خط أنابيب حسابي لقياس كمية الحمض النووي الريبي المحسن بين الجينات / داخل الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران

يبحث فريقنا في علم التخلق الوراثي المعزز وعلم الكتابة الروحية، مع التركيز على تطوير طريقة دقيقة لقياس الحمض النووي الريبي المعزز كمؤشرات على تنشيط المعزز. نظرا لأن المعززات داخل الوراثة كانت مع نسخ المضيف، فإن تمييز إشارات DER المعززة وقياسها بدقة يمثل تحديا. للبدء، افتح الطرفية واكتب الأمر لتحضير الملفات والمراجع اللازمة لتحديد المعزز.

اكتب الأمر في الطرفية للدخول إلى الدليل العامل. ثم شغل الأمر الذي ينسخ سكريبتات تحديد المعزز إلى الدليل الحالي. ثم شغل الأمر المقابل لتوليد ملفات BED لمناطق المحفز، وأجسام الجينات، والجينات المشفرة للبروتينات باستخدام تعليقات الشيفرة العامة.

إعداد ملفات ATAC-seq وملفات Histone ChIP-seq للتعرف على المعزز. أدخل أمر المعالجة المسبقة المناسب في الطرفية. بعد ذلك، قم بتشغيل الأمر لتعريف وتصنيف المعززات باستخدام بيانات ذروة الكروماتين.

اكتب الأمر لتعيين معلومات السلسلة المؤقتة إلى ملف BED المحسن بين الجينات. بعد ذلك، أدخل الأمر لتحديد الاتجاه الصحيح للسلسلة للمحسنات بين الجينات التي تتداخل مع الجينات الموجودة على كلا الخيطين. بعد ذلك، احسب RPKM الخاص بالخيط للجينات التي تتداخل مع المعززات على نفس السلسلة.

ثم أدخل الأمر لإنهاء تعيين السلاسل للمحسنات بين الجينات. خصص معلومات الخيط النهائية لجميع المعززات بين الجينات ومناطق القمة المقابلة لها. اكتب الأمر في الطرفية للانتقال إلى مجلد جذر خط الأنابيب.

ثم استخدم الأمر المناسب لنسخ السكربت لتحضير التحليل اللاحق. باستخدام الأمر المناسب، جهز جميع الملفات اللازمة لتجميع المعزز، ومعالجة الإشارات GRO-seq، وقياس كمية الحمض النووي الريبي المعزز. بعد ذلك، اكتب السكربت لدخول الدليل العامل ثم انسخ السكربتات اللازمة للتحليل اللاحق. لإنشاء مخططات تجميع، تظهر أنماط إشارات الكروماتين حول كل نوع من قمم المعزز.

اكتب الأمر المقابل في الطرفية. بمجرد عودة الطلب، أدخل الأمر لقياس مستويات تعبيرات RNA المحسن من GRO-seq باستخدام عدد الميزات. وأخيرا، شغل السكربت لعرض ومقارنة مستويات تعبير الحمض النووي الريبي المحسن عبر مجموعات المعززات باستخدام R.In مجموعة بيانات GRO-seq.

كانت ذيول البولينوكليوتيدات موجودة قبل التقليم وتمت إزالتها بنجاح بعد تطبيق معلمات التقليم، وتم اكتشاف مجموعات بيانات محولات NextEra في كلا الزوجين الحمراوين قبل التقليم، وتمت إزالتها بعد المعالجة المسبقة أظهرت مجموعات بيانات ChIP-seq للأسيتلة في H3K27 تلوثا طفيفا في المحولات يتطلب فقط التقليم الافتراضي. أسفر ترشيح بيانات ATAC-seq عن 71,165 منطقة كروماتين مفتوح غير حركية، شملت 47,317 منطقة معزز، منها 23,147 كمعززات نشطة و24,170 كمعززات غير نشطة بناء على التداخل مع علامات الهيستون، ومن بين جميع مناطق المعززات كانت بين الجينات و54.8٪ كانت داخل الجين. كان هذا التوزيع مشابها عبر فئات المعززات غير النشطة والنشطة.

أظهر محسن بين الجينات في أعلى المسار لجين NENO إثراء قوي لإشارات ATAC-seq، ومثيلة H3K4 الأحادية، وأسيتلة H3K27، وإشارات GRO-seq. أظهر محسن داخل الوراثة بالقرب من جين CHD2 خصائص كروماتين ونسخ مشابهة لمحسن NENOG مع إشارات واضحة في جميع مجموعات البيانات الأربع. أظهرت مخططات التجميع أن المعززات النشطة كانت لديها تخصيب منسق لإشارات ATAC-seq، وH3K4 أحادي الميثيل، وH3K27.

بينما كانت المعززات غير النشطة تفتقر إلى إثراء الأسيتلة H3K27، لكنها احتفظت بإشارات قوية من ATAC-seq وH3K4 أحادي الميثيل. أظهرت المعززات النشطة نسخا أعلى بشكل ملحوظ مشتق من GRO-seq مقارنة بالمعززات غير النشطة في كل من المناطق بين الجينات والمناطق الوجينية. نجمع تلك خطوط المعالجة الحسابية الوراثية الواعية للاتجاهات التي تم التحقق منها بواسطة النسخ المعتمد على النشاط في سياق بين الجينات أو داخل الجينات.

نتعامل مع DER لقياس eRNA الموحد والمتاح، خاصة للمحسنات داخل الجينات التي تتخللها جينوم المضيف. سنقوم بمراجعة التعريف الذاتي المدفوع، وفصل نصوص التشغيل عن كل من الاتجاهات، وخط أنابيب تحليل المعيار عبر تجمعات الجينوم، والبروتوكولات التجريبية، وأنواع الخلايا.