تسلسل وتجميع البلازميدات طويلة القراءة باستخدام سير عمل قائم على تسلسل النانو بور

نبحث في تكرار وصيانة ونشر عناصر الحمض النووي الدائرية الذاتية التكاثر، المعروفة بالبلازميدات، مما يتطلب تحديد تسلسلاتها. يعالج هذا البروتوكول قضايا التغطية والدقة المرتبطة بالتسلسل طويل القراءة من خلال إثراء حمض البلازميدات النووي وتحسين طرق التجميع. تم تصميم بروتوكولنا لتسلسل البلازميدات في الحالات التي يكون فيها تسلسل الكروموسومات معروفا أو غير ذي صلة.

للبدء، ضع العينات على ألواح مثقاب LB مع مضاد حيوي مناسب لاختيار مؤشر المقاومة المنقول بالبلازميد. حضن الصحون على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بتطعيم ثلاثة إلى خمسة مليلتر من متوسط LB مع مضاد حيوي مناسب مع مستعمرة معزولة واحدة.

احتضن الزراعة بالهز عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي ثماني ساعات أو حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى واحدة إلى اثنتين. ثم قم بتطعيم 400 ملليلتر من متوسط LB مع مضاد حيوي مناسب ب 400 ميكرولتر من مزرعة البداية وحضن كما أوضح سابقا. ثم انقل الزراعة إلى زجاجات طرد مركزي مناسبة لحجم الزرعة.

قم بالطرد المركزي بحرارة 4، 200 جرام لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الحبيبات باستخدام حجم المواد الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. بعد تحلل الخلية وتعادلها، قم بالطرد المركزي بجهاز الليزات عند 4,200 جرام لمدة 30 دقيقة. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد وأعد تعقيده بالطرد المركزي.

قم بإجراء التوازن، والغسل، واستخفاض الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أعد تعليق الحمض النووي المتأصل في 100 ميكرولتر من ماء خال من النوكلياز لتعظيم التركيز لتحضير مكتبة النانو. بعد ذلك، لقياس الحمض النووي، جهز أنابيب الفحص كما هو موضح في الجدول المعروض.

بعد معايرة الفلوروميتر، أدخل أنابيب العينة في الفلورومتر وسجل القراءات وفقا لدليل الأجهزة. برمج جهاز الدورة الحرارية إلى 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تليها 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بتدوير وخلط مكونات الطقم المذابة كما هو موضح في الجدول المعروض.

حضن أنابيب PCR المعدة للترميز الشريطي باستخدام برنامج دورة الحرارة. ثم ضع الأنابيب على الثلج لتبرد. اجمع العينات المشفرة في أنبوب إيبندورف نظيف بسعة 1.5 مليليتر، لضمان ألا يتجاوز الحجم الكلي 1,000 ميكرولتر.

بمجرد أن يتم تدوير الخرز، أضف كمية متساوية من الخرزات إلى العينات المجمعة في الباركود. اخلط بتحريك الأنبوب، ثم حضانة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخرزات بملليتر واحد من الإيثانول بنسبة 80٪ أثناء وضعه على المغناطيس.

أزل الإيثانول وكرر العملية مرة واحدة. أزل الأنبوب من المغناطيس. أعد تعليق الخرزات في مخزن الفضول باستخدام الحجم المناسب بناء على عدد الرموز الشريطية المستخدمة وحضن القطع لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام ميكرولتر واحد من العينة المملوءة على جهاز قياس الفلورومتر لتأكيد نجاح تحضير المكتبة. لربط المحول، انقل 11 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي إلى أنبوب جديد ووضع علامة عليه. ثم اخلط المكونات المقدمة في أنبوب جديد لتخفيف المحول السريع المذاب.

بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من المحول السريع المخفف إلى مكتبة 11 ميكرولتر من الحمض النووي وحرك الأنبوب لخلط المحتويات. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لضمان تجمع الحجم الكامل في الأسفل وحضن الأنبوب على المقعد لمدة خمس دقائق. جهز خليط تمهيد خلايا التدفق في أنبوب DNA جديد وامزجه عن طريق العكس واستخدام الماصات.

ارفع غطاء الجهاز وأدخل خلية التدفق فيه مع تطبيق ضغط لطيف لضمان وضعه الصحيح. بعد فحص وجود فقاعات هواء داخل أو بجانب منفذ التمهيد، اسحب 20 إلى 30 ميكرولتر من السائل لإزالة الفقاعات. ثم اسحب 800 ميكرولتر من خليط التمهيدي وأدخله في منفذ التمهيدي مع تجنب فقاعات الهواء واترك الجهاز لمدة خمس دقائق.

اخلط مكتبة الحمض النووي مع الحجم المناسب من خرز المكتبة في أنبوب جديد كما هو معروض هنا. حمل 200 ميكرولتر من خليط التمهيدي في منفذ خلية التدفق. عدل غطاء منفذ العينة لكشف المنفذ.

وزع 75 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي مع خرزات في منفذ العينة قطرة تلو الأخرى، مما يسمح لكل قطرة بالامتصاص قبل إضافة التالية. ثم أعد وضع غطاء منفذ العينة وأغلق منفذ التمهيد. بمجرد إغلاق غطاء الجهاز، ابدأ عملية التسلسل.

حدد حد وقت التشغيل بناء على عدد البلازميدات التي يتم تعدد الإرسال مع الافتراضي 48 ساعة وأقصى 72 ساعة. اختر وضع الاتصال الأساسي الدقيق جدا وخيار مجموعة الباركود السريع المناسب. ثم اختر بيانات FAST5 أو POD5 الخام وابدأ استدعاء القاعدة.

لإنشاء ملف FASTQ مصفى للتجميع في مرحلة التبهي، قم بقص القراءات الطويلة باستخدام Filtlong لإزالة حوالي 5-10٪ من أدنى جودة القراءات مع الاحتفاظ بحوالي 90٪ من إجمالي العائد. Subsample يقرأ باستخدام Autocycler وفقا للإعدادات الموصى بها. قم بتجميع كل مجموعة قراءة باستخدام Raven، Flye، Kanu، Miniasm، Myloasm، NECAT، Plassembler، وغيرها من المجمعات المختارة.

تصور كل ملف رسم بياني تجميع باستخدام الضمادات. قيم الكونتيغات من حيث الدائرية، واتساق الحجم عبر المجمعات، وأدلة على وجود وصلات كيميرية. قم بإزالة الكونتيجات الخطية التي تفتقر إلى الدعم عبر عدة مجمعات واحتفظ بكونتيجيات دائرية مع تقديرات حجم متسقة.

إزالة الكونتيجات الصغيرة غير المدعومة قبل توليد الإجماع عندما تكون البلازميدات الرئيسية دائرية. تابع إلى توليد الإجماع بعد التنسيق اليدوي. توليد تسلسل الإجماع باستخدام Autocycler مع التجميعات المختارة.

نفذ أوامر الأوتوسايلر المتبقية لإنتاج تسلسل البلازميدات النهائي بالإجماع. أخيرا، قم بتحسين التجميع النهائي باستخدام قراءات طويلة مقتضبة باستخدام ميداكا لتحسين دقة الإجماع. جميع اختبارات التصريفات أنتجت ترانزواجنتس، مؤكدة وجود بلازميد مترافق في المتبرعين.

كانت أحجام تسلسلات البلازميدات المجمعة متوافقة مع التقديرات المبنية على حركة الرحلان الكهربائي الهلامي النبضي. أنتج تسلسل النانوبور مخرجا قراءة وجودة كافية لجميع العينات التي تم تحليلها. تراوحت معدلات التلوث الكروموسومي بين 72.1٪ و28.0٪ مع متوسط 46.9٪ كشف تحليل الرحلان الكهربائي الهلام النبضي لبلازميد الإجهاد UPEC_271 عن شريط يعادل بلازميدا يبلغ حوالي 145 كيلو بازي.

أظهر الحمض النووي من أحد الترانزاواجنت تسلسلا مطابقا ل 145 كيلوباز. تحليل الرحلان الكهربائي بالجل النبضي لدم الإجهاد 100913 حدد بلازميديتين بوزن حوالي 70 و110 كيلو بازي. أكد تسلسل النانو المسام وجود تجميعتين للبلازميدات مكونة من 71 و182 زوج قاعدة و111,226 زوجا قاعديا.

أهم اعتبار هو ما إذا كان تسلسل الكروموسومات محل اهتمام. إذا كان الأمر كذلك، فإن بروتوكولات تسلسل الجينوم الكامل القياسية أفضل. زيادة تغطية بروتوكولنا تفتح الباب لدراسة التغاير البلزي، أي

تباين تسلسل البلازميدات داخل مجموعة معينة.