اختبار نايميخن للتواستاز: قياس فلوروجيني متزامن لتوليد الثرومبين والبلاسمين في بئر واحد

يركز بحثي على قياس الهيموستازيس الثانوي والتحلل الليفي معا لقياس التوازن الدموي العام. تقوم معظم الاختبارات الحديثة بتقييم المكونات المعزولة للتخثر أو التحلل الليفي. يقيس هذا الاختبار العمليتين في نفس الوقت في اختبار واحد.

للبدء، شغل قارئ الألواح الفلورية ودعه يتوازن إلى 37 درجة مئوية. قم بضبط إعدادات المرشح في البرنامج عن طريق تعيين عدد أزواج الطول الموجي إلى اثنين. اضبط طول موجة الإثارة إلى 355 نانومتر للثرومبين و485 نانومتر للبلازمين.

ثم اضبط طول موجة الانبعاث إلى 460 نانومتر للثرومبين و525 نانومتر للبلازمين. بعد ذلك، اضبط نوع اللوحة على ميكرولوح أسود مسطح قاع مسطح من نوع greiner بسعة 96 بئر. انتقل إلى منطقة القراءة وحدد تخطيط الصفائح باستخدام حد أقصى 20 بئرا لكل لوحة.

قم بضبط إعدادات PMT والبصريات بضبط كسب PMT على 200 فولت وعدد الوميضات لكل قراءة إلى ستة. ثم انتقل إلى التوقيت لتأكيد إعدادات التوقيت بمدة تشغيل إجمالية ساعة وتسع دقائق و30 ثانية، أي فترة زمنية 30 ثانية. انتقل إلى الاهتزاز لتأكيد الاهتزاز قبل القراءة الأولى بثلاث ثوان.

انتقل إلى المزيد من الإعدادات للتأكد من أن ترتيب القراءة مضبوط على العمود. قم بضبط إعدادات النقل المركب قبل القراءة عن طريق ضبط عدد النقلات المركبة إلى واحد والحجم الأولي إلى 120 ميكرولتر. تحقق من أن ارتفاع المبصمة هو 130 ميكرولتر، والحجم 20 ميكرولتر، ومعدل ميكرولتر واحد في الثانية، ونقطة الزمن 14 ثانية.

تحت مصدر المركب، تأكد من صيغة صفائح مركب البئر 96، واختر خيار بيكمان 96 سعة 2.3 ميلي لتر تحديدا. تأكد من إعدادات تنسيق نصائح المطبعة باختيار الأعمدة الصحيحة. الآن انتقل إلى أعمدة النصائح المركبة واختر الأعمدة الصحيحة.

اضبط درجة حرارة هزاز الميكرولوح على 37 درجة مئوية وتحقق من درجة الحرارة قبل الاستخدام. ثم اضبط شدة الاهتزاز على 1,100 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، قم بإذابة البلازما والبلازما المجمعة العادية للمريض في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 دقائق.

اخلط عينات البلازما جيدا وتحقق من الذوبان الكامل دون وجود تجميد مرئي. باستخدام ماصة، أضف 80 ميكرولتر من بلازما المريض أو البلازما المجمعة العادية إلى الآبار المختارة مسبقا، باستخدام رأس ماصة جديد لكل عينة. ثم جهز خليط الركيزة بخلط 48 ميكرولتر من السيفالين مع 48 ميكرولتر من عامل النسيج.

أضف إلى ذلك، 240 ميكرولتر من مخزن كلوريد ثلاثي الصوديوم، ثم الماصة 96 ميكرولتر من ركيزة الثرومبين، و48 ميكرولتر من ركيزة البلازمين. قم بإخراج 20 ميكرولتر من خليط الركيزة في كل بئر. صافحه بعد ذلك.

الآن أدخل الميكرولوح في قارئ ألواح الفلورة ودعه يتوازن عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق. اجمع بين مخزن كلوريد ثلاثي الصوديوم، ومخزن كلوريد الكالسيوم ثلاثي الصوديوم، ومنشط البلازمينوجين النسيجي لتحضير مادة البداية للكاشف. دوامة لخلط اللعبة بشكل كامل.

بيبت خليط الكواشف الابتدائي في جميع صفوف عمود المركب. أدخل اللوحة التي تحتوي على خليط الكاشف الابتدائي في درج المصدر وابدأ قياس الفلورة. سجل إشارات الفلورة كل 30 ثانية لمدة 70 دقيقة.

حافظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال فترة القياس. لتحليل البيانات، يتم تصدير بيانات التألق الحركي كجدول يحتوي على نقاط زمنية وقيم التألق لكل بئر. احسب المشتقة الأولى ورسم منحنيات توليد الإنزيمات لكل بئر لرؤية توليد الثرومبين أو البلازمين مع مرور الوقت.

مكن اختبار التعقيم من قياس متزامن ودقيق زمن لتوليد الترومبين والبلاسمين لتوفير تقييم متكامل للتخثر وتحلل الفيبرينولي. يمكن اشتقاق عدة معلمات من منحنى توليد الثرومبين، بما في ذلك زمن التأخير، وارتفاع الذروة، وإمكانات الثرومبين. فترات التأخير الأطول، وارتفاع الذروة المنخفض، وانخفاض جهود الثرومبين تشير إلى ضعف إنتاج الثرومبين.

يوفر منحنى توليد البلازمين أيضا عدة معلمات، بما في ذلك زمن تحلل الفيبرين وارتفاع ذروة البلازمين. تعكس أوقات تحلل الفيبرين الأقصر وارتفاعات القمم الأعلى تحسن إنتاج البلازما. أظهرت منحنيات توليد الثرومبين والبلازما من ثلاثة ضباط صحيين وبلازما مجمعة طبيعية توقيت نهاية ارتفاع ذروة قابل للتكرار، وكانت تعمل كملفات مرجعية للوظيفة الدموية الطبيعية.

في مريض كان نشاط العامل V بنسبة 3٪ من إنتاج الثرومبين غائبا تماما. ومع ذلك، زاد توليد البلازما بشكل طفيف. أظهر المريض الذي كان نشاط العامل V بنسبة 44٪ انخفاضا في إنتاج الثرومبين مع فترة تأخير طويلة وارتفاع ذروة منخفض، بينما بقي توليد البلازما ضمن النطاق الطبيعي.

في نقص ألفا-2-أنتيبلازمين، زاد توليد البلازما مع انخفاض نشاط ألفا-2-أنتيبلازمين. أظهر المريض المتماثل الزيغوت الذي لديه نشاط 23٪ بداية مبكرة لتوليد البلازمين، ووقت تحلل الفيبرين أقصر، وذروة أعلى في البلازما. لوحظت هذه التغيرات أيضا لدى المريض غير المتغاير الوزيجوت بنسبة 73٪، رغم أنها لم تكن واضحة بنفس القدر.

اختبار التخثر مناسب جدا للأبحاث المتعلقة بنقص عوامل التخثر النادرة، والاضطرابات التحللية الليفية، وتأثيرات الأدوية الهيموستاتية. التحديات الرئيسية هي توحيد التقنية وتطبيع النتائج لتحسين قابلية المقارنة بين الغرف والمختبرات. قد يركز العمل المستقبلي على أتمتة الاختبار وتطوير التكيفات للتوافق مع الدم الكامل أو البلازما الغنية بالصفائح.