الطفرات القائمة على كريسبر-كاس9 في الدودة الخيطية الممرضة للحشرات ستاينيرنيما خنثى وصيانة خطوط الطفرات

نعمل على وراثة تعايش بكتيريا الديدان الخيطية، الذي له تطبيقات زراعية. الأدوات الجينية في بكتيريا Xenorhabdus متطورة بشكل جيد جدا، لكن جينات EPN لا تزال محدودة، وتعتمد بشكل رئيسي على فحوصات RNAi وEMS. للبدء، احصل على صفائح ديدان الديدان المزروعة ببذور Xenorhabdus griffiniae وComamonas aquaticus.

اختر ديدان ستينرنيما الخيطية على صفائح NGM المحضرة التي تحتوي على Xenorhabdus griffiniae. حضنها عند 25 إلى 28 درجة مئوية للحصول على أفضل نموه. في الليلة التي تسبق الحقن الدقيق، اجمع الخنثى من المرحلة J3 على صفائح أغار NGM طازجة مزروعة ب Xenorhabdus griffiniae.

في يوم الحقن الدقيق، اختر الخنثى الصغيرة للحقن. استخرج تسلسل الجين المستهدف من الجينوم المرجعي لشتاينرنيما الخنثى باستخدام BlastP. اختر إكسون ترميز مبكر، ويفضل أن يكون الإكسون الأول، وأدخل التسلسل في CRISPRscan باستخدام الإعدادات الافتراضية لتوليد RNA مرشح ل CRISPR.

الهجوم على المرشحين الأعلى CRISPR RNA ضد جينوم Steinernema hermaphroditum لضمان عدم وجود تطابقات غير مستهدفة. تخزين RNA المختارة من CRISPR وRNA التحويل الشامل ل CRISPR عند 100 ميكرومولار لكل منها في مخزن مزدوج عند ناقص 80 درجة مئوية. قم بإذابة 2٪ أغاروز في الماء باستخدام الميكروويف.

انقل 50 ميكرولتر من الأغاروز المذاب إلى زجاج تغطية. غطه فورا بزجاج غطاء ثان. بعد 20 دقيقة من الجفاف، أزل الغطاء العلوي للزجاج، ثم ضع علامة على الجانب الأمامي من وسادة الأغاروز.

خزن وسادات الأجاروز في درجة حرارة الغرفة للاستخدام طويل الأمد لأشهر إلى سنوات. لتحضير الإبر للحقن، اسحب شعيرات الكوارتز على جهاز سحب خيوط ليزرية وخزن الإبر في صندوق تخزين ماصة. تحضير دوبلكس RNA جديد عن طريق خلط crRNA المختارة مع RNA الترانس-منشط العالمي CRISPR بنسبة واحد إلى واحد.

حضن الأنبوب عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم برد إلى درجة حرارة الغرفة إلى الدوبلكس المولد. قم بتجميع خليط الحقن بدمج Cas9، وكلوريد البوتاسيوم، وأقراص gRNA المزدوجة واحتضنها. حرك أنبوب PCR ثلاث مرات للخلط، ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لمدة 10 إلى 15 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير.

بعد المزج النهائي، قم بتدوير لمدة تصل إلى دقيقة واحدة لجمع المحتوى. بعد ذلك، استخدم رأس الميكرولودر لتحميل واحد إلى اثنين ميكرولتر من خليط الحقن في الإبرة. ثبت الإبرة على الحامل، وافتح الطرف عن طريق سحب شريط لاصق مزدوج الوجه تحت زيت الهالوكربون.

واختبر حجم الفتحة باستخدام وظيفة النظافة في الحقن الدقيق. ضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون على وسادة الأجاروز بنسبة 2٪. باستخدام مجهر تشريح وسلك بلاتين ناعم، التقط خنثى شاب بالغ.

اغسله في مخزن M9 لإزالة البكتيريا. انقل الديدان الخيطية إلى وسادة أغاروز، وضعها في قطرة من زيت الهالوكربون. استخدم السلك البلاتيني الناعم لمسح الدودة الخيطية بلطف حتى تصبح غير ثابتة.

ثبت الوسادة على مرحلة الحقن الدقيقة. حدد موقع ذراع تناسلية واحدة واخترقها بالإبرة. استخدم وظيفة الحقن النظيفة لتوصيل خليط الحقن بمعدل 99 رطلا لكل بوصة مربعة حتى يظهر تدفق الغدد التناسلية، مما يؤكد وصول الكواشف إلى المخل.

إذا كان ذلك متاحا، أعد وضع المرحلة وحقن الذراع التناسلية الثانية بنفس الطريقة. مباشرة بعد الحقن، أعد تعليق الحيوان المحقون في واحد إلى اثنين ميكرولتر من محلول M9 على وسادة الأغاروز. استخدم سلكا رفيعا من البلاتين لإزالة الدودة المحقونة من الوسادة، ثم اغسل الزيت باستخدام مخزن M9، واسترجعه على صفيحة NGM الاستعادة المزروعة ب Comamonas aquatica.

حضن صفيحة الاسترداد عند 25 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، عزل كل دودة P0 المحقونة على صفائح NGM فردية مزروعة ب Xenorhabdus griffiniae. تم تصميم اثنين من RNA من كريسبر لاستهداف نظير Steinernema hermaphroditum ل unc-22 في مواقع PAM منشورة سابقا.

أظهر تحليل الديدان الخيطية المعرضة للنيكوتين اختلافات واضحة في الحركة بين طفرات UNC-22 والديدان البرية. أظهر التصنيف الجيني للنسل المرتعش بواسطة PCR وجود عدة نطاقات باهتة في الموقع المستهدف لكل من Pam 3 و Pam 5. أكد التسلسل أحداث إدخال وحذف في الموقع المستهدف لUNC-22.

قام مختبري بتوسيع عملي بعد الدكتوراه في علم الوراثة المتخصص في EPN. أصبح CRISPR متوفرا الآن بثلاثة أنواع من Steinernema. في هذا البروتوكول، أسسنا تقنية فعالة لإنشاء طفرات مستقرة وقابلة للوراثة باستخدام تحرير جينات CRISPR-Cas9.

مع تعديل جين CRISPR-Cas9 المستقر، يمكننا تحليل الآليات الجزيئية وراء التعايش بين ستاينيرنيما وزينورهابدوس.