الاختبار الصناعي إعادة تشكيل اليوبيكويتينية البكتيرية والقضاء بوساطة VCP/p97

يكشف عملنا كيف يعمل VCP أو p97 كمدافع سيتوزولي ضد عدة مسببات أمراض مختلفة. هذا يفتح إمكانيات VCP أو p97 للتطبيقات العلاجية واستراتيجيات الهندسة الحيوية. بالإضافة إلى الكيمياء الحيوية الروتينية، تستخدم المجهر فائق الدقة، والتجميد الكهرومغناطيسي، وET التجميد لمعرفة كيف تنظم هذه المؤثرات المضيفة على الممرض لتدميرها.

للبدء، زراعة التهاب المكورات العقدية هو النمط المصلي الثاني من ستة سلالات خلال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في وسط خميرة تود هيويت. قم بتلقيح جزء من الثقافة الليلية في 10 أجزاء من وسط خميرة تود هيويت الطازج، وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.4. ثم اخلط 900 ميكرولتر من مزرعة التهاب الرئة العقدي مع 600 ميكرولتر من 50٪ جليسرول وتخزين مخزون الجليسرول عند ناقص 80 درجة مئوية.

ثم قم بإذابة مخزون جديد من التهاب المكورات العقدية الرئوي من ناقص 80 درجة مئوية وتلقحه بالكامل في خمسة ملليلتر من وسط خميرة تود هيويت. خذ حوالي 10 إلى قوة سبع خلايا التهاب رئوي عقدي. لغسل الخلايا جيدا، أعد تعليق البكتيريا في مخزن التفاعل والطرد المركزي عند 21,000 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أعد تعليق الحبيبة باستخدام ليزات خلية الثدييات 549. ثم أضف اليوبيكوتين المنقى وأدينوزين ثلاثي الفوسفات بميلي مولر واحد وحضن الخليط لمدة ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 27 درجة مئوية. ثم غسل البكتيريا مرة واحدة باستخدام محلول التفاعل الذي يحتوي على يوريا مولية واحدة، ثم غسلتين إضافيتين باستخدام حاجز التفاعل فقط.

أصلح البكتيريا ب 1٪ بارافورمالديهايد. بعد التثبيت، حضن الخلايا ب PBS الذي يحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر جلايسين لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل مرتين باستخدام PBS.

تحضير خليط تفاعل عن طريق دمج اليوبيكوتين مع المكونات المطلوبة الأخرى في مخزن التفاعل. اضبط الحجم الكلي لخليط التفاعل إلى 100 إلى 150 ميكرولتر. أعد تعليق البكتيريا في خليط التفاعل الذي يحتوي على إنزيم اليوبيكوتين، وحضن التعليق لمدة ساعتين عند 27 درجة مئوية.

بعد غسل البكتيريا ثلاث مرات باستخدام محلول التفاعل الذي يحتوي على اليوريا، قم بتثبيتها ب 1٪ بارافورمالديهايد. بعد التثبيت، حضن الخلايا ب PBS الذي يحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر جلايسين لمدة 15 دقيقة. ثم حضن العينة في 3٪ BSA لمدة ساعة عند 27 درجة مئوية، واغسلها مرتين باستخدام PBS.

أعد تعليق البكتيريا الشاملة في محلول أجسام مضادة أولية، يتم تحضيره بتركيزات أعلى من المستخدمة عادة في اختبارات التألق المناعي. ثم حضن لمدة ساعة عند 27 درجة مئوية. بعد غسل البكتيريا مرتين باستخدام PBS، أعد تعليقها في الجسم المضاد الثانوي المقابل المصاحب مع أليكسا فلور 488 وأليكسا فلور 555.

الآن صب حوالي 10 إلى 20 ميكرولتر من العينة البكتيرية الموسومة على شريحة زجاجية وامزج بين خمسة إلى عشرة ميكرولتر من وسط التثبيت مع أو بدون DAPI. ضع غطاء فوق العينة واستخدم ورق المناديل لمسح أي سائل زائد. اجمع بين ستة ميكرومولر VCP p97 مع NPLOC4 ميكرومولر واحد وUFD-1 ميكرومولر واحد.

اضبط حجم خليط التفاعل إلى حوالي 90 ميكرولتر باستخدام مخزن التفاعل، واحتضن على الثلج لمدة ساعتين. بعد ذلك، أضف من واحد إلى اثنين أدينوسين ثلاثي الفوسفات إلى خليط التفاعل الذي يحتوي على p97 UFD-1، NPLOC4. ثم اجمع هذا مع 10 إلى قوة سبع خلايا محصنة في المكورات العقدية المجمعة في كل مكان واحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

مباشرة بعد العلاج، خذ 10 ميكرولتر من خليط التفاعل وقم بتخفيف متسلسل. ضع 10 إلى 20 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح تسريب القلب في الدماغ. قيم وحدات تشكيل المستعمرة بين نقاط الصفر والساعتين.

احسب نسبة قابلية البكتيريا عن طريق قسمة عدد الوحدات المعتمدة لمدة ساعتين على عدد الوحدات المعتمدة للساعات الصفرية وضربها في 100. لوحظ وجود كبير في كل مكان لالتهاب المكورات الرئوية عند العلاج إما بتحليل الخلايا الثديية أو بنظام إنزيم معاد تشكيله من E-1، E-2، E-3. كانت إشارة اليوبيكوتينيشن غائبة في المركز وتراجعت بشكل ملحوظ عندما تعرض المكورات الرئوية العقدية اليوبيكويتينية ل OTUB1، مما أكد تعديل البولي يوبيكويتين المرتبط ب K48.

أظهر تحليل ملف الخط تداخلا كاملا بين إشارات اليوبيكوتين والبكتيريا، مما يؤكد توازنهما المكاني. أكدت إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التداخل المكاني بين إشارات اليوبيكوتين والمكورات الرئوية العقدية. عند دمجه من النوع البري p97 مع عوامله المرافقة، UFD1 وNPLOC4، قلل من قدرة البكتيريا على البقاء إلى 10 إلى 20٪ بعد ساعتين، بغض النظر عما إذا كان يتم اليوبيكوتينيشن باستخدام محلل الخلايا أو بنظام إنزيم منقي.

لم يلاحظ أي انخفاض في فعالية البكتيريا عند حذف اليوبيكوتين، أو عند تعطيل p97 حراريا، أو عند استخدام الطفرة p97 غير النشطة حفازيا، E57 8Q، مما يؤكد أن كل من اليوبيكوتينيشن وp97 النشط ضروريان لقتل البكتيريا. تفتح دراستنا الباب حول كيفية تعديل ليغازات اليوبيكوتين E3 للمضيف المختلفة ودراسة آليات التأثير لإزالة التهديدات المعدية. نهدف بعد ذلك إلى استكشاف كيفية تنظيم p97 أو VCP، وزيادة هندسته لزيادة نشاطه المضاد للبكتيريا.