سير العمل الموحد ل SDS-PAGE لتحديد بروتين كورونا المخصص في الكشف المبكر عن السرطان

ندرس كيف تتفاعل الجسيمات النانوية مع الدم لكشف علامات السرطان المبكرة، بهدف اختبار تشخيصي بسيط قابل للتكرار وغير جراحي في الغالب. للبدء، قم بتخفيف محلول أربعة ملليغرامات لكل ملليلتر من صفائح أكسيد الجرافين النانوية في ماء فائق النقاء إلى التركيز المطلوب. قم بتنشيط المحلول المخفف لمدة دقيقتين عند سعة 28٪ مع إعداد نبضي لمدة ثماني ثوان تشغيلا وست ثوان مطفأة لضمان التشتت الموحد.

قم بقياس تركيز المحلول المبعثر باستخدام التحليل الطيفي المرئي بالأشعة فوق البنفسجية. ثم يقيس الحجم الهيدروديناميكي وجهد زيتا للمحلول باستخدام تشتت الضوء الديناميكي باستخدام ليزر نيون هيليوم بقطر 633 نانومتر. قم بتخفيف العينة في مياه فائقة النقاء وفقا لحدود كشف QVet.

بعد ذلك، تخفيف البلازما البشرية التجارية المزيفة بالليوفيليا بالماء فائق النقي حسب الحاجة. قم بالطرد المركزي بالبلازما المعاد تجميعها عند 18 و620 جرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة وخزنها عند ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

الآن، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينشونيك لضبط تخفيف البلازما وتحديد النسبة المثلى بين الجسيمات النانوية والبلازما. اخلط الحجم المختار من الجسيمات النانوية مع البلازما لتحقيق النسبة المستهدفة بين الاثنين. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة.

لعزل بروتين الهالة، قم بعمل طرد مركزي لعينات بلازما الجسيمات النانوية عند حرارة 18,620 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل الحبيبات الناتجة ب 200 ميكرولتر من الماء فائق النقي. ثم أعد تعليقها وأعد الطرد المركزي.

بعد الغسل النهائي، تأكد وجود حبيبة مضغوطة كدليل على عزل معقد بروتين الجسيمات الننوية. بعد ذلك، اخلط عامل الاختزال ومخزن التحميل والماء للوصول إلى حجم مخزن التحميل المحسوب. أعد تعليق الرصاصة في مخزن التحميل المعد.

ثم اغلي التعليق على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للعينة المسلوقة عند حرارة 18 و620 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. اجمع الفائق في أنبوب جديد.

الآن، جهز سلم البروتين عن طريق تخفيف معيار الوزن الجزيئي في المخزن غير المصبوغ باستخدام المخزن المصبوغ. قم بتخفيف 10 مرات من محلول Tris-Glycine-SDS بتركيز واحد فقط. قم بتجميع غرفة الرحلان الكهربائي باستخدام جل خال من البقع من أربعة إلى 20٪.

ثم أضع المخزن الكهربائي حتى يصل إلى المستوى الموصى به من قبل الشركة المصنعة. حمل 10 ميكرولتر من العينة في كل بئر. ثم قم بوضع الماصة سبعة ميكرولتر من السلم في كل بئر.

شغل الجل على 150 فولت لمدة تقارب 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين صورة الجل كملف tiff في نفس المجلد الذي توجد فيه السكريبتات (scripts). ثم افتح معالجة الجل.

أنا في MATLAB. أدخل اسم صورة الجل كاسم للصورة. ثم أدخل مؤشر أحد مسارات السلم كعلامة مؤشرة.

شغل النص. سيتم تحديد إكمال الخطوات في نافذة الأوامر وستظهر أربع نوافذ على الشاشة. الآن، افتح الشكل الأول مع صورة الجل الأصلية في الأعلى وتصحيحها لتأثير المسار المائل في الأسفل.

عدل قيم التصحيح الأيسر والتصحيح الأيمن لضبط معلمات التصحيح. افتح الشكل الثاني. يحتوي على الصورة المصححة لتأثير المسار المائل في الأعلى والصورة التي أزيلت الخلفية في الأسفل.

قم بضبط قيمة BKG par X في النص لضبط إزالة الخلفية. لاحظ أن جميع المسارات المحددة محددة كخطوط بيضاء عمودية في الشكل الثاني. الآن، افتح الشكل الثالث الذي يحتوي على ملف شدة مسار العلامة مع القمم المكتشفة على اليسار وتوافق غير خطي بقيمة R مربعة على اليمين.

تحقق مرتين من أن عدد النطاقات المتوقعة في مسار السلم يطابق عدد القمم المكتشفة المستخدمة في إجراء التركيب. ثم افتح الشكل الرابع الذي يحتوي على ملفات شدة التعديل لجميع المسارات المكتشفة في الجلام. قم بتعيين معامل التصدير إلى واحد لتصدير ملفات الشدة كدوال لأوزان جزيئية في ملف إكسل.

شغل النص. بعد الانتهاء، سيتم إنشاء ورقة Excel في مجلد العمل تحتوي على الملفات المطلقة والموضوعة كدوال للوزن الجزيئي في العمود الأول. ثم افتح ملف ملفات الجل pro m وشغل السكريبت.

تظهر أربع نوافذ على الشاشة. افتح الشكل الخامس الذي يحتوي على ملفات الشدة المطلقة في الأعلى والكثافات الكلية المقابلة في الأسفل لكل مسار. والشكل السادس يحتوي على ملفات الشدة الموحدة لكل مسار.

مع تقسيم محور الوزن الجزيئي وفقا للنطاقات المحددة كreg في النص. قم بتعيين بيانات التصدير على واحد لتصدير المناطق التكاملية المطلقة والمناطق الموحدة المعادية. شغل النص.

بعد الانتهاء، سيتم إنشاء جدول بيانات في مجلد العمل يحتوي على المناطق المطلقة والتطبيعة المصدرة ضمن نطاقات الوزن الجزيئي المحددة. وأخيرا، افتح الشكل سبعة وثمانية. تحتوي على مخطط مدرج للمناطق المطلقة والموحدة لكل مسار، مجمعة حسب المسار والمنطقة على التوالي.

يضع البروتوكول المعروض هنا سير عمل موحد وقابل للتكرار لعزل وتوصيف الهالة البروتينية المكونة على الجسيمات النانوية بعد الحضانة مع البلازما. تنتج هذه الطريقة ملفات تعريف صفحات SDS متسقة للغاية قادرة على التقاط ميزات ذات معنى بيولوجي وذات صلة تشخيصية لكل إكليلة شخصية. كانت ملفات تعريف صفحات SDS التي تم الحصول عليها عبر جميع الحالات قابلة للتكرار بشكل كبير.

أدى ارتفاع تركيزات البلازما من 5٪ إلى 50٪ إلى زيادة شدة الإشارة في منطقة 30 إلى 80 كيلودالتون من ملفات تعريف صفحات SDS. أدى سير عمل التوصيل الآلي إلى إنتاج ملفات كهروضوئية متطابقة تقريبا. أكسيد الجرافين ينتج باستمرار ملفات هالة مستقرة بدقة عالية، تعزى إلى مساحته السطحية العالية وخصائصه المشحونة.

كانت توزيعات حجم عينات أكسيد الجرافين الصغيرة والمتوسطة والكبيرة ضيقة، غير متداخلة، ومركزة حول 100 و300 و750 نانومتر على التوالي. كانت ملفات صفحات SDS للبروتينات التي تتكون على أكسيد الجرافين متشابهة في جميع الأحجام. بينما لوحظت فروق واضحة بين التخفيفات المختلفة، أنتجت تركيزات البلازما المنخفضة أحزمة أكثر كثافة في نطاقات وزن جزيئي محددة تشير إلى إثراء بروتيني انتقائي.

عند تخفيف البلازما المتوسطة، كشفت ملفات قياس الكثافة عن اختلافات محددة للمرض، خاصة في منطقة 20 إلى 30 كيلودالتون حيث أظهرت عينات PDAC انخفاضا في شدة الإشارة. نموذج التنميط القائم على صفحات SDS وحده حدد بشكل صحيح كل من عينات PDAC وعينات التحكم بدقة 83٪ وتوازن الحساسية والنوعية. النموذج التشخيصي المدمج الذي يدمج ملفات تعريف كورونا في صفحات SDS ومستويات CA من 19 إلى 9 مستويات يحقق أعلى دقة وحساسية وخصوصية في تصنيف مرضى PDAC.

نستخدم سير عمل آلي، وتقنيات غير تقنية، وأدوات مدفوعة الذكاء الاصطناعي لتعزيز أبحاث تشخيص السرطان. بروتوكولنا سريع وسهل الاستخدام ومتوافق مع منظمة الصحة العالمية، مما يضمن وجود بصمات بروتينية قابلة للتكرار موحدة ذات أهمية تشخيصية قوية.