تقييم التدخلات العلاجية في نموذج الفأر الناقص-SHIP لالتهاب اللفائفي والتليف الشبيه بمرض كرون

نستخدم الفئران التي تعاني من نقص في SHIP لدراسة الآليات التي تدفع الالتهاب والأمعاء والتليف في مرض كرون ولتقييم أدوية أو استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج مرض كرون. لذا استخدمنا هذا النموذج في الدراسات ما قبل السريرية لإظهار فعالية أدوية الجليكوجين لأمراض الأمعاء الالتهابية في توصيل الأدوية المستهدفة. يستخدم بروتوكولنا فئران تفتقر إلى SHIP، والتي تطور بشكل طبيعي التهاب لفائفي وتليف، مما يوفر نموذجا أكثر صلة فسيولوجيا مقارنة بالنماذج الكيميائية التقليدية أو المعتمدة على الإصابات.

تثبت نتائجنا أن الفئران التي تعاني من نقص في SHIP هي نموذج قوي للالتهاب اللفائفي والتليف، مما يمكن من إجراء دراسات ميكانيكية واختبارات ما قبل سريرية لعلاجات مرض كرون. للبدء، صوم الفئران لمدة أربع ساعات قبل إجراء الاختبار. قم بإذابة أربعة كيلو دالتون FITC-ديكسترن في PBS معقم للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 80 ملليغرام لكل ملليلتر.

بعد ذلك، قيد كل فأر بلطف وأعط 150 ميكرولتر من محلول FITC-dextran عبر التجويق الفموي، ثم أبق الفئران بدون طعام لأربع ساعات أخرى بعد التجويد. بعد القتل الرحيم للفأر، قم بإجراء ثقب القلب باستخدام إبرة عيار 25 وحقنة بسعة ملليلتر واحد لجمع الدم. أضف فورا 10 ميكرولترات من محلول الحمض-سترات-الدكستروز إلى كل 100 ميكرولتر من الدم المجمع كمضاد تخثر.

اخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. قام بأخذ عينات دم في الطرد المركزي عند 1,500 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل البلازما بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق الموسومة بسعة 1.7 مليليتر.

احتفظ بجميع العينات على الثلج ومحمية من الضوء حتى تكون جاهزة للتحليل. الآن، قم بتخفيف كل عينة بلازما بنسبة واحد إلى اثنتين وواحدة إلى عشرة باستخدام PBS. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف بلازما في صفيحة معتمة تحتوي على 96 بئر، ووضعها في آبار مكررة.

قم بتخفيفات تسلسلية واحدة إلى مرتين لمخزون FITC-dextran الأصلي بوزن 80 ملليغرام لكل ملليلتر باستخدام PBS لتحضير تركيزات مختلفة من المحلول. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى آبار مكررة من صفيحة 96 بئرا. ثم يقيس الفلورة باستخدام قارئ ميكرولوح مضبوط على 485 نانومتر للإثارة و535 نانومتر للانبعاث.

بعد جمع الدم لاختبار FITC-dextran، قم باستئصال الأمعاء الدقيقة بالكامل من الفأر بعناية. قم بإزالة أي دهون وأنسجة ضامة ملتصقة من الأمعاء بلطف. ضع الأمعاء النظيفة مسطحة على ورقة بيضاء بيضاء لتعزيز التباين البصري.

افحص الأنسجة بصريا بحثا عن أي علامات مرض كبيرة، مع الانتباه بشكل خاص إلى المسافة البعيدة 10 سنتيمترات في فئران SHIP Knockout، حيث يحدث الالتهاب شائعا. قم بمحاذاة الأمعاء بجانب مسطرة لتوفير مقياس وصور العينة كاملة لتوثيق أي اكتشافات مرضية جسيمة. غسل تجويف الأمعاء بلطف باستخدام حقن لإزالة أي محتويات معوية مع تجنب القوة الزائدة لمنع تشويه الزغب وبنية القبوة.

تحديد المنطقة الأكثر تمثيلا من اللفائفي البعيد لأمراض المرض الإجمالي واستئصال حوالي سنتيمتر واحد من النسيج. ضع النسيج المستخرج بشكل مسطح داخل شريط نسيجي وضعه بين إسفنجتين لمنع طيه أثناء التثبيت. بالنسبة لتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين وصبغ ماسون ثلاثي اللون، ثبت النسيج في الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ باستخدام حجم النسيج بمقدار 10 إلى 20 ضعف حجم النسيج خلال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد التثبيت، انقل الكاسيت إلى 70٪ إيثانول للتخزين وتأكد من بقائها مغمورة تماما حتى المعالجة. بالنسبة لتلوين الأزرق الألسي وصبغ الحمض-شيف الدوري، ثبت النسيج في محلول كارنوي طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد التثبيت، انقل الكاسيت إلى 100٪ إيثانول للتخزين حتى المعالجة.

ثم قم بإدخال الأنسجة الثابتة في البرافين وقطعها إلى شرائح بحجم خمسة ميكرومتر للصبغ لاحقا. قم بتقييم مقاطع الهيماتوكسيلين والإيوسين اللذي المصبوغ بالإيوسين باستخدام مقياس من 16 نقطة وفقا لمعايير التحليل النسيجي المحددة. قيم مقاطع ماسون الملونة بالألوان الثلاثية باستخدام مقياس من ست نقاط بناء على معايير محددة مسبقا.

احسب الدرجة النهائية للتليف كالوسيط للدرجات التي يمنحها مراجعان مستقلان يعميان عن الظروف التجريبية. بعد التشريح وإزالة عينة علم الأنسجة، اجمع الجزء المتبقي من ال 10 سنتيمترات البعيدة من اللفائفي. جفف النسيج المجمع بمنشفة ورقية أو مناديل خالية من الوبر، ثم سجل وزن النسيج باستخدام ميزان معاير.

قم بتجميد النسيج بسرعة في النيتروجين السائل قبل تخزينه عند ناقص 80 درجة مئوية للمعالجة المستقبلية. عندما تكون جاهزة للمعالجة، استرجع الأنسجة المجمدة وحافظها دائما على الثلج. ثم قم بوزن عينات الأنسجة مرة أخرى لتأكيد الكتلة الدقيقة.

جهز مخزن التجانس عن طريق إضافة مثبط للبروتياز إلى PBS. استخدم 10 ميكرولتر من المحلول المؤقت لكل ملليغرام من الأنسجة. باستخدام متجانس على سطح الطاولة، قم بتجانس كامل سمك نسيج اللباقي في مخزن التجانس البارد جدا.

استمر حتى يصبح التجانس موحدا وخاليا من شظايا الأنسجة المرئية. اشطف طرف الماكينة جيدا باستخدام PBS بين العينات لمنع التلوث المتبادل. الطرد المركزي، يتجانس النسيج عند 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

يقوم بتقسيم المواد الشفافة إلى أحجام أصغر لمنع دورات التجمد والذوبان، ثم يخزنها عند ناقص 80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي. كشفت التحليلات النسيجة عن تلف معوي أكبر بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من نقص في SHIP مقارنة بعناصر SHIP. خفض علاج الديكساميثازون الضرر النسيجي في الفئران التي تعاني من نقص SHIP، رغم أن الانخفاض لم يكن ذا دلالة إحصائية.

أظهر تلوين ماسون الثلاثي الألوان زيادة ملحوظة في ترسيب الكولاجين في الفئران التي تفتقر إلى SHIP مقارنة بعناصر SHIP، مما يشير إلى درجات أعلى في التليف. أدى علاج الديكساميثازون إلى تقليل التليف بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من نقص SHIP، مما يقرب الدرجات من النقاط الإيجابية ل SHIP. أكد تلوين الأزرق الألسي وPAS فرط تنسج خلايا الكأس في فئران تعاني من نقص في SHIP، وقد انخفض بشكل ملحوظ بعد علاج الديكساميثازون.

كانت تركيزات بيتا IL-1 مرتفعة بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من نقص في SHIP مقارنة بعناصر SHIP. خفض الديكساميثازون بشكل ملحوظ تركيزات IL-1beta في الفئران التي تعاني من نقص في SHIP. كانت تركيزات MPO مرتفعة بشكل ملحوظ في الفئران التي تعاني من نقص في SHIP مقارنة بعناصر التحكم في SHIP، وتم تقليل هذه الزيادة بواسطة الديكساميثازون دون تحقيق دلالة إحصائية.

كما ارتفعت تركيزات LCN-2 في الفئران التي تعاني من نقص في SHIP، لكن القيم العالية لم تنخفض باستمرار بواسطة الديكساميثازون. ارتبطت تركيزات بيتا من IL-1 إيجابيا بدرجات الضرر النسيجي ودرجات التليف، مما يشير إلى وجود علاقة بين الالتهاب وإصابة الأنسجة. كانت درجات الضرر النسيجي مرتبطة إيجابيا بدرجات التليف، مما يشير إلى أن تلف الأنسجة وإعادة تشكيل الألياف تقدما بالتوازي.