اختبار الفلورة المناعية متعددة القنوات لتقييم مكاني لعلامات الشيخوخة في الجسم الحي

يعد التحليل المكاني للخلايا المتقدمة مهما لفهم مساهمتها في عمليات مثل الشيخوخة، والسرطان، والمناعة، وتوازن الأنسجة الطبيعي. يعتمد اكتشاف الخلايا الشيخوخة على تحديد عدة مؤشرات حيوية. يسمح التصوير المناعي الفلوري متعدد القنوات بتحليل عالي الإنتاجية لهذه الأشعة داخل مقطع نسيج واحد.

للبدء، تحقق من أن أقسام الأنسجة المثبتة بالفورمالين بسماكة 5 ميكرومتر، والمدمجة بالبارافين، أو FFPE، والتي يبلغ أقصى حجم مربع 4 × 2 سنتيمتر، مركبة مركزيا على شرائح مجهرية مشحونة بشحنة موجبة وتكون مرئية بوضوح داخل نافذة مشاهدة حامل الشريحة بدون غطاء للانزلاق. قم بتنفيذ خطوات تحضير العينة، إما يدويا باستخدام غرفة إزالة التمويه أو تلقائيا باستخدام جهاز تلوين آلي. ضع الشرائح المحضرة في حامل الشريحة بدون غطاء للانزلاق.

قم بمحاذاة الحواف العلوية واليمنى مع التوقفات المعدنية. قم بتثبيت السلايد في مكانه باستخدام كلتا اليدين في نفس الوقت لتدوير الكاميرات البلاستيكية إلى وضع القفل المغلق. تأكد من أن الشريحة موضوعة بشكل مسطح تماما ولا تتأرجح داخل الحامل.

ضع ClickWell، وأدخل الحجرة فوق السلايد، واقرص الألواح الجانبية بكلتا يديك لتقليل الضغط ومنع الكسر. قم بتحميل البئر بحجم 2 ملليلتر من وسائط التثبيت التي تحتوي على 50٪ جلسيرول في محلول ملحي مخزن بالفوسفات عبر منفذ المدخل. أضف ملصق باركود على الجانب الأيسر من الشريحة في أي من الاتجاهين، ثم تابع التصوير.

لاختيار المنطقة وتحليل التألق الذاتي، افتح برنامج Mx Workflow الإصدار 4204، وهو برنامج اكتساب التصوير متعدد الإصدارات. انقر على الأدوات لاختيار ناشر البروتوكول. في نافذة ناشر البروتوكول متعددة البلكس، أدخل اسم البروتوكول.

انقر على إنشاء جولة الإعداد، ثم أضف جولة البروتوكول التالية لإنشاء عدة جولات من وضع العلامات الحيوية. انقر على النشر، ثم اختر موافقا في نافذة المنبثقة. احصل على قناة Cy3 لصور H&E الافتراضية.

انقر على Slide، ثم إنشاء دفعة جديدة. بعد اختيار اسم البروتوكول، أدخل معرف الشريحة. انقر على إضافة شريحة ثم اختر إنشاء دفعة لإنشاء سير عمل تجربة متعددة الإصدارات. افتح برنامج اكتساب Cell DIVE.

انقر على تحميل لتحميل الشريحة في المجهر. تحت قائمة الأدوات المنسدلة، انقر على أيقونة الشبكة لتحديد المناطق المطلوبة واستخدم أداة التحريك لإعادة تموضع المناطق المحددة. بعد ذلك، استخدم أداة الرسم لإلغاء تحديد أي حقول غير مطلوبة، مع التأكد من أن لكل مجال رؤية على الأقل حقلين متجاورين لمنع مشاكل الخياطة، ثم اضغط على حفظ المناطق.

في نافذة سير عمل Mx، انقر على مراقبة جودة العارض لفتح صفحة عارض Cell DIVE وعرض صورة النسيج بتكبير 10 أضعاف. انقر على أيقونة تصحيح الصورة لضبط سطوع الصورة واضغط على تقديم مراقبة الجودة لاختيار تمرير وإعادة تحميل الشريحة في نافذة المنبثقة. بمجرد إعادة تحميل الصورة، انقر على إضافة عائد على الاستثمار للرسم وضبط المناطق ذات الاهتمام.

اختر الحقول المطلوبة وكرر إضافة عائد الاستثمار. بعد ذلك، اضغط على الإرسال إلى المختبر. قم بتحميل الشريحة لبدء التقاط صورة التوهج الذاتي بقوة 20x.

تحت قائمة مراقبة الجودة التصويرية، اختر مربع الاختيار المتعلق بمعرف الشريحة المحدد، ثم انقر على مراقبة جودة العارض. قم بالتكبير على الصورة المحملة لمسح المناطق غير الواضحة أو التشويهات. تحقق من صور الخلفية لكل قناة، والتي سيتم طرحها من إشارة المؤشر الحيوية النهائية. انقر على إرسال مراقبة الجودة، ثم اختر التمرير والخروج لإنشاء صور خلفية.

قبل التلوين المتسلسل، يتم طرد الأجسام المضادة بدرجة حرارة 13,000 جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة للحد من التشويش. جهز محلول الأجسام المضادة بدرجة 1 إلى 200 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات، أو PBS، يحتوي على 0.3٪ ألبومين مصل البقري، أو BSA. قم بإزالة وسائط التثبيت عن طريق إزالة الأنابيب من منفذ ClickWell.

واغسله ثلاث مرات ب 2 ملليلتر من PBS يحتوي على 0.01٪ Tween 20 أو PBST لمدة 5 دقائق. أضف 350 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة إلى المنفذ لضمان تغطية كاملة للعينة داخل غرفة التلوين. حضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإخراج محلول الأجسام المضادة من منفذ ClickWell. واغسل ثلاث مرات ب 2 ملليلتر من PBST لمدة 5 دقائق. أضف 2 ملليلتر من وسائط التركيب.

أدخل حامل ClickWell في المجهر وحمل الشريحة لبدء تصوير 20x بمؤشر حيوي. قم بإجراء مراقبة الجودة التصويرية باستخدام محرر الدمج وخيارات تصحيح الصور وقدم تقييم مراقبة جودة الصور. قم بإخراج الوسائط المثبتة من منفذ ClickWell واغسله ثلاث مرات بسعة 2 ملليلتر من PBST لمدة 5 دقائق.

جهز محلول تعطيل الصبغة طازجا قبل الاستخدام. بعد إزالة PBST، أضف 2 ملليلتر من محلول تعطيل الصبغة لكل شريحة. حضن لمدة 15 دقيقة في حامل السلايد.

قم بإخراج محلول تعطيل الصبغة من منفذ ClickWell واغسله ب 2 ملليلتر من PBST لمدة 5 دقائق. أضف 2 ملليلتر من وسائط التثبيت وأدخل حامل ClickWell في المجهر لبدء تصوير تلقائي بالتوهج الذاتي بمقدار 20x لكل دائرة. تقدم في سير العمل من خلال تمرير خطوات مراقبة الجودة كما هو موجه على الشاشة عند الانتهاء.

كرر عملية التلوين المتسلسل، وتعطيل الصبغة، وتصوير متعدد القنوات لعدد معين من العلامات المطلوبة، واستمر حتى الانتهاء. استخدم برنامج HALO لاختيار قنوات مختلفة لتصوير مواقع العلامات في مناطق مختلفة من نواة النسيج. انقر على تحليل واختر الصورة الكاملة لتحليل المقاييس الكمية للعلامات الفردية.

انقر على النتائج لعرض العدد الكلي للخلايا في نواة الأنسجة المحللة والمجموعة الفرعية من الخلايا التي تعبر عن علامات محددة. مقارنة بالطريقة الآلية القائمة على مصبوغ الشرائح، أدت طريقة غرفة إزالة الغطاء اليدوي إلى زيادة تكرار العيوب النسجة التي تتميز تحديدا بانفصال الأنسجة وكذلك فقدان أو انزلاق النوى. أظهر القياس الذي أجري باستخدام برنامج علم الأمراض الرقمي على أنسجة البنكرياس الممثلة أن خلايا p16 الموجبة مرتبطة بمستويات منخفضة من LB1 والعكس صحيح، مما أظهر موقفا متوافقا مع أنماط العلامات المرتبطة بالشيخوخة.

توضح خريطة الحرارة الموحدة بدرجة Z توزيع نمط الشيخوخة السلبي للامين-B1 الموجب بين الأنسجة المختلفة، مما يكشف عن تركيزات عالية من الخلايا الشيخوخة في الرئة والغدة الكظرية والغدة النخامية التي تتوافق مع ارتفاع p16 وانخفاض مستويات LB1. وعلى العكس، أظهرت الزائدة الدودية والعقدة اللمفاوية والطحال شيخوخة منخفضة، مع الحفاظ على تعبير منخفض في LB1 وانخفاض تعبير p16. يسمح هذا البروتوكول بفحص مزيج من العلامات الحيوية للشيخوخة والهيكلية والمناعة ضمن شريحة مجهرية واحدة.

من خلال دمج عدة علامات داخل عينة واحدة، يمكن إجراء تحليل مكاني لبنية الأنسجة وتوزيع الخلايا الشيخوخة. تشمل التطبيقات المستقبلية التحليل الواسع النطاق لمؤشرات الشيخوخة عبر أنواع الأنسجة المتعددة والتكامل مع الأوميكس المكانية لحل التباين الخلوي بشكل أفضل.