تحسين شاشات CRISPR-Cas9 في خلايا CAR T الآن: طريقة محسنة للتحضير في المكتبات
يناير 2, 2026
طورنا بروتوكول فحص CRISPR-Cas9 المحسن لخلايا CAR T الأساسية. من خلال تقليل انتقال gDNA عبر الهضم الإنزيمي وسحب كاسيت sgRNA، يقلل هذا النهج من تشوهات PCR، مما يضمن الكشف الدقيق عن sgRNA والتعرف القوي على الأهداف الجينية الوظيفية.
تركز أبحاثنا على استخدام أساليب فحص كريسبر لتحديد الأهداف وتعزيز فعالية علاجات خلايا CAR التائية. تشمل تحديات التجارب الحالية تحقيق طرق مختبرية قابلة للتكرار في أساليب فحص كريسبر. للبدء، أضف كمية محددة مسبقا من مكتبة كريسبر الفيروسية لينتا إلى صفيحة تحتوي على خلايا تائية بسعة 24 بئرا.
أضف الدماغ المتعدد بتركيز نهائي ثمانية ميكروغرامات لكل ملليلتر. اخلط بلطف لضمان توزيع متساو. قم بطرد مركزي الخلايا عند 700 جرام لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية لإجراء عملية تدوير الدوران.
بعد الطرد المركزي، قم بإزالة اللوحة بعناية من جهاز الطرد المركزي. استبدل الوسائط بوسط نمو خلايا T طازجة. بعد ست ساعات، أضف ناقل فيروس CAR لينتا بمعدل مضاعفة للعدوى ثلاثة.
حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. عند اكتمال الحضانة، اجمع خلايا CAR T. اغسله مرة واحدة باستخدام PBS.
ثم قم بصبغ الخلايا باستخدام يوديد بروبيديوم أكرادين برتقال، وعددها في عداد خلية فلورية. جهز محلول بأربعة ميكرومولر من cas9 في مخزن التقسيمات الكهربائية. أعد تعليق خمسة مرات عشرة إلى طاقة ست خلايا CAR T في محلول cas9 سعة 50 ميكرولتر.
ثم يتم إدخال 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من شريط كوفيت متعدد الآبار دون تكوين فقاعات. قم بإزالة أي فقاعات ظاهرة بتمرير رأس الماصة بلطف على حواف البئر. استخدم برنامج توسيع الخلايا التائية الثلاثة لنوى خلايا CAR T النوية.
ضع الكوفيتات في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. أعد تعليق الخلايا التي تم تثبيتها نوى في وسط نمو الخلايا التائية. ثم حضن مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
عد الخلايا باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم الأكرادين البرتقالي في عداد الخلايا الفلورية. بعد ضبط كثافة الخلايا إلى عشرة إلى قوة ست خلايا لكل ملليلتر، أضف بوروميسين إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ستة أيام من الحضانة، قيم نسبة الخلايا الموجبة لسرطان المركز باستخدام قياس تدفق الخلية.
ثم فرز مجموعات خلايا CAR T وتخزين حبيبات الخلايا الجافة عند ناقص 80 درجة مئوية. استخلاص الحمض النووي الجينومي من العينات باستخدام طريقة استخراج الحمض النووي الخلوي والأنسجة. قياس تركيز الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة قياس الحمض النووي ذات السلسلتين السلسلتين.
بعد ذلك، هضم ما يصل إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الجينومي مع 20 وحدة من إنزيمات التقييد المختارة في حجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر. حضن الغرفة طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جهاز الدراجة الحرارية. في اليوم التالي، حضر 10 ملليتر من محلول الإزالة يحتوي على 10 ملليمولارتريس HCL و50 ملليلتر من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪.
بيبيتي 100 ميكرولتر من المنتج المهضوم في أنبوب يحتوي على خرزات دوامية. قم بعمل بيبت لخلط التعليق جيدا واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل المغنطة لمدة خمس دقائق أخرى. أثناء وضع المغناطيس، تخلص من المادة الفائقة وأنبوب 200 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ دون إزعاج الحبيبة.
بعد 30 ثانية، تخلص من الفائق وقم بغسلتين كحوليين إضافيتين. بعد غسلتين، اترك الخرزات لتجف لمدة دقيقتين، ثم أزلها من المغناطيس. أضف 40 ميكرولتر من المخزن الإيلوسي والماصة لإعادة تعليق الخرز.
قم بتمغنط التعليق لمدة دقيقتين، ثم انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد. أضف مخزن ربط غسيل واحد إلى أنبوب يحتوي على ملليغرام واحد من خرزات سترابتافيدين المغناطيسية الدوامة. بيبيتي لإعادة تعليق الخرزات في المخزن المؤقت.
ثم ضع التعليق على مغناطيس لمدة دقيقة، تخلص من المادة الفوقية وقم بغسلتين إضافيتين. بعد الغسيل الثالث، أعد تثبيت الخرزات في حاجزين لربط الغسل. ثم أضف خمسة ميكرولترات من 10 ميكروموللار من بادئات سحب البيوتينيلة إلى منتج الهضم المنقى.
حضن الخليط في حمام جاف عند درجة حرارة 96 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم برد على الثلج فورا لمدة خمس دقائق. أضف ملليغرام واحد من خرزات الستربتافيدين المغناطيسية المغسولة مسبقا إلى التفاعل، مما يضمن أن كل من التفاعل وخرز الستربتافيدين لهما أحجام متساوية. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إعادة تعليق كل أربع دقائق.
اغسله الخرز لمدة خمس دقائق، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام محلول ربط واحد فقط. وأخيرا، أعد تعليق الخرزات التي تحتوي على شريط sgRNA المرتبط في 50 ميكرولتر من مخزن إلوسي. جهز وضخم مكتبة sgRNA وقم بتسلسلها.
بعد اختيار المضادات الحيوية، أظهرت خلايا CAR T المحولة مع مكتبة كريسبر استمرار البقاء والتكاثر في كلا المتبرعين بعد علاج بورومايسين. الخلايا التائية غير المحولة، وخلايا CAR التائية التي تفتقر إلى نقل مكتبة كريسبر لم تظهر تكشرا مماثلا تحت اختيار المضادات الحيوية وكانت بمثابة ضوابط سلبية. أدى هضم إنزيمات التقييد باستخدام NDEL وPSPXI إلى إنتاج حمض نووي جينومي مجزأ مع الحفاظ على شريط RNA الموجه الوحيد للإثراء.
ثم تم تضخيم الشظايا التي تحتوي على sgRNA بشكل انتقائي. أظهرت ارتباطات بيرسون وسبيرمان أن عداد قراءة الحمض النووي الريبي الدليل الواحد وتعقيد المكتبة تم الحفاظ عليه في عينات الحمض النووي الجيني للمتبرعين مقارنة بمكتبة البلازميدات. حدد تحليل تجميع الترتيب القوي جينات تم إثراؤها أو استنزاف بشكل كبير بعد تعديل Cas9 في كلا المتبرعين.
كشف تحليل إثراء المسارات عن أهم مصطلحات أنطولوجيا جينية مرتبطة بالمنظمين الجيني المحددين. يقدم بروتوكولنا بديلا موثوقا للتقنيات المخبرية الموجودة باستخدام أساليب فحص كريسبر. ستدفع نتائجنا المجال للتقدم من خلال دعم تطوير بروتوكولات فحص كريسبر أكثر قابلية للتكرار وقوة.
مهدت نتائجنا الطريق لتحديد الجينات ويمكن تعديلها لتعزيز النمط الظاهري ووظيفة خلايا CAR T الطبيعية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً محسناً لفحص التعطيل الجيني باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 مصمماً خصيصاً لخلايا CAR T البشرية الأولية. تعالج هذه الطريقة التحديات المتعلقة بتضخيم كاسيتات sgRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من كميات كبيرة من الحمض النووي الجينومي، مما يتيح تحديد المنظمات الجينية التي تؤثر على وظيفة خلايا CAR T بشكل أكثر كفاءة وقابلية للتكرار. يتضمن سير العمل خطوات الهضم الإنزيمي والسحب الانتقائي لتعزيز استعادة sgRNA، مما يدعم اكتشاف أهداف لتحسين علاجات خلايا CAR T.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- العلاج المناعي
- الفحص الجيني
- الهندسة الخلوية
خلفية علمية
- تُعد علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضد الخيمرية (CAR T cell) فعالة للغاية في الأورام الخبيثة الدموية، ولكنها تواجه قيوداً في الأورام الصلبة ومعدلات الانتكاس.
- يعد تحسين فعالية واستمرارية الخلايا التائية CAR T محوراً بحثياً رئيسياً.
- يتيح الفحص باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 التعرف المنهجي على الجينات التي تنظم وظيفة الخلايا التائية CAR T.
- غالباً ما تكون عملية استعادة الـ sgRNA من الحمض النووي الجينومي المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القياسي غير فعالة، خاصة في العينات الصعبة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول فحص CRISPR قوي وقابل للتكرار لخلايا CAR T البشرية الأولية.
- التغلب على الحواجز التقنية في تضخيم كاسيت sgRNA من الحمض النووي الجينومي.
- تسهيل تحديد المحددات الجينية التي تعدل نمط خلايا CAR T وظيفتها.
الطرق المستخدمة
- نقل مكتبة sgRNA لـ CRISPR عبر ناقل lentiviral وناقل CAR lentiviral إلى الخلايا التائية (T cells).
- استخدام تقنيتي Spin-fection وnucleofection لضمان كفاءة توصيل الجينات وإدخال Cas9.
- الانتخاب بالمضادات الحيوية (puromycin) لإثراء الخلايا التائية CAR المعدلة بنجاح.
- استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (Genomic DNA)، والهضم الإنزيمي باستخدام إنزيمات القطع، والسحب الانتقائي لكاسيتات sgRNA باستخدام بادئات مُبايوتينية وخرزات مغناطيسية من الستريبتاديفين (streptavidin).
- تضخيم كاسيتات sgRNA المُثراة عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسلها.
- التحليل المعلوماتي الحيوي بما في ذلك ربط أعداد القراءات، وتقييم تعقيد المكتبة، وتحليل إثراء المسارات.
النتائج الرئيسية
- أتاح البروتوكول المُحسَّن الاستعادة والتضخيم الفعالين لكاسيتات sgRNA من الحمض النووي الجينومي لخلايا CAR T.
- نجت خلايا CAR T التي تم نقل مكتبة CRISPR إليها وتكاثرت تحت تأثير الانتخاب بالمضادات الحيوية، بينما لم يحدث ذلك في مجموعات الضبط.
- حافظ الهضم باستخدام إنزيمات التقييد على كاسيتات sgRNA من أجل الإثراء الانتقائي.
- أظهرت بيانات التسلسل الحفاظ على تعقيد المكتبة وارتباطاً عالياً بمكتبة البلازميد الأصلية.
- حدد تجميع الرتب القوي وتحليل المسارات المنظمات الجينية الرئيسية التي تؤثر على وظيفة خلايا CAR T.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لإجراء فحص CRISPR في خلايا CAR T البشرية الأولية.
- يتجاوز سير العمل هذا القيود السابقة المتعلقة باستعادة sgRNA من الحمض النووي الجينومي.
- تدعم النتائج تحديد الأهداف الجينية لتعزيز علاجات خلايا CAR T.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد الفحص الفعال باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 في خلايا CAR T البشرية الأولية أمراً بالغ الأهمية لتحديد المحددات الجينية التي تعدل الفعالية العلاجية والاستمرارية. تعالج طريقة تحضير المكتبة المنقحة هذه العوائق التقنية القائمة منذ فترة طويلة في استعادة sgRNA، مما يؤثر بشكل مباشر على موثوقية التحقق من الأهداف واكتشاف المسارات في العلاجات الخلوية المهندسة. تتيح قابلية التكرار المحسنة وجودة البيانات في هذه المرحلة تقدماً أكثر ثقة لمرشحي خلايا CAR T في مسار تطوير العلاج المناعي.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء المنهجي لوظيفة الجينات في خلايا CAR T للتحقق من صحة الهدف.
- يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال ربط الاضطرابات الجينية بالنتائج المظهرية.
- يسهل تحديد المسارات التي تؤثر على التنشيط، والتكاثر، والسمية الخلوية.
- يعزز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف الجينية لمزيد من التطوير.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر استعادة وتضخيم قوي لـ sgRNA من أجل فحوصات CRISPR عالية التعقيد.
- يوحد عملية تحضير المكتبة، مما يقلل من التباين ويعزز إمكانية تكرار النتائج.
- يتيح التقييم الكمي لنتائج تحرير الجينات عبر متبرعين متعددين.
- يجهز أنظمة خلوية تم التحقق من صحتها لإجراء المقايسات الوظيفية والمظهرية اللاحقة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط النتائج الجينية بالأنماط الظاهرية لخلايا CAR T ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يدعم التطوير المدروس للمنظمات العلاجية بالخلايا المهندسة في النماذج قبل السريرية مع مراعاة المخاطر.
- يوفر أساساً لاكتشاف المؤشرات الحيوية المرتبطة باستمرارية وفعالية خلايا CAR T.
- يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال توضيح المحركات الجينية للاستجابة العلاجية.
تكامل سير العمل ومسارات المعالجة
يدمج هذا البروتوكول المُحسَّن في التسلسل الممتد من الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية للعلاجات الخلوية المهندسة، مما يربط بين تحديد الهدف، والفرز، والتحقق الانتقالي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار وظائف الجينات ورسم خرائط المسارات في خلايا CAR T بناءً على فرضيات محددة.
- الفحص: توفر قراءات sgRNA كمية وقابلة للتكرار لإجراء تحليل مقارن قوي.
- التحليلات: تدعم التقييم الإحصائي لإغناء الجينات واستنزافها، مما يوجه عملية تحديد أولويات الأهداف.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاضطرابات الجينية بالأنماط الظاهرية الوظيفية لخلايا CAR T ذات الصلة بالتطوير قبل السريري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع سير عمل معياري قابل للتكيف مع منصات الخلايا المناعية المهندسة الأخرى.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع لفحوصات CRISPR في الخلايا الأولية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المضي قدماً أو التوقف وكفاءة رأس المال في محافظ العلاج الخلوي.
- التأثير على المحفظة: تتيح ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بمرشحي العلاج الخلوي المهندسة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم مكتبات CRISPR، والترنسدكشن للفيروسات البطيئة، والتعامل مع الخلايا الأولية.
- يستلزم إمكانية الوصول إلى أدوات عالية الجودة لاستخلاص الحمض النووي الجينومي وتكميمه.
- يتطلب بروتوكولات موحدة للهضم الإنزيمي والترسيب باستخدام الحبيبات المغناطيسية.
- قد يتطلب مواءمة لأنواع مختلفة من الخلايا أو لتعقيدات مختلفة في مكتبة sgRNA.
- يعتمد على مسارات معلوماتية حيوية قوية لتحليل بيانات التسلسل وتفسيرها.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية البيولوجية
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
CAR T Cell Production and CRISPR-Cas9 Screening Workflow in Primary Human T Cells
2:59
Genomic DNA Digestion and sgRNA Cassette Enrichment for CRISPR Screening
4:40
Streptavidin-Based Pulldown of sgRNA Cassettes for CRISPR-Cas9 Screening
6:14
Results
7:35
Conclusion
