إنتاج واستخدام قوالب الاغاروز القابلة للتخصيص لزراعة بصيلات مبيض الفأر الخالية من السقالات

تهدف أبحاثنا إلى تطوير طرق زراعة جريبات قابلة للتخصيص، محاكاة فيزيائية، وخالية من السقالات، لتحديد ما إذا كان يمكن تحسين جودة البصيلات المزروعة في المختبرات والبويضات التي تنتميها. حاليا، تستخدم أكثر طرق الزراعة تقدما نظام نمو جريبات مغلف بالهيدروجيل، في المختبر، مما يسمح للجريبات بالحفاظ على بنيتها ثلاثية الأبعاد أثناء تكوين الجريبات. تغليف الهيدروجين يمثل تحديا تقنيا، شاقا، منخفض الإنتاجية، وللأسف غير متوافق مع طرق التصوير التلقائي.

بالإضافة إلى ذلك، يوفر التغليف ثلاثي الأبعاد دعما موحدا لا يحاكي فسيولوجيا الحية الجسدية. أنشأنا قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد ومتوافقة حيويا تدعم خلايا البويضات شديدة الحساسية. أظهرت البصيلات المزروعة في بيئة خالية من السقالات تحسنا في النمو والإباضة دون التأثير على إنتاج الهرمونات مقارنة بالتقنيات المعتمدة.

نحن نلبي الحاجة إلى نظام زراعة سهل الاستخدام وقابل للتخصيص يمكن أن يحاكي البيئة الطبيعية للجريبات بشكل أفضل. يسمح التصوير بالتايم لابس أيضا بتتبع وتحليل أداء الجريبات بشكل مباشر. للبدء، قم بتشغيل برنامج CAD على نظام حاسوبي.

افتح ملف الخطوة لتصميم قاعدة القالب الرئيسي ذو 24 بئر في البرنامج. اختر مساحة السطح الداخلية للجسم. ثم انتقل إلى علامة التبويب Solid في مساحة التصميم، واختر إنشاء الرسم لإدخال التصميم الميكرومولد المطلوب.

الآن، نقدم الأبعاد وعدد الميكروآبار المطلوبين x و y. ثم اختر إنهاء الرسم التخطيطي في شريط الأدوات. أنشئ الآبار الدقيقة بعمق 800 ميكرومتر باستخدام وظيفة البثق عن طريق اختيار Solid وCreate، وExtrude بشكل متسلسل.

الآن، اختر شريحة نصف قطرها 0.1 ملم لأعلى الآبار الدقيقة بالنقر على التصميم، الصلابة، التعديل، والقطع. أضف شريحة نصف قطرها 0.25 ملم لإنشاء بئر دقيق ذو قاع مستدير. احفظ تصميم القالب الرئيسي الجديد وصدر نسخة بصيغة خطوة باختيار ملف والضغط على التصدير.

افتح ملف الحاوية ذات السيليكون المصبوب ب 24 بئرا خطوة واحدة. ثم أدخل تصميم القالب الرئيسي الجديد كمكون خارجي عن طريق النقر بزر الفأرة الأيمن على الملف المحفوظ واختيار إدراج في التصميم الحالي. بعد ذلك، انقر بزر الفأرة الأيمن على المكون المدرج واختر رابط الكسر لإزالة الإشارة إلى تصميم القالب الرئيسي.

مركز تصميم القالب الرئيسي الجديد داخل سطح واحد من الحاوية المصبوبة بالسيليكون ذات 24 بئر، لضمان تواجده للداخل. اختر OK لمحاذاة الأجسام. اختر عملية القطع، باستخدام الحاوية كجسم مستهدف والقالب الرئيسي كجسم أداة لإنشاء تجويف التشكيل السيليكوني.

احفظ وصدر القالب السيليكون الجديد ب 24 بئر كملفات STL وstep. افتح ملفات stl الخاصة بقالب السيليكون الجديد ب 24 بئر واحد وعلبة السيليكون المصبوبة 24 بئر 24 والثانية باستخدام برنامج تحضير الطباعة ثلاثية الأبعاد. وجه الطباعة بحيث تكون الأعمدة الدقيقة متجهة للأعلى، واستخدم وظيفة ثقب الحفر لإنشاء فتحة بعرض مليمتر واحد على جانب الطباعة.

اطبع كلا تصميمي الحاويات بسماكة طبقة 25 ميكرومتر. اغسل المطبوعات النهائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم رش قسم الميكروبيلار بشكل مكثف بنسبة 95٪ من الأيزوبروبانول.

أزل أي إيثانول متبقي باستخدام الهواء المضغوط. بعد التجفيف والتجفيف، افحص كل طبعة باستخدام مجهر ستيريو. تأكد بعناية من أن جميع الأعمدة الدقيقة منفصلة وموحدة في الحجم والمظهر.

بعد التصويب، غط الجزء الخارجي من الطباعة بفيلم Parafilm إذا لم تملأ قناة الحفر، وخزن حتى الاستخدام الإضافي. بعد ذلك، ضع السيليكون المحضر في مجفف فراغ لمدة خمس دقائق لإزالة فقاعات الهواء. صب خليط السيليكون بتدفق منتظم في القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد، مع التأكد من تطابق مستوى القالب أو يكون أدونه قليلا من سطح القالب لضمان الاستواء.

أزل الهواء المحبوس برأس ماصة P200 وقم بإزالة الغازات مرة أخرى إذا لزم الأمر. قم بتجفيف السيليكون في درجة حرارة الغرفة في مجفف لمدة لا تقل عن خمس ساعات أو ويفضل طوال الليل. بعد التصلب، أزل السيليكون من القالب، وفحص القوالب الدقيقة تحت مجهر ستيريو.

قم بإزالة أي مواد زائدة من قناة الحفر، وتخلص من القوالب التي تحتوي على جسور أو آبار تالفة. بعد ذلك، ضع قالب السيليكون في حاوية قالب السيليكون رقم 2 للخطوة الثانية في التشكيل، مع التأكد من محاذاة الفتحة الجانبية. رش قالب السيليكون بخفة بزيت معدني آمن للأجنة.

أزل الزيوت الزائدة من الآبار الصغيرة باستخدام الهواء المضغوط. كرر عملية خلط السيليكون وصب الخليط الجديد في الحاوية الثانية، مع الحفاظ على المستوى عند أو تحت سطح القالب. في اليوم التالي، افصل السيليكون عن القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد وقالب السيليكون واحد واثنين من بعضهما البعض.

بعد فحصها بالمجهر، تخلص من القوالب التي تحتوي على أعمدة دقيقة متضررة أو زيت زائد في الآبار. الآن، اغسل قالب السيليكون بنسبة 70٪ إيثانول. دعها تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة داخل غطاء تدفق سطحي.

بعد أن يجف، ضع القالب في كيس تعقيم قبل التعقيم المستخدم. ثني طرف الجريب قليلا لتعزيز الدقة أثناء نقل الجريبات. انقل الجريبات بسرعة لمنع تقلبات الرقم الهيدروجيني أو درجة الحرارة.

تحت المجهر، استخدم رأس جرعة بحجم 200 ميكرومتر لنقل 10 بصيلات ثانوية متعددة الطبقات لكل مولد دقيق، ووضعها في آبار دقيقة متجاورة. تأكد من أن جميع الجريب العشر متشابهة في الحجم قبل الانتهاء من الإعداد. بعد ذلك، ضع غطاء تركيز الضوء على مجهر محمول.

أدخل المجهر مع التركيب في الحاضنة، ووصل اللابتوب عبر البرنامج. ضع الزراعة في وضعها ومحاذاة جيدا تحت المجهر وضبط الارتفاع والتركيز بحيث تكون جميع الجريبات مرئية. استخدم توازن اللون الأبيض التلقائي، ونظام AWB، والتحكم في LED.

أوقف التعريض التلقائي، وتعديل العرض، واختر وقت التعريض الأمثل. ابدأ التصوير بتقنية التايم لابس بمدة ثمانية أيام وفترة زمنية قدرها 30 دقيقة. اختر صورة وأطفئ LED عندما لا تلتقط الصور.

أظهرت الجريبات التي زرعت في عفن الأغاروز الدقيقة نموا مستمرا وتكون تجاويف الأنفال. بعد تحفيز الإباضة، أنتجت الجريبات المزروعة في عفن الأجاروز الدقيقة بويضات بيضة أكثر مقارنة بتلك الموجودة في الألجينات. لتوضيح التوافق الحيوي، لم تختلف شكل المغزل لبيض M2 بشكل كبير بين المجموعات.

لم تحتفظ الجريبات المغلفة بالألجينات بموقعها أثناء الزراعة وغير متوافقة مع التصوير السريع (time-lapse). خلال التصوير الزمني، كان بالإمكان تتبع وقياس شكل الجريبات الفردية، بما في ذلك قطر فيريت، ودائريتها، ونسبة العرض إلى الارتفاع، فورا طوال فترة الزراعة. مكن التصوير المقطعي البصري للتماسك البصري من التصور ثلاثي الأبعاد لهياكل الجريبات الداخلية كما التقط أحداث تمزق الجريبات الديناميكية أثناء الإباضة.

مكنت عفن الأغاروز الدقيقة من التحليل النسيجي لعدة جريبات في نفس المستوى بعد دمج وتقسيم البارافين، مما سمح بتحديد وجود أو غياب الأنسجة ودعم تلوين H&E. لإثبات قابلية تخصيص هذه الطريقة، تم إنشاء نسخة عالية الإنتاجية تحتوي على 96 بئر تحتوي على 10 آبار دقيقة لكل قالب، وتم تصنيعها بنجاح. وكما هو الحال مع تصميم 24 بئرا، كان متوافقا مع التصوير الزمني للبصيلات.