اختبار تكوين المستعمرة الذي يكشف عن القدرة التكاثرية لخلايا ساركوما العظمية التي تسقط بواسطة LncRNA

يركز بحثي على الساركوما العظمية ويهدف إلى دراسة كيف يؤثر فقدان LncRNA على القدرة التكاثرية طويلة الأمد باستخدام اختبارات معلومات المستعمرات. للبدء، قم بزرع 5 أضعاف 10 بقوة 5 خلايا ساركوما عظمية 143B في صحنين من الزراعة بحجم 10 سنتيمترات. زرع الخلايا في DMEM كامل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.

جهز كواشف النقل بعد 24 ساعة، بما في ذلك البلازميدات، والبولي إيثيلينينين، ووسط أوبتي مينيم الأساسي. قم بعمل دوامة لكل مادة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. الآن، ضع علامات على أربعة أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر للبلازميدات والبولي إيثيلينمين باستخدام قلم تحديد (قلم تحديد الصور).

بيبت 500 ميكرولتر من وسط أوبتي مينيوم الأساسي لكل أنبوب. ثم أضف 10 ميكروغرام من البلازميد إلى أنبوب البلازميد المقابل وقم بإخراج 30 ميكرولتر من البولي إيثيلينيمين في كل أنبوب بولي إيثيلينين. اخلط كل أنبوب بلطف عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا واحتضن.

الآن اجمع كل أنبوب بلازميد مع أنبوب البولي إيثيلينمين المقابل له. اخلط الخليط بلطف وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. استنشق وسط الزراعة بلطف من الأطباق التي تحتوي على خلايا 143B.

أضف سبعة ملليلتر من الوسط الخالي من المصل إلى كل طبق ووضع علامات على الأطباق حسب البلازميد المراد إضافته. أضف خليط النقل المحضر باتجاه القطرة إلى طبق الزراعة المناسب. أضف الخليط ببطء بحركة دائرية من الحافة الخارجية نحو مركز الطبق.

حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. تخلص من السوبرناتانت بعد 8 إلى 12 ساعة. ثم أضف 10 ملليلتر من DMEM الكامل إلى طبق الزراعة وبدأ الحضانة.

راقب الخلايا تحت مجهر فلوري بعد 72 ساعة من استبدال الوسط، وأخرج الوسط من أطباق الزراعة. أضف 1.5 ملليلتر من حمض التربسين-إيدتا لهضم الخلايا. الخلايا تصدر الماصة بلطف لفصل الخلايا.

ثم أضف خمسة ملليلتر من الوسط الكامل لإنهاء عملية الهضم. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 15 ملليتر. ثم قم بعمل ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في مقياس الدم لعدد الخلايا.

اجمع 3 ضرب 10 في قوة 5 خلايا لاستخراج حمض الريبونوكليك للتحقق من كفاءة الإسقاط. الآن ازرع 2 في 10 بقوة 3 خلايا لكل بئر في صفيحة بستة آبار. يكمل Pipette DMEM إلى حجم نهائي يبلغ 2 ملليلتر.

زرع الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. راقب تكوين المستعمرة يوميا. إنهاء الزراعة عندما تحتوي معظم المستعمرات في المجموعة الضابطة على ما لا يقل عن 50 خلية أو بعد 10 إلى 14 يوما من الحضانة.

بعد التخلص من السوبرناتانت، اغسل الخلايا مرتين بملليتر واحد من PBS لكل بئر، ثم تخلص من المحلول بعد كل غسل. ثبت الخلايا في ملليلتر واحد من محلول فورمالين 10٪ لمدة 15 دقيقة. تخلص من المثبت، ثم اغسل الخلايا مرتين بملليلتر واحد لكل بئر من PBS.

صبغ الخلايا بملليتر واحد من محلول البنفسجي الكريستالي 0.5٪ لمدة 10 إلى 30 دقيقة. ثم اغسل الطبق بلطف بماء الصنبور الجاري ببطء. جفف الخلايا في الهواء عند درجة حرارة الغرفة.

التقط صورا للمستعمرات باستخدام الكاميرا. تم تأكيد كفاءة النقل لخلايا 143B بواسطة المجهر الفلوري بعد 72 ساعة من النقل، مما يشير إلى توصيل فعال للبلازميدات في كلا الحالتين. أظهر تحليل تفاعل RT-qPCR أن تعبير SNHG6 انخفض بشكل ملحوظ في 143B التي تم نقلها بواسطة shSNHG6 مقارنة بمجموعة shNC.

كشفت اختبارات تكوين المستعمرات عن انخفاض كبير في عدد وحجم المستعمرات في مجموعة إسقاط SNHG6 مقارنة بمجموعة الضابطة. يقيم هذا البروتوكول التكاثر طويل الأمد لخلية واحدة، مما يوفر أهمية بيولوجية أعلى ونتائج أكثر تحديدا مقارنة باختبارات التكاثر قصيرة المدى القائمة على الأيض. ستوسع الدراسات المستقبلية هذا البروتوكول ليشمل المزيد من LncRNA ونماذج الأورام لاستكشاف آليات تنظيم إمكانات تكاثر خلايا السرطان بشكل منهجي.