تنقية الأرواح الغبية HLA-G⁺ من الأنسجة المشيمة البشرية لتحديد الظاهرة والتحليل الوظيفي

تم تصميم هذا البروتوكول لتنقية الخلايا المغذية الأولية البشرية من أنسجة المشيمة البشرية لدراسة خصائصها الوظيفية وخصائصها المناعية في الحمل الصحي وتحت ظروف مرضية. لذا يوفر هذا البروتوكول منصة قابلة للتكرار لتجاوز بعض القيود السابقة في العمل مع الخلايا المثقلة البشرية الأولية، وهي جدواها. لذا هذا البروتوكول محسن حقا لتعزيز قابليتها للبقاء والنقاء فيها.

للبدء، احصل على عينة من المشيمة البشرية. ضعي المشيمة بحيث يكون جانب الجنين مواجها للأعلى حتى يكون موقع إدخال الحبل السري مرئيا. قم بتقشير السائل السفى يدويا من الغشاء الجانبي باتجاه موقع إدخال الحبل السري وإزالته.

ثم استخدم المقص لقطع وتخلص الأمنيون. اقطع الغشاء المشيمي النسبي إلى شرائط بطول بوصتين بدءا من قاعدة المشيمة إلى الأعلى مع إبقاء كل شريط ملتصقا بالمشيمة. ضع شريط الغشاء المشيمي الساقي عبر إصبعين مع توجيه الجانب المتساقط للأعلى.

باستخدام ملقط الطرف المنحني المعقم، قم بكشط النسيج الجداري الأموي بلطف من الحشيمة. اجمع الديسيودا الجداريالية في أنبوب مخروطي بحجم 50 ملليلتر يحتوي على 20 ملليتر من PBS لعزل الخلايا اللمفاوية. ثم اجمع الغشاء المشيمي في أنبوب مخروطي منفصل بسعة 50 ملليلتر يحتوي على 20 ملليتر من وسط الغسيل A. باستخدام المقص، اقطع الغشاء المشيمي داخل أنبوب 50 ملليلتر إلى قطع أصغر من مليمترين مربعين.

تخلص من الغسل الوسيط A من الأنبوب. اغسل النسيج مرارا وتكرارا باستخدام PBS حتى يصبح الفائق شفافا. لتشريح المشيمة، ضع المشيمة بحيث يكون جانب الأم مواجها للأعلى وإزالة الجلطات الدموية.

باستخدام مقص معقم، اقطع قطع من صفيحة المشيمة القاعدية مع تجنب المناطق النخرية أو المتكلسة أو الإقفارية. ضع قطعة الديسيدوا بازاليس على الأصابع بحيث تواجه الزغابات للأعلى. ثم استخدم المقص لإزالة الزغابات بعناية للحصول على غشاء بحجم 2 إلى 3 مليمترات مع طبقة رقيقة فقط من الزغابات.

اجمع نسيج البازاليس في أنبوب مخروطي بحجم 50 ملليلتر يحتوي على 20 ملليتر PBS. ثم قطع النسيج إلى قطع أصغر من مليمترين مربعين. بعد ذلك، تخلص من PBS من الأنبوب.

اغسل الساق النسبي القاعدي مرارا وتكرارا باستخدام PBS حتى يصبح السائل الشفاف دون رؤية دم. ثم قسم 15 ملليلتر من تعليق الأنسجة إلى أنبوبين مخروطيين بسعة 50 ملليتر. املأ جميع الأنابيب ب PBS.

قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب على حرارة 200G لمدة دقيقة واحدة ثم أطلق السوبرناتان. أضف 150 ملليلتر من كوكتيل إنزيم الهضم الدافئ في زجاجة بسعة 300 ملليتر. أضف 30 ملليلتر من الغشاء المشيمي إلى الزجاجة.

أضف 20 ملليلتر DMEM/F-20 الدافئ و80 ملليلتر من إنزيم الهضم الدافئ في زجاجتين منفصلتين بسعة 300 ملليلتر. ثم أضف 7.5 ملليلتر ديسيدوا بازاليس في كل زجاجة. حضن الزجاجات في حمام ماء.

اهز جميع الزجاجات كل ثلاث إلى أربع دقائق خلال فترة الحضانة التي تستمر 15 دقيقة. بعد الهضم، قم بتصفية الأنسجة عبر مناخل معدنية بحجم شبكة 40. ثم أضف مادة غسيل ب لشطف الأنسجة وإذابة المادة الهلامية.

انقل الأنسجة غير المهضومة إلى الزجاجات وكرر عملية الهضم. ثم تقوم بترشيح تعليق الخلايا عبر فلتر 100 ميكرومتر إلى أنابيب مخروطية بحجم 50 مليليتر معنونة. افصل الخلايا من الهضم الأول والثاني.

ثم قم بعمل نظام التعليق المركزي للخلية بقوة 650G لمدة ثماني دقائق. تخلص من السوبرناتانت. ادمج الحبيبات من نفس نوع الأنسجة ورقم الهضم في أنبوب واحد.

ثم قم بتركيب الحجم بغسيل متوسط B حتى 25 ملليتر. أضف 12 ملليلتر فيكول إلى أربعة أنابيب مخروطية بحجم 50 ملليلتر تحمل نوع الأنسجة ورقم الهضم. ضع تعليق الخلية بعناية على الفينكول.

ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 800 جرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن ينكسر. استنشق طبقة الخلية بعناية عند واجهة وسط الفيكول وانقلها إلى أنابيب نظيفة ومعلمة. ثم املأ الأنابيب بغسيل متوسط B، واستخدم الطرد المركزي بحرارة 650 جرام لمدة ثماني دقائق، ثم أعد تعليق الحبيبات.

ضع الحبيبات المعلقة في أنابيب فرز الخلايا المعقمة التي تنشط بالفلورة وتحمل علامة نوع الأنسجة ورقم الهضم. أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD45 BV785، وGAPC المضادة لمادة HLA، ومضادة ل EGFR1 BV711. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد غسل وإعادة تعليق الخلايا في وسط الغسيل B، مررها فورا عبر مصفاة خلية بحجم 40 ميكرومتر. فرز CD45 سالب HLAG إيجابي EGFR إيجابي وثاري خارج الزرير في أنابيب تحتوي على وسط زراعة EVT واحد من ملليلتر A. أظهر تحليل التدفق الخلوي لعلامات النسب أن زراعة تروفوبلاست أولية خارجية قابلة للحياة حتى اليوم الرابع. تم التقاط صور المجهر الضوئي الممثلة للصوت المشيمي الأولي وDICEDUA basalis HLAG الإيجابي للزراعة الزائدة بعد 24 ساعة و48 ساعة و72 ساعة من الزراعة.

كانت الخلايا الضوئية الخارجية تعبر عن HLAC متعدد الأشكال وجزيئات مثبطة معا مثبطة للمناعة. زاد التروفوبلاست الزائدة من تعبير HLAC وPD-L1 وPD-L2 وHLA-E، لكنه لم يزيد من تعبير PVR وB7H3 عند زراعتهما مع الخلايا اللمفاوية المنشطة لمدة 72 ساعة. لم يلاحظ أي زيادة في وفيات الأرواح الغافية خارج الشيز بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا اللمفاوية المنشطة.

لذا يسمح هذا البروتوكول للناس، العلماء، باستخدام الخلايا المغامضة الأولية الفضفاضة لمجموعة واسعة من الفحوصات. الفائدة هي الجدوى العالية التي تسمح بالتحليل باستخدام زراعة الخلايا، والزراعة الباردة، وقياس تدفق التوميتريات، والبروتيومكس، وعلم النسخ، باستخدام هذه الخلايا الترفوبلاستية العالية الإنتاجية الفعالة جدا. لذا، أحد أهم جوانب بروتوكولنا هو أنه يجب عليك استخدام مواد مشيمة جديدة.

لا يمكنك تبريدها. التروفوبلاست تحب الموت، لذا يرجى الحصول على أنسجة المشيمة في أقرب وقت ممكن بعد الولادة، ويفضل خلال ساعتين بعد الولادة، والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة طوال الوقت. هذا أمر ضروري للحصول على تروفوبلاست فوق الصفير عالي الفعالية.

بعض الطرق الإضافية والأكثر تقدما التي يمكنك استخدام هذه الخلايا الأولية هي زراعة الخلايا طويلة الأمد. لذا يمكنك استخدامها لتأسيس زراعة الخلايا الأولية لأربعة أيام. لذا ستكون الخلايا قابلة للحياة لمدة تصل إلى 96 ساعة، وهو وقت طويل جدا ويسمح لك بإجراء زراعة باردة مع الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية وخلايا NK.

الابتكار الآخر هو أيضا أنه يمكنك استخدامها لإنشاء خطوط خلاية شبيهة بالأروسمات الصبيانية باستخدام الطرق التي وصفها آوكي أولا، والتي استخدمناها أيضا على هذه الثقافات لتأسيس أنواع الخلايا المتكاثرة طويلة الأمد والتي يمكن استخدامها لتحرير الجينوم واختبارات الزراعة طويلة الأمد الأخرى. لذا استخدام هذه الطرق المبتكرة، بما في ذلك زراعة الخلايا طويلة الأمد، أعتقد أنه يمكن أن يساعدك حقا في تصميم ثقافات ميكانيكية طويلة الأمد حيث يمكنك تطبيق تعديل الجينوم، وجينات الاقتراب، والبروتينات، والتعبير المفرط عن بعض هذه الخلايا للحصول على تفاصيل ميكانيكية أكثر حول كيفية تعزيز هذه الخلايا للتحمل، أو السماح بالمناعة وزيادة السمية الخلوية عند تفاعلها مع مجموعات المناعة.