عزل الحمورات من نسيج قشرية الفأر باستخدام FACS لتسلسل الخلايا الأحادية

تفحص أبحاثنا طفيليات الدماغ مع التركيز على أدوارها الوعائية وتفاعلاتها داخل وحدة الأوعية العصبية لفهم الوظيفة الدماغية. التصوير المنخفض وتخطيط FACS المكاني في عملية الأمعاء أو وظيفة الطفيليات داخل الأوعية الدموية الدماغية يكشف عن الأدوار المحددة في الموقع والأهداف العلاجية. للبدء، رش منطقة الرأس والرقبة لفأر تم إعداده ب 75٪ إيثانول.

باستخدام المشرط، قم بعمل شق منتصف فروة الرأس من القذالة إلى المنطقة الجبهية لكشف الجمجمة. قم بإجراء شق عرضي أمام المدارات الثنائية، يليه شقوق جانبية على الحواف السفلية للمخيخ لفصل قاعدة الجمجمة. شق الجلج طوليا على طول الخيط السهمي من الخلف إلى الأمامي.

ارفع الغطاء الجحفي مع جهاز الديراماتر لتعريض الدماغ. باستخدام المقص الجراحي، ارفع الدماغ بلطف مع قطع الأعصاب البصرية واتصال النخاع المستطيل للحبل الشوكي. ضع الدماغ السليم برفق في طبق بحجم 10 سنتيمترات يحتوي على 10 ملليلتر من PBS البارد جدا، لتجنب أي ضرر.

انقل الدماغ إلى ورق الألمنيوم. كشف الفضاء تحت العنكبوتية. بعد إزالة الجافة بالملاقط، اشطفها بمحلول الملح المتوازن.

انقل المنديل إلى ورق الترشيح وأزل البياماتر عن طريق اللف. باستخدام شفرة حلاقة، قم بقطع وتخلص من البصلة الشمية ومعظم الأجزاء الذيلية، وقسم الدماغ بشكل إكليلي إلى شرائح بسماكة تتراوح بين اثنين إلى ثلاثة مليمترات. عزل القشرة الدماغية على طول الجسم الثفني.

انقل النسيج القشري إلى أمبولات تحتوي على ثلاثة ملليلتر من حاجز جمع الأنسجة الباردة مثلجة. باستخدام المشرط الجراحي، قم بتقطيع الأنسجة والحصانات إلى شظايا بحجم تقارب المليمتر، وأكمل عملية التقطيع خلال خمس دقائق للحفاظ على نضارة الأنسجة. شطف أطراف الماصة مسبقا باستخدام حاجز جمع الأنسجة.

ثم قم بسحب الشظايا المفروم ببطء نحو قمة الطرف مع تثبيت الماصة عموديا. اخرج الشظايا بلطف إلى أنابيب طرد مركزي مبردة مسبقا بسعة 15 ملليتر. اغسل الأمبولات الأصلية ب 2٪ FBS في محلول PBS.

انقل الغسيل إلى نفس أنابيب الطرد المركزي والطرد المركزي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي. أعد تعليق كل حبيبة في محلول إنزيم CD يعمل بثلاثة ملليتر.

قم بتقسيم التعليق بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب، وأضف محلول إنزيمي إضافي للوصول إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ملليلتر لكل أنبوب. حضن الأنابيب في فرن تهجين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة مع اهتزاز المدار عند 100G. أثناء الحضانة، أضف ملليتر واحد من DNASE ومحلول واحد إلى 10 ملليلتر من 2٪ FBS في PBS.

أنهي الهضم عن طريق الطرد المركزي عند 300 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق كل حبيبة في ملليلتر واحد من محلول تفكك الأنسجة. قم بتقليد الحل 100 مرة للمساعدة في التفكك الميكانيكي.

بعد ذلك، جمع جميع أنظمة التعليق في أنبوب طرد مركزي واحد بسعة 50 ملليلتر. اشطف كل أنبوب بملليلتر من المحلول وامزج الغسالات. بعد الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة الطبقة العلوية، أضف 12.5 ملليلتر من 20٪ BSA وقلب الخليط للخلط.

الطرد المركزي عند 1000 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. الآن اجمع الحبيبة السفلية وانقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مليليتر. أعد تعليق المضخة بلطف قبل إعادة الطرد المركزي.

أعد تعليق كل حبيبة في ملليلتر من 2٪ FBS في PBS. ثم اجمع بين التعليقين في أنبوب واحد. قم بعمل الطرد المركزي في نظام التعليق المشترك عند 300G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من السوبرناتان، أعد تعليق الحبيبة الأخيرة في ملليتر من PBS مع 2٪ FBS. جهز أربعة أنابيب طرد مركزي بسعة 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليترات من 22٪ لكل محلول مكالمة. ضع طبقة بلطف من 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية على كل تدرج وجهاز طرد مركزي عند 560 جيلون لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد استنشاق السوبرناتانت، أعد تعليق كل حبيبة في ملليلتر واحد من محلول الجلوكوز HBSS BSA. ثم أسحب التعليق إلى أنبوب جديد بسعة 15 مليليتر. اشطف أنابيب البيركول باستخدام ملليلتر من المخزن وامزج الغسولات قبل الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

لقياس تدفق الحلقات، أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من محلول الجلوكوز HBSS BSA بعد استنشاق السوبرنادانت. أضف خمسة ميكرولترات من كاشف حجب مستقبلات FC وحضن عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم تقوم الماصة بترافق الأجسام المضادة الفلورية مع التعليق قبل الحضانة.

اغسل الخلايا بستة ملليلتر من محلول الجلوكوز HBSS BSA. ثم قم بعمل طرد مركزي للتعليق عند 300G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد استنشاق السوبرناتانت، أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من البام.

أضف 200 ميكرولتر من محلول الأكتينوميسين D الأميني السبعة وحضنه على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم اضبط الحجم النهائي إلى ملليلتر مع مخزن HBSS مع BSA والجلوكوز. اشطف السطح الداخلي لأنابيب الجمع بمحلول 1٪ BSA.

استنشق المحلول الزائد، تاركا ملليتر واحد فقط من المحلول في كل أنبوب. خزن الأنابيب على الثلج لاستقبال الخلايا المفترضة. تم تقسيم الخلايا المتقطعة عن أنسجة الدماغ بشكل تسلسلي بواسطة منطقة التشتت الأمامية ومنطقة التشتت الجانبية لاستبعاد الحطام الخلوي أثناء فرز تدفق الخلايا الخلوية.

تم استبعاد الأحداث الإيجابية للجزء 45 من الدورة 45 وحالة إيجابية مزدوجة ليوم CD41 لإزالة الخلايا المكونة للدم وملوثات الصفائح الدموية. تم إثراء خلايا جدار الأوعية الدموية الإيجابية في CD13. وتم استبعاد الخلايا الاستماتة باستخدام سبعة حصار أميني أكتينومايسين D سالب، تلاها اختيار سلبي CD31 لعزل الطفيليات.

أظهر فرز التدفق الخلوي أن الخلايا النواة تمثل 59.8٪ من جميع الأحداث. شكلت خلايا CD13 الإيجابية 1٪ من جميع الأحداث. وشكلت المجموعة النهائية من الطفيليات الإيجابية لليوم الثالث الثالث عشر نسبة 0.7٪ من جميع الأحداث.

كشف تقليل أبعاد UMAP للخلايا الفرز عن ست عناقيد رئيسية مميزة تشير إلى تباين الخلايا داخل السكان المعزولين. أظهر تحليل خريطة الحرارة الموحدة بدرجة Z أن جينات علامات الطفيليات كانت معبر عنها بشكل كبير وبشكل رئيسي في المجموعات من صفر إلى ثلاثة. أظهر تحليل نسبة التجمعات أن المجموعات من الصفر إلى الثلاثة شكلت 87.1٪ من إجمالي السكان.

بينما تم إثراء مؤشرات خلايا العضلات الملساء في المجموعة الرابعة بنسبة 10.14٪، ومؤشرات الخلايا الليفية في المجموعة الخامسة بنسبة 2.77٪، يتيح هذا البروتوكول للباحثين عزل الطفيليات القابلة للارتداء عالية النقاء المناسبة لتسلسل الخلايا المفردة والتحليل الوظيفي. التحدي الرئيسي هو غياب علامات طفيلية محددة للغاية، وتعقيد العزل، وزيادة خطر التلوث العلماني. يمكن للدراسات المستقبلية أن تركز على تحديد علامات الطفيليات الخاصة، مما يمكن من تحسين العزلة، وتوصيف وظيفي أعمق، وتحقيقات علاجية مستهدفة.