الأميلويد وهندسة البيتا المتقاطعة

تستخدم أبحاثنا حيود ألياف الأشعة السينية لدراسة بنية ألياف الأميلويد العابرة بيتا وتنظيمها الجزيئي. يستخدم هذا البروتوكول حيود ألياف الأشعة السينية لتأكيد أنماط البيتا المشتركة وتوضيح بنى الألياف. يتيح هذا البروتوكول التحليل البنيوي لألياف الأميلويد بدءا من تأكيد تنظيم البيتا المتقاطعة إلى توضيح تفاصيل جزيئية إضافية.

للبدء، قم بمحاذاة ألياف البروتين أو الببتيد لإنتاج حزمة تكون محاور الألياف فيها كلها متوازية بشكل مثالي. اذيب شمع الشموع باستخدام صفيحة ساخنة حتى يتحول إلى سائل. باستخدام قاطع زجاج، قم بقص الشعيرات الدموية الزجاجية البوروسيليكاتية بقطر 1 ملم بطول حوالي 2-3 سنتيمترات.

اغمس الشعيرات الدموية المقطوعة لفترة وجيزة في الشمع السائل. ثم ارفع شمع الشمعة بواسطة الحركة الشعرية إلى حوالي 1-2 مليمتر داخل الشعيرات الدموية. الآن استخدم البلاستيسين لتثبيت الشعيرات الدموية المغلقة أفقيا داخل طبق بتري.

حافظ على فجوة بين 0.5-2 مليمتر بين أطراف الشعيرات الدموية المملوءة بالشمع. باستخدام ماصة، علق بعناية قطرة 10 ميكرولتر من محلول الألياف بين طرفي الشمعين المملوءين بالشمع. غط طبق البترى لحماية العينة من الغبار واتركه يتبخر طوال الليل.

ثم أغلق اللوح ليساعد في الحفاظ على بيئة تجفيف محكمة. لمحاذاة ألياف الأميلويد في شعيرات زجاجية، ثبت حقنة بسعة 1 ملليلتر مع أنبوب مطاطي في الطرف العريض من شعيرات زجاجية سيليكون قطرها 0.7 ملم. استنشق 2-3 سنتيمترات من تعليق الألياف إلى الشعيرات الدموية.

أغلق أحد طرفي الشعيرات الدموية باستخدام الشمع المذاب واترك الطرف الآخر مفتوحا للسماح بالتبخر. رتب الشعيرات الدموية عموديا ودعها تجف حتى يتكون قرص جف. لمحاذاة الألياف كحصيرة أو طبقة رقيقة، ضع عينة ألياف عالية التركيز على شريحة زجاجية وغطيها قبل أن تجف بالهواء لمدة 24 ساعة.

قم بتثبيت حزمة الألياف بعناية على رأس جهاز قياس الغونيومتر وتوجيهه بحيث يمر شعاع الأشعة السينية عبر الحزمة. إذا استخدمت عينة من حصيرة ليافية، قم بتوجيهها بحيث يمر شعاع الأشعة السينية عبر حافة الحصيرة. افحص العينة تحت مجهر خفيف مزود بمستقطب متقاطع لملاحظة الانكسار الثنائي.

وضع العينة في شعاع الأشعة السينية بناء على ما إذا كانت حزمة ألياف أو حصيرة أو قرص. اجمع نمط حيود باستخدام معدات الأشعة السينية الداخلية أو إشعاع السينكروترون. لإجراء تحليل البيانات، قم بتحميل الملف إلى برنامج تحليل أنماط الحيود CLEARER.

انتقل إلى إعداد نمط الحيود والحيود لإعدادات الحيود المدخلة، بما في ذلك حجم البكسل، مصدر الأشعة السينية، ومسافة العينة إلى الكاشف. انقر على معالجة الصورة والدوران لتدوير صورة الحيود بحيث يكون خط الزوال عموديا. استخدم وحدة التمركز بالانتقال إلى نمط الحيود والنقر على صورة المركز لمركزها.

حدد محوري خط الزوال وخط الاستواء. احفظ الصورة المتمركزة للتحليل لاحقا. بعد ذلك، حدد زاوية مناسبة على طول خط الزوال وخط الاستواء.

انقر على نمط الحيود ثم وحدة المتوسط شعاعيا لإنشاء رسم بياني لموقع إشارة الحيود. مقابل الشدة. انتقل إلى وحدة البحث عن القمة من قائمة نمط الحيود لقياس وإخراج إشارة الحيود تلقائيا.

قم بضبط عرض البحث الأقصى لاكتشاف الإشارات الحقيقية بدون ضوضاء. استخدم خيار التكبير والقياس للتحقق من موضع إشارة الحيود باستخدام تحديد الذروة. استكشف أبعاد خلايا الوحدة المحتملة باستخدام وحدة تحسين الخلية.

إدخال التقديرات الأولية بناء على إشارات استوائية قوية وتحديد المؤشرات الدنيا والقصوى للبحث الخلوي. احسب أبعاد الخلية الوحدة الكامنة وقارن مواقع إشارات الحيود المتوقعة مع الانعكاسات المرصودة. اختر الخلية الوحدة التي تناسب البيانات والعينة بشكل أفضل.

لبناء نماذج جزيئية، قم ببناء ترتيبات ثلاثية الأبعاد للببتيدات في تكوين بيتا يتناسب مع الخلية الوحدوية المحددة. تأكد من تضمين جميع المكونات المتعلقة بالتناظر (symmetry). بعد ذلك، انقر على محاكاة الحيود متبوعا على مولد الهياكل وسلسلة الهيكل وتحميل نموذج PDB.

قم بتعيين محور الألياف ومحور الشعاع، وأبعاد وحدة الإدخال الخلية، ثم تحقق من وجود تعارضات خارجية. انتقل إلى محاكاة الحيود وانقر على محاكاة حيود الألياف لتحميل إحداثيات PDB إلى وحدة محاكاة حيود الألياف. أدخل اتجاه محور الألياف، اتجاه الحزمة، أبعاد الخلية الوحدة، مصدر الأشعة السينية وإعدادات الكاشف، ثم اضغط على محاكاة لتشغيل المحاكاة.

تأكد من أن محور الشعاع عمودي على محور الألياف. ثم انتقل إلى الملف وانقر على حفظ الوضع لحفظ إعدادات المحاكاة كملفات HTML للتحرير لاحقا. احفظ نمط الحيود المحاكى بصيغة RAW أو كملف TIFF.

قارن النمط المحاكى مع نمط الحيود التجريبي. قياس إشارات الحيود المحاكاة باستخدام نفس سير عمل التحليل. سجل وقارن هذه القيم مع البيانات التجريبية.

أظهرت الميكروغرامات الإلكترونية كثافة عالية من ألياف الأميلويد على الشبكة مناسبة لتحضير عينة ألياف الأشعة السينية. أنتجت الألياف المحاذية مع إطار التمدد نمط حيود مميز عبر بيتا مع انعكاس خط الزوال عند 4.76 أنغستروم، وانعكاسات استوائية ناتجة عن طول السلسلة، وتباعد الصفائح، وحجم الخيوط الأولية. أظهر نمط حيود بيتا عبر بيتا مثالي أن الانعكاسات الطولية وخط الاستواء تتوافق مع تباعدات متكررة على طول محاور الألياف.

كان نمط الحيود المتمركز جيدا متماثلا مع تداخل القمم الاستوائية وخط الزوال في مواقعها. تم اكتشاف قمم الحيود تلقائيا وإدراجها باستخدام تحليل إيجاد القمم. تم استخدام قمم الحيود المكتشفة لتحديد أبعاد خلايا وحدة معقولة.

تم إعداد نموذج هيكلي باستخدام الخلية الوحدة المحددة وتم تصوره قبل محاكاة الحيود. أظهرت بيانات الحيود المحاكاة الناتجة عن النموذج البنيوي المقترح توافقا معقولا مع نمط الحيود التجريبي في كل من مواقع الانعكاس والشدات النسبية. أظهرت أنماط الحيود المحاكاة والتجريبية المتراكبة أكثر محاذاة الانعكاسات المقابلة.

محاذاة العينات بشكل صحيح أمر حاسم لأنها تحدد جودة بيانات الحيود والمعلومات التي يمكن الحصول عليها منها. يتيح هذا العمل نمذجة البنيوية بدقة الذرة والتكامل مع تقنيات هيكلية أخرى، مثل AFM، لتمكين البنى الجزيئية التفصيلية.