طريقة موحدة لاكتشاف أنابيب النانو النفقية في خلايا جلد الإنسان لتطبيقات هندسة الأنسجة

طورنا طرقا لاكتشاف وتحليل أنابيب النانو النافق بين خلايا الجلد البشرية بشكل موثوق ودراسة دورها المحتمل في تجديد الجلد. بروتوكولنا مصمم للعينات الثابتة أو لخلايا الجلد البشرية الأولية. وهو مفيد في الأبحاث المتعلقة ببيولوجيا الجلد وتجديد الأنسجة.

للبدء، قم بإذابة وزراعة خلايا الكيراتينية الجلدية والخلايا الليفية الجلدية البشرية في أطباق بحجم 60 ملم تحتوي على وسط النمو المناسب. قم بإضافة Y-27632 إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار في زراعة الخلايا الكيراتينية أثناء الإنعاش. حافظ على جميع الثقافات عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة حتى تصل إلى حوالي 80٪ من التقاطع.

ثم أزل الوسط من طبق الثقافة. اشطف الخلايا لفترة وجيزة بملليلتر واحد من PBS للحفاظ على الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي والأومضية أثناء الغسل. استنشق PBS بالكامل.

أضف ملليتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA وزعه بالتساوي على سطح الخلية. حضن الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 إلى 2.5 دقيقة. أعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق التوصيل بأنبوب للأعلى والأسفل.

أضف ملليلتر من وسط النمو لتعادلية التربسين. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليليتر وجهاز طرد مركزي بحرارة 200 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفائقة من أنبوب الطرد المركزي.

أعد تعليق حبيبات الخلية في ميليتر إلى ملليلتر من وسط وقم بعدد الخلايا باستخدام عداد آلي. بعد ذلك، زرع 12,000 من الخلايا الليفية الجلدية أو 20,000 خلايا كيراتينية في كل بئر من حجرة مكونة من ثمانية آبار في حجم نهائي يبلغ 400 ميكرولتر. بعد البذر، اهز الحجرة جيدا لتوزيع الخلايا بشكل متساو وحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة تقارب 24 ساعة.

بعد الحضانة، تأكد مما إذا كان التقاء الخلايا حوالي 80٪ تحت المجهر. عندما تصل الزراعة إلى 80٪ من التلاقط، أضف بلطف عدة قطرات من المحلول المثبت مباشرة إلى بئر الحجرة لبدء الكلمات. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق، لضمان انتشار المثبت بشكل متساو دون إزعاج الخلايا.

ثم يستنشق المثبت المسبق من البئر ويضيف 140 ميكرولتر من محلول التثبيت الطازج الأول، لضمان تغطية سطح البئر بالكامل. حضن السلايد عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، أزل المثبت من بئر الحجرة وأضف 140 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم بوزن 100 ملليمول لتهدئة الألدهيدات المتبقية.

حضن السلايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة. اشطف العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 30 ثانية لكل منها في درجة حرارة الغرفة. خلال كل عملية غسل، قم بعمل الماصة بلطف على طول جدار الحجرة لتجنب غسل الخلايا أو تلف أنابيب النانو النافقية.

حضن الخلايا ب 140 ميكرولتر من تخفيف حجم إلى حجم 1:300 من جرثوم القمح المتعرق الدقيق أليكسا في PBS. إجراء الحضانة في الظلام ودرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لوضع علامات على بروتينات الغشية البلازمية لرؤية أنابيب النفق المشتقة من الغشاء. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 30 ثانية لكل منها.

ثم حضن الخلايا ب 140 ميكرولتر من الفالويدين المترافق، مخفف مرة إلى 250 مرة في 1٪ BSA لمدة 30 دقيقة في الظلام وعلى درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، حضنها بمحلول DAPI بسعة 140 ميكرولتر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وأخيرا، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من وسط التثبيت في كل بئر وحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

خزن الشرائح عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة لا تقل عن 20 دقيقة حتى التصوير. في زراعة الأرومات الليفية الجلدية، لوحظت الأنابيب النانوية النفقية كبروزات طويلة رفيعة تربط الخلايا المجاورة بأغشية مصبوغة بأغلوتينين جرثوم القمح وأكتين F الموسوم بالفالودين. في زراعة خلايا الكيراتينية البشرية، لوحظت أيضا أنابيب نانوية نفقية ذات نتوءات إيجابية مميزة لأكتين F وهي تربط الخلايا المجاورة.

في الزراعة المشتركة للأرومات الليفية الجلدية وخلايا الكيراتينية البشرية، تم اكتشاف أنابيب نانوية نفقية باستمرار بين الخلايا الليفية الجلدية وخلايا الكيراتينية البشرية، وذلك من خلال تلوين الغشاء والسيتوكراتين 5. أظهرت أنابيب النانو النفقية في الزراعة المشتركة تنظيما هيكليا خلويا متنوعا، مع أمثلة تحتوي فقط على F-أكتين، سواء الخيوط، أو F-أكتين مع ألفا-توبولين جزئي، أو بمستويات منخفضة من ألفا-توبولين. التحدي الأبرز هو الحفاظ على النفق في أنابيب النانو.

يتطلب ذلك تثبيتا لطيفا، وتوقيتا مناسبا، واستخدام إضافات ثابتة محضرة حديثا. باستخدام بروتوكولنا، يمكن قياس أنابيب النانو النفقية تحت ظروف خلاية مختلفة لاستكشاف وظائفها المحتملة. في المستقبل، سنقوم بوضع علامات فلورية على الميتوكوندريا لدراسة نقلها عبر أنابيب نانوية نفقية.