تسلسل وتجميع البلازميدات طويلة القراءة باستخدام سير عمل قائم على تسلسل النانو بور
July 7th, 2026
تصف الدراسة الحالية سير عمل لتسلسل البلازميدات النانوية عندما يكون تسلسل الكروموسومات معروفا بالفعل أو غير مهم. تضمن خطوة أولية لإثراء الحمض النووي بالبلازميدات عمقا مثاليا لتسلسل البلازميد، وتعظيم عدد العينات التي يمكن تتبعها لكل خلية تدفق.
نحن ندرس تكاثر، صيانة ونشر عناصر الحمض النووي الدائري ذاتية التكاثر، والمعروفة باسم البلازميدات، مما يستلزم تحديد تسلسلاتها. يتناول هذا البروتوكول مشكلات التغطية والدقة المرتبطة بالتسلسل طويل القراءة عن طريق إثراء الحمض النووي البلازميدي وتحسين طرق التجميع. تم تصميم بروتوكولنا لتسلسل البلازميدات في المواقف التي تكون فيها التسلسل الصبغي معروفًا أو غير ذي صلة.
لبدء، ضع العينات على لوحات LB auger المكملة بالمضاد الحيوي المناسب لاختيار علامة مقاومة البلازميد المقابلة. قم بحضانة اللوحات في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بتلقيح ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضاد الحيوي المناسب مع مستعمرة معزولة واحدة.
قم بحضانة الثقافة مع الاهتزاز في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات تقريبًا أو حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى واحد إلى اثنين. ثم قم بتلقيح 400 ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضاد الحيوي المناسب مع 400 ميكرولتر من الثقافة المبتدئة وحضنها كما هو موضح سابقًا. ثم قم بنقل الثقافة إلى زجاجات الطرد المركزي المناسبة لحجم الثقافة.
قم بالطرد المركزي عند 4،200 G لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الحبيبات باستخدام أحجام الكاشف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. بعد تحلل الخلايا والتحييد، قم بالطرد المركزي للمستحلب عند 4،200 G لمدة 30 دقيقة. قم بنقل المحلول فوق السائل إلى أنبوب جديد وقم بالطرد المركزي مرة أخرى.
قم بإجراء الموازنة والغسل وانتزاع الحمض النووي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أعد تعليق الحمض النووي المرسَّب في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لزيادة التركيز إلى أقصى حد لإعداد مكتبة النانوبور. ثم قم بتحضير أنابيب الفحص لتقدير الحمض النووي وفقًا للجدول المقدم.
بعد معايرة الفلورومتر، أدخل أنابيب العينات في الفلورومتر وسجل القراءات وفقًا لدليل الجهاز. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري على 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بتدوير وتقليب مكونات المجموعة المذابة وفقًا للجدول المقدم.
قم بحضانة أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل المعدة لوضع الباركود باستخدام برنامج جهاز التدوير الحراري. ثم قم بوضع الأنابيب على الثلج لتبرد. قم بجمع العينات المبرَّكة في أنبوب إيبندورف نظيف بسعة 1.5 ملليلتر، مع التأكد من أن الحجم الكلي لا يتجاوز 1000 ميكرولتر.
بمجرد أن يتم هزة الخرز، أضف حجمًا مساويًا من الخرز إلى العينات المبرَّكة المجمعة. قم بتقليب المحتوى عن طريق هز الأنبوب، ثم قم بحضانته لمدة 10 دقائق. ثم قم بغسل الخرز بمليلتر واحد من الإيثانول 80٪ بينما يكون على المغناطيس.
ارفع الإيثانول وكرر العملية مرة أخرى. أخرج الأنبوب من المغناطيس. أعد تعليق الخرز في وسط النزع باستخدام الحجم المناسب بناءً على عدد الباركود المستخدمة وحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بتقدير تركيز الحمض النووي باستخدام ميكرولتر واحد من العينة المنزوعة على الفلورومتر للتحقق من نجاح إعداد المكتبة. لإجراء ربط المكيف، قم بنقل 11 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي إلى أنبوب جديد وقم بتسميته. ثم قم بمزج المكونات المعروضة في أنبوب جديد لتخفيف المكيف السريع المذاب.
بعد ذلك، قم بإضافة ميكرولتر واحد من المكيف السريع المخفف إلى 11 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي وهز الأنبوب لخلط المحتوى. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة للتأكد من جمع الحجم الكامل في القاع وحضان الأنبوب على الرف لمدة خمس دقائق. قم بتحضير مزيج تحضير خلية التدفق في أنبوب الحمض النووي الجديد وقم بمزجه عن طريق التحويل والسحب.
ارفع غطاء الجهاز وأدخل خلية التدفق فيه مع وضع ضغط لطيف لضمان الوضع الصحيح. بعد التحقق من وجود فقاعات هواء داخل أو بجوار منفذ التحضير، قم بسحب 20 إلى 30 ميكرولتر من السائل لإزالة الفقاعات. ثم قم بسحب 800 ميكرولتر من مزيج التحضير وقم بتوزيعه في منفذ التحضير مع تجنب فقاعات الهواء واترك الجهاز يستقر لمدة خمس دقائق.
قم بمزج مكتبة الحمض النووي مع الحجم المناسب من حبات المكتبة في أنبوب جديد كما هو موضح هنا. قم بتحميل 200 ميكرولتر من مزيج التحضير في منفذ تحضير خلية التدفق. قم بتعديل غطاء منفذ العينة لكشف المنفذ.
قم بتوزيع 75 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي مع الخرز في منفذ العينة قطرة قطرة، مع السماح لكل قطرة بالامتصاص قبل إضافة القطرة التالية. ثم قم بإعادة غطاء منفذ العينة وإغلاق منفذ التحضير. بمجرد إغلاق غطاء الجهاز، ابدأ تشغيل التسلسل.
قم بضبط حد وقت التشغيل بناءً على عدد البلازميدات التي يتم تعددها مع حد افتراضي يبلغ 48 ساعة وأقصى حد يبلغ 72 ساعة. حدد وضع استدعاء القاعدة فائق الدقة وخيار مجموعة الباركود السريع المناسب. ثم قم بتحديد بيانات FAST5 أو POD5 الأولية وابدأ في استدعاء القاعدة.
لإنشاء ملف FASTQ مرشّح للتجميع اللاحق، قم بقص القراءات الطويلة باستخدام Filtlong لإزالة حوالي 5-10٪ من القراءات الأقل جودة مع الاحتفاظ بحوالي 90٪ من العائد الكلي. قم بأخذ عينات عشوائية من القراءات باستخدام Autocycler وفقًا للإعدادات الموصى بها. قم بتجميع كل مجموعة من القراءات الفرعية باستخدام Raven وFlye وKanu وMiniasm وMyloasm وNECAT وPlassembler ومُجمِّعين محددين آخرين.
قم بتصور كل ملف رسم بياني للتجميع باستخدام bandage. قم بتقييم الأجزاء المتصلة من حيث الدائرية، وتناسق الحجم عبر المُجمِّعين، والأدلة على المفاصل الخيمرية. قم بإزالة الأجزاء الخطية التي تفتقر إلى الدعم عبر مُجمِّعين متعددين والاحتفاظ بالأجزاء الدائرية ذات تقديرات الحجم المتسقة.
قم بإزالة الأجزاء الصغيرة غير المدعومة قبل إنشاء التوافق عندما يتم تدوير البلازميدات الرئيسية. قم بإنشاء التسلسل المتفق عليه بعد المعالجة اليدوية. قم بإنشاء التسلسل المتفق عليه باستخدام Autocycler مع التجميعات المعالج يدويًا.
قم بتنفيذ أوامر Autocycler المتبقية لإنتاج التسلسل النهائي للتوافق البلازميدي. أخيرًا، قم بتحسين التجميع النهائي باستخدام القراءات الطويلة المقصوصة مع Medaka لتحسين دقة التوافق. أنتج كل اختبارات الاقتران كائنات مقترنةً، مما أكد وجود بلازميد مترافق في المانحين.
كانت أحجام تسلسلات البلازميدات المجمعة متسقة مع التقديرات المستندة إلى هجرة حقل النبضات. أنتج تسلسل النانوبور مخرجًا كافيًا من القراءات والجودة لجميع العينات التي تم تحليلها. تراوحت معدلات التلوث الصبغي بين 72.1٪ و28.0٪ بمتوسط 46.9٪ أظهرت تحليل هجرة حقل النبضات للبلازميد الموجود في السلالة UPEC_271 وجود نطاق يتوافق مع بلازميد يبلغ حوالي 145 كيلو بايت.
أظهر الحمض النووي من أحد الكائنات المقترنةً تسلسلًا متطابقًا مع 145 كيلو بايت. أظهر تحليل هجرة حقل النبضات للسلالة blood 100913 وجود بلازميدين يبلغان حوالي 70 و110 كيلو بايت. أكد تسلسل النانوبور وجود تجميعين من البلازميدات يبلغان 71،182 زوج قاعدي و11
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
