نموذج الفأر للانسداد الميكروأوعية الدموية للمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر البوليسترين الفلورية

باستخدام هذه الطريقة في حقن الميكروسفير، نهدف إلى كشف العواقب قصيرة وطويلة الأمد لسد الشعيرات الدموية لدراسة الآليات المحتملة لإزالة الانسداد في شبكة الشعيرات الدموية الدماغية. يسمح بتصوير في الوقت الحقيقي داخل الجسم الحي وتتبع الجسيمات الفلورية في شبكة الشعيرات الدموية القشرية. يمكن متابعة الميكروسفيرات والعواقب المحلية لأسابيع بعد الحقن.

تساعد دراساتنا في فهم تلف الأنسجة الموضعية الناتجة عن الانسدادات الدقيقة الوعائية. وقد تؤدي هذه النتائج إلى استراتيجيات علاجية جديدة. يمكننا الآن دراسة يوميا ولأسابيع كيف يغير انسداد الشعيرات الدموية الأوعية الدموية، وينشط الخلايا، ويغير تدفق الدم، ويضر الحاجز الدموي-الدماغي.

للبدء، اضغط على إصبع فأر مخدر للتحقق من عمق التخدير. قم بعمل شق في منتصف المسار بطول حوالي 0.5 سنتيمتر فوق القصبة الهوائية أسفل الفك السفلي باستخدام المقص الجراحي وملقط التشريح. قم بتشريح النسيج الضام السطحي على اللفافة العنقية باستخدام ملقط دقيق يربط بالخياطة لكشف عضلات اللامي العظمية الأساسية.

الآن، افصل عضلات اللامي اليمنى اليسرى واليمنى في عظم القص عن طريق تمزيق النسيج الضام بينهما بلطف. اسحب عضلة الأومو هيويد اليمنى من الذيل الجانبي باستخدام خطاف نسيج. تأكد من أن المثلث السباتي الأيمن، بما في ذلك الشريان السباتي الشائع، والشريان السباتي الداخلي، والشريان السباتي الخارجي، مرئيا بوضوح.

بعد ذلك، قم بإزالة أي لفافة متبقية وأنسجة دهنية حول الشريان السباتي الشائع. افصل بحذر الشريان السباتي المشترك عن العصب المبهم. ضع خيطين بحجم 4/0 1.5 حول الشريان السباتي المشترك وربطهما بشكل فضفاض، لضمان عدم تعرقل العقد تدفق الدم.

إزالة اللفافة والأنسجة الدهنية من الشريان السباتي الداخلي والشريان الجداري الخلفي. ثم ربط مؤقتا الشريان الجداري الخلفي وجميع الفروع الجانبية الداخلية للشريان السباتي، بما في ذلك الشريان القذالي، عن طريق ربط عقدة بخيط 4/0 1.5. إزالة اللفافة والأنسجة الدهنية من الشريان السباتي الخارجي والشريان الصدغي.

ضع عقدتين فضفاضتين حول الشريان السباتي الخارجي والشريان الصدغي باستخدام خيوط بحجم 4/0 1.5. ضع الخيط الأبعد بعيدا قدر الإمكان عن التفرع على شكل حرف Y، واستخدمه لربط الشريان السباتي الخارجي والشريان الصدغي بشكل دائم. اترك العقدة القريبة غير مربوطة.

قم بتجانس وسونيك الميكروكرات بحجم 10 ميكرومتر للحصول على تعليق موحد للجسيمات الفردية. أضف 20 ميكرولتر من الكرات الدقيقة المتجانسة إلى 140 ميكرولتر من FITC-Dextran للحصول على حجم نهائي 160 ميكرولتر من الخليط يحتوي على 1.44 مضروبا في 10 إلى قوة خمسة ميكروسفيرات. اسحب الحقنة المتصلة بالقسطرة لفترة وجيزة لإنشاء غرفة هواء.

ثم اغمر طرف القسطرة في خليط FITC-Dextran/Tween20/microsphere المحضر واسحب الحقنة ببطء حتى يصبح الخليط في القسطرة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القسطرة. ضع الحقنة مع القسطرة المحملة في مضخة الحقنة.

اضبط المضخة على 10 ميكرولتر في الدقيقة وشغل حتى تظهر قطرة صغيرة من خليط الميكروسفير عند طرف القسطرة. الآن، ضع مشبك وعاء على الشريان السباتي الداخلي وشد إحدى العقد القريبة المعدة مسبقا حول الشريان السباتي الشائع. باستخدام المقص الدقيق، قم بعمل شق قطري صغير في الشريان السباتي الخارجي على بعد حوالي 0.5 ملم من خيط الربط، لضمان أن يكون حجم الشق أصغر قليلا من قطر القسطرة.

امتصاص أي دم بقطعة قماش معقمة. ابدأ مضخة الحقنة لفترة وجيزة لتشكيل قطرة من خليط الميكروسفير عند طرف القسطرة، مما يؤكد عدم بقاء هواء في طرف القسطرة. افتح شق الشريان السباتي الخارجي وأدخل القسطرة باستخدام ملقط دقيق دقيق.

ثم ثبت القسطرة في الشريان السباتي الخارجي عن طريق شد الخيط القريب حول الشريان السباتي الخارجي. قم بضخ تدريجي بسرعة 10 ميكرولتر في الدقيقة حتى يتضخم الشريان بشكل واضح ويملأ صبغة FITC الخضراء الشريان السباتي الخارجي، مؤكدا نجاح الحقن. بعد ذلك، قم بإزالة مشبك الوعاء من الشريان السباتي الداخلي.

ثم زد معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 20 ميكرولتر في الدقيقة. تأكيد نجاح حقنة الميكروسفير من خلال التأكد من أن الشريان السباتي الداخلي البعيد عن انقسام الشريان الجداري الخلفي مملوء بصبغة FITC. بمجرد نجاح الحقن، قم بإزالة الخيط الذي ربط الشريان السباتي المشترك لتمكين خليط الميكروسفير من التدفق إلى الشريان السباتي الداخلي.

أثناء الحقن، لا يزال بالإمكان ملاحظة صبغة FITC في الشريان السباتي الخارجي. أغلق مضخة الحقنة بمجرد أن يصل الخليط في القسطرة إلى علامة 80 ميكرولتر لإيقاف الحقن. ثم ربط الشريان السباتي الشائع، وقص الشريان السباتي الداخلي، وإزالة القسطرة برفق، مع إبقاء الخيط المثبت في مكانه.

ربط الشريان السباتي الخارجي بشكل دائم عن طريق شد الخيط الذي ثبت القسطرة. قم بإزالة المشبك والخيوط حول الشريان السباتي الشائع، والشريان السباتي الداخلي، والشريان الجداري الخلفي لاستعادة تدفق الدم. تم تأكيد نجاح جراحة الانسداد الوعائي الدقيق من خلال تصوير ميداني كامل الجسم والدماغ بعد أربعة أيام من الجراحة.

أظهرت شريحة سهمية في الدماغ وجود كرات دقيقة داخل الدماغ. أظهرت أدمغة الفئران المستخرجة التي تم تصويرها بعد يوم من الجراحة أن الميكروسفيرات كانت في الغالب محتجزة في نصف الكرة النفسي المقابل ضمن منطقة تدفق الشرايين الدماغية الوسطى والأمامية. زاد عدد الميكروسفير في شرائح الدماغ بشكل ملحوظ عندما أضيف Tween20 إلى خليط الميكروسفير.

فقدت الفئران وزنا أقل وتعافت أسرع بعد الجراحة عند حقنها بخليط ميكروسفير يحتوي على Tween20. أظهرت صور المجهر الفلوري لقشرة الدماغ التي التقطت بعد 0.5 ساعة من الجراحة نقاطا بيضاء فردية تمثل الكرات المجهرية التي تسد الشعيرات الدموية. أظهرت صور الإسقاط المكونة من مكدس z-stack بفوتونين وجود ميكروكرات تسبب انسدامات دقيقة وعية دماغية مع ضعف في التروية.

تسبب الانسمالات أيضا اضطرابا في الحاجز الدموي الدماغي مع تسرب الصبغة الظاهرة من الأوعية.