تحليل إمكانية الوصول للكروماتين في يرقات الكاينورهابديتس الكاملة . L4

تركز أبحاثنا على كيفية تشكيل التنظيم الفوق الجيني للتعبير الجيني، وتحديدًا كيفية تحكم قابلية الوصول للكروماتين في نشاط الجينات عبر الظروف البيولوجية المختلفة. تقتصر تقنية ATAC-seq في C. elegans بسبب الطبقة الواقية. تتغلب بروتوكولاتنا على هذه العقبة لتمكين تحليل قابلية الوصول للكروماتين بشكل موثوق.

للبدء، احصل على مجموعة متزامنة من الديدان L1 واتركها تنمو لمدة 26 ساعة عند 20 درجة مئوية. تأكد تحت المجهر من أن معظم الديدان في المرحلة L4. استرجع كل الديدان من الأطباق بمحلول M9 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي حجمه 1.5 ملليلتر.

اغسل الديدان خمس مرات بملليتر واحد من الماء المعقم عن طريق تركها تستقر بواسطة الجاذبية. ثم انقل الأنبوب المحتوي على الديدان إلى حاضنة درجة حرارتها 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة بقايا الطعام المعوي. ثم خذ 50 ميكروليتر من حبيبات الديدان ووضعها في أنبوب جديد.

لتحلل الديدان، أضف 200 ميكروليتر من محلول SDS-DTT الطازج واخلطها في جهاز دوران الأنبوب لمدة خمس دقائق بالضبط. ثم أضف ملليتر واحد من محلول البيض البارد. ثم قم بتدويره على جهاز طرد مركزي صغير لإزالة المادة الفائضة وكرر العملية 6 مرات.

بعد ذلك، أضف 80 ميكروليتر من البروناز المحضر حديثًا. باستخدام ماصة 200 ميكروليتر ذات أطراف مصفاة، امزج خليط الديدان والبروناز 70 مرة وقم باحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 800 ميكروليتر من وسط L15 10٪ مصل بقريّ جنينيّ وقم بالطرد المركزي عند 500G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد إزالة المادة الفائضة، أضف ملليتر واحد من وسط L15 10٪ مصل بقريّ جنينيّ وقم بالطرد المركزي كما هو موضح سابقًا. بمجرد غسل الحبيبة ثلاث مرات، أزل المادة الفائضة وأعد تعليق الحبيبة في 900 ميكروليتر من وسط L15 10٪ مصل بقريّ جنينيّ. ثم قم بترشيح التعليق باستخدام فلتر 20 ميكرومتر.

قم بالطرد المركزي للتعليق الخلوي المرشوش عند 500G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الفائضة، تاركًا حوالي 50 ميكروليتر. أضف 45 ميكروليتر من محلول التحلل الطازج وقم بإعادة تعليق العينة بعناية.

ثم أضف بعناية 50 ميكروليتر من محلول الغسل دون مزج العينة. قم بالطرد المركزي عند 500G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الفائضة واحتفظ بالعينة على الجليد.

أثناء الطرد المركزي، قم بتحضير مزيج TN5 لكل عينة عن طريق الجمع بين 25 ميكروليتر من محلول TN5 و 24.8 ميكروليتر من الماء الخالي من النوكليوزيد و 0.2 ميكروليتر من إنزيم TN5. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائضة واحتفظ بالنواة على الجليد. أضف 50 ميكروليتر من مزيج TN5 إلى حبيبات النواة.

ثم قم بطرد الأنبوب لأعلى ولأسفل سبع مرات لخلطه. قم باحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على كتلة حرارية وقم بتدفئة الأنبوب بلطف كل 10 دقائق. بعد احتضان TN5، أضف 300 ميكروليتر من محلول PB وقم بالخلط عن طريق الخلط على السرعة القصوى لمدة 25 ثانية.

قم بنقل الحجم الكلي من الأنبوب إلى العمود الغزلي. قم بالطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة على السرعة القصوى. أضف 750 ميكروليتر من محلول PE إلى العمود الغزلي وقم بالطرد المركزي مرة أخرى.

ثم قم بالتخلص من المادة الفائضة مع أنبوب التجميع. بعد الطرد المركزي الفارغ، قم بوضع العمود في أنبوب جديد بحجم 1.5 ملليلتر مسمى. أضف 10 ميكروليتر من محلول EB عند 37 درجة مئوية إلى وسط العمود دون لمسها.

اتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة على السرعة القصوى في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر خطوات الطرح للحصول على حجم نهائي يبلغ 20 ميكروليتر في محلول EB.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتقدير عدد دورات التضخيم المناسب لتضخيم مكتبة ATAC. قم بتقدير عدد دورات التضخيم النهائي عن طريق اختيار الدورة التي يصل فيها إشارة التضخيم إلى 1/3 من أقصى قيمة لكل عينة. قم بإجراء التضخيم النهائي لمكتبة ATAC وقم بتعيين بادئة عكسية مختلفة لكل عينة وقم بتسجيلها.

قم بتضخيم كل عينة لعدد الدورات المقدر لتلك العينة. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المعروض في أنابيب 200 ميكروليتر باستخدام 10 ميكروليتر من مكتبة الحمض النووي في إجمالي حجم التفاعل البالغ 50 ميكروليتر. قم بحفظ العينات عند درجة حرارة ناقص 20 درجة مئوية إذا تم إيقاف البروتوكول.

بعد تنقية المكتبة المضخمة، قم بإجراء التحليل الكهربائي الشعري لرؤية نمط توزيع حجم الأجزاء. تشير منحنى التضخيم الذي ينتج عنه تضخيم نهائي مقدر لأقل من 15 دورة إلى وجود مادة جيدة النوعية مناسبة للمتابعة. يشير منحنى التضخيم الذي يظهر زيادة متأخرة إلى وجود مادة منخفضة النوعية ويجب عدم استمرارها.

أظهرت توزيع طول الأجزاء بعد التضخيم أنماطًا نوكليوسومية عند حوالي 150 زوجًا أساسيًا و 300 زوجًا أساسيًا في العينات الصالحة. أشار نمط الأجزاء الممدد إلى وجود DNA مفرطة التجزئة مما يتطلب تكرار العينة. سيمكن برتوكولنا من فحص قابلية الوصول للكروماتين على مستوى الجينوم في الديدان الكاملة لفهم كيفية تأثير البيئات على تنظيم الجينات.

تكمن التحدي الرئيسي في موازنة مدخل الديدان ونشاط TN5 لتجنب عدم كفاية أو مفرطة التجزئة، وضمان تصوير قابلية الوصول للكروماتين الأمثل. يفتح هذا النهج فرصًا لدراسة التباين الفوق الجيني عبر العزلات الطبيعية، الظروف البيئية وحتى الأنواع البديلة.