إجراء أخذ عينات الفينول المعتمد على الخيط الأحمر لعلاج الدهون غير المستهدفة لسائل الدموع في اكتشاف المؤشرات الحيوية

أنشأنا طريقة أكثر توحيدا وسهلة الاستخدام تعتمد على خيوط الفينول الحمراء للمساعدة في تحقيق ملفات دهنية للدموع القابلة للتكرار لاكتشاف مؤشرات التمزق في المستقبل. التحدي الحالي هو أن شرائط شيرمر تسبب تهيج بينما تظهر الشعيرات الدموية تفاوتات في عملية جمع الدموع. وهذا يعيق قابلية الإبلاغ التجريبي والمقارنات بين الدراسات.

للبدء، ارتد قفازات وقم بتعقيم محطة العمل جيدا لمنع أي تلوث للعينة. أمسك الخيط الأحمر الفينولي من الطرف المقابل للخطاف المنحني، مع التأكد من عدم لمس منطقة الخطاف المنحني. اطلب من الشخص أن يوجه نظره نحو اتجاه الأنف العلوي.

ثم اسحب الجفن السفلي للشخص برفق، وأدخل الخيط الأحمر الفينولي مع الخطاف المثني الموضوع في الملتحمة الصدغية السفلية بالقرب من الزاوية الخارجية للعين. الآن، اطلب من المشارك إغلاق عينيه بلطف وإمالة رأسه قليلا للأمام لمنع الخيط الأحمر الفينولي من ملامسة الجلد على الوجه. اسحب الجفن السفلي للشخص مرة أخرى، وأزل الخيط الأحمر الفينولي برفق، متجنبا ملامسة المنطقة المأخوذة.

سجل طول المنطقة الحمراء المأخوذة من العينة. وباستخدام ملقط معقم، انقل جهاز PRT إلى أنبوب عينة جديد. الآن ضع ملصقات وغطاء أنبوب العينة بشكل صحيح.

إذا كان طول العينة أقل من 50 مليمتر، اطلب من المصاب أن يستريح لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق ثم يكرر جمع سائل الدموع باستخدام نفس العين. ضع كل PRT تم أخذ عينات جديدة في أنبوب عينة منفصل. باستخدام الميثانول ومناديل ورقية نظيفة، نظف القفازات والملاقط جيدا لإزالة أي بقايا تمزق أو ملوثات.

ثم دعها تجف تماما في الهواء. أغلق جميع أنابيب العينات ببارافيلم وخزنها فورا عند ناقص 20 درجة مئوية للتخزين المؤقت أو ناقص 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. اغسل المقص الدقيق والمقطط بالميثانول مسبقا قبل معالجة الخيوط الحمراء الفينولية.

اقطع نهاية الخطاف المنحني تقريبا أول ثلاثة مليمترات من كل خيط فينولي أحمر. اقطع المنطقة المأخوذة حتى مقدمة صبغة الفينول الحمراء إلى قطعتين مليمترات واجمع هذه الأجزاء باستخدام أنبوب طرد مركزي عضوي نظيف يتحمل المذيبات بسعة 1.5 ملليتر. تخلص من نهاية الخطاف المنحنية والمنطقة غير المرغوب فيها من PRT.

ضع العينات على الثلج للحفاظ على درجة حرارة منخفضة قبل الاستخلاص. الآن، أضف 232 ميكرولتر من الميثانول البارد جدا في مطياف الكتلة إلى كل عينة ودوامة لمدة 15 ثانية للخلط جيدا. قم بعمل العينات في منظف فوق صوتي مبرد مسبقا لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف 774 ميكرولتر من ميثيل تيرت-بيوتيل إيثر عالي الكثافة و194 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل عينة. استخدم دوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية لخلط المذيبات جيدا. قم بتحويل العينات مرة أخرى إلى جهاز تنظيف فوق صوتي مبرد مسبقا لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد التصويب، حضن العينات في جهاز ThermoMixer مضبوطا على أربع درجات مئوية مع هز 1,200 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات. ثم اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة دون إزعاج لمدة 10 دقائق. قم بطرد المركزي بالخليطات على حرارة 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي، تأكد من أن الخلطات منفصلة بشكل واضح إلى مرحلتين سائلتين مميزتين. اجمع بعناية 700 ميكرولتر من الطور العضوي العلوي الذي يحتوي على الدهون وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مبرد مسبقا بسعة 1.5 ملليتر. تخلص من الطور المائي السفلي، الذي يحتوي على بقايا ميثيل تيرت-بيوتيل إيثر والميثانول كنفايات كيميائية خطرة.

جفف مستخلصات الدهون باستخدام مكثف SpeedVac مبرد على أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات. ثم خزن مستخلصات الدهون المجففة عند ناقص 20 درجة مئوية للتخزين قصير الأمد أو ناقص 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. تحضير خليط مذيب الميثانول-الكلوروفورم عن طريق خلط الميثانول مع الكلوروفورم بنسبة حجم واحد إلى واحد.

إعادة تشكيل مستخلصات الدهون المجففة باستخدام 50 ميكرولتر من خليط مذيب الميثانول-الكلوروفورم البارد المثلج. قم بتصويت المحلول المعاد تشكيله في منظف فوق صوتي مبرد مسبقا لمدة 15 دقيقة. الآن، قم بطرد مركزي على مستخلصات الدهون المعاد تشكيلها عند 14,000 جرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

انقل بعناية 40 ميكرولتر من المادة الناتجة إلى قارورة زجاجية لأخذ عينات تلقائية مزودة بإدخال زجاجي. أغلق القارورة بإحكام بغطاء علوي مفتوح غير شق لتحضيرها لتحليل تحليل الطيف الكتلي التاثلية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة. باستخدام معايير صارمة، تم تحديد 773، 890، و1,025 نوعا فريدا من الدهون في مجموعات عينة مكررة واحدة، واثنتين، وثلاث مجموعات عينة مكررة على التوالي.

حدد نمط الأيونات الإيجابية 1,302 نوع من الدهون بتصنيفات 26٪ من الدرجة A، و13.2٪ من الدرجة B، و60.8٪ من الدرجة C. حدد نمط الأيونات السلبية 257 نوعا من الدهون بحوالي 8.2٪ من الدرجة A، و22.9٪ من الدرجة B، و68.9٪ من الدرجة C. على الرغم من الاختلافات المتعلقة بالتخزين، تم تحديد 394 نوعا فريدا من الدهون بشكل متسق عبر جميع مجموعات العينات الثلاث.

كان معامل التغير بين المشاركين خلال ثلاث زيارات هو 21.5٪ في الوضع الإيجابي و31.3٪ في الوضع السلبي. يعالج هذا البروتوكول غياب سير عمل موحد لتحليل الدهون التمزقية القابل للتكرار، ويمكن أن يعزز قابلية المقارنة بين الدراسات. طريقتنا المعتمدة على PRT تقلل من التهيج وتمكن من جمع التمزقات بسرعة وتقلل من تباين المشغلين.

ستقوم أبحاثنا المستقبلية بالتحقق من صحة مؤشرات الدهون الناتجة عن التمزق في مجموعات كبيرة ودمج المؤشرات متعددة الأبعاد لتشخيصات شخصية.