الأنثوي على أنبوب إدخال خط التغذية بالموصل الذكر على الأنبوب مقاس 12 بوصة من غطاء زجاجة الوسائط. قم بتشغيل كلتا المضختين لبدء تدفق الوسائط والتأكد من ضبط كلتا المضختين على الدوران في اتجاه عقارب الساعة عند وضع النفايات على يمين المضخات.

راقب حجم القطرات وإيقاعها في كل غرفة مفاعل حيوي. في حالة ملاحظة أي تباين أو خلل ، فاستبدل أنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ثنائي التوقف المتصل بالغرفة المصابة لتقليل تباين معدل التدفق. بمجرد امتلاء الغرف ، أغلق كلتا المضختين واسمح للمفاعلين الحيويين بالجلوس لمدة 24 إلى 48 ساعة للتحقق من التلوث قبل بدء التجربة.

قم بتبديل إدخال الوسائط إلى حاوية سعة لتر واحد من مادة التبييض بنسبة 10٪ في الماء منزوع الأيونات وقم بزيادة معدل التدفق على كلتا المضختين إلى الحد الأقصى لإزاحة محتويات غرف المفاعل الحيوي باستخدام المبيض. بمجرد خلو الغرف من الوسائط ، اقلب MBRA للتطهير فوق خط التعبئة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بتصحيح النظام وانتظر خمس دقائق إضافية للتعقيم.

بعد تنظيف الغرف من الوسائط وتعقيمها لمدة 10 دقائق ، استبدل المبيض بلتر واحد من الماء منزوع الأيونات واغسل النظام حتى يمر الماء. ثم افصل أنبوب E-lab للمفاعل الحيوي عن المضخات وقم بإزالة MBRAs. قم بإزالة الحاجز المستخدم من المفاعل الحيوي وصفي كل غرفة حتى يتبقى مليلتر واحد فقط من الماء.

استبدل الحاجز ، وأنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ثنائي التوقف ، وقم بتعقيم الشريط المجمع بالكامل كما هو موضح سابقا. بعد ثلاث دورات من إعادة الاستخدام ، اتبع هذه الخطوات. تم تحضير عينة براز بشري وزراعتها في نظام MBRA.

بعد أربعة أيام من التدفق المستمر ، سيطر على المجتمع الميكروبي في جميع المفاعلات الحيوية التسعة 18 جنسا بكتيريا ، كل منها يشتمل على 2٪ على الأقل من الوفرة النسبية في أي تكرار. كان 22 جنسا من أصل 65 جنسا تم اكتشافها موجودة في جميع تكرارات المفاعلات الحيوية التسعة ، مما يدل على قابلية عالية للتكاثر. أظهر تحليل تنوع ألفا تباين ضئيلا بين التكرارات في كل من الوحدات التصنيفية التشغيلية المرصودة ومؤشر شانون للتنوع.