تطوير نانوفيسيكلات مغطاة بغشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتعزيز توصيل الجينات

في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتحضير حويصلات نانوية مشتقة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية، تشبه الحويصلات خارج الخلية وتحتوي على AAVs لتحسين توصيل الجينات. نسمي هذا الحويصلات النانوية التي تحتوي على AAV CME-AAVs. مقارنة بناقل توصيل الجينات الناشئ EV-AAV، توفر CME-AAV مرونة أكبر في مصادر الخلايا وإنتاجية أعلى.

للبدء، أزل وسط الزراعة من طبق زراعة يحتوي على خلايا جذعية متوسطة الشكل البشرية عند التقاء 70 إلى 90٪. باستخدام كاشطة الخلايا، يتم فصل الخلايا من طبق الزراعة ونقلها إلى أنبوب مخروطي يحتوي على PBS. قم بالطرد المركزي على الخلايا المجمعة عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإطلاق الرياح على الخلايا.

ثم اغسل الحبيبة مرتين باستخدام PBS وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. أعد تعليق الحبيبات الخلوية الأخيرة في PBS مع مزيج مثبط للبروتيز. ثم تخضع تعليق الخلية لثلاث دورات تجميد وذوبان لتعطيل غشاء البلازما وتوليد محلل بدائي.

باستخدام ماصة، قم بتجانس الليزات بشكل كامل. ثم استخدم الطرد المركزي بوزن 1,000 جرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. انقل الفائق إلى أنبوب جديد.

الطرد المركزي عند 18,000 جرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لإزالة جزء الغشاء. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الغشاء في PBS للحصول على الجزء الخام من غشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية. الآن، قم بتجانس تعليق الغشاء عن طريق تمريره بشكل متسلسل عبر محاقن مزودة بإبر من 20 إلى 27 مقياس.

تحديد تركيز البروتين في تعليق الغشاء المتجانس باستخدام اختبار حمض البيسينشونيك. أليكوت التعليق وخزن عند ناقص 80 درجة مئوية حتى الحاجة. أعد تجانس التعليق باستخدام حقنة قياس 27 بعد كل دورة ذوبان.

اخلط تعليق الغشاء المحضر مع فيروس التغذية المرتبط بالعدين، أو AAVs، بنسبة 150 ميكروغرام من البروتين لكل واحد مضروبا في 10 إلى قوة 10 نسخ جينومية. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هز لطيف. تحميل خليط الغشاء والفيروس في جهاز صغير مزود بغشاء بولي كربونات بقطر 400 نانومتر.

مرر الخليط عبر البثق 20 مرة لتعزيز التغليف. استبدل غشاء 400 نانومتر بغشاء 200 نانومتر وكرر عملية البثق. اجمع معلق العملية الذي يحتوي على فيروس مغلف، بالإضافة إلى الفيروس غير المغلف والحويصلات الفارغة.

اجمع عدة دفعات إذا لزم الأمر، وتابع فورا إلى التنقية. قم بتخفيف محلول اليوديكسانول الأصلي ب 10 مرات PBS وماء منزوع الأيونات المعقم لتحضير محاليل بنسبة 40 و25٪. باستخدام ماصة، أضف ملليتر واحد من 40٪ يوديكسانول إلى أسفل أنبوب شفاف جدا مفتوح من الأعلى بحجم 13.2 ملليتر.

ثم، ضع ثلاثة ملليلتر من 25٪ يوديكسانول فوق طبقة 40٪ لتشكيل تدرج غير مستمر. ضع بلطف سبعة ملليلتر من التعليق المعالج على أعلى التدرج. وازن الأنابيب وحملها في دوار الطرد المركزي فوق الطردي المتحرك من دلو متأرجح.

الطرد المركزي عند 150,000 جرام لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية، باستخدام تسارع سريع وتباطؤ بطيء. ثم أزل الأنابيب بحذر دون الإخلال بالتدرج. اجمع أجزاء بحجم ملليلتر واحد من الأعلى إلى الأسفل في أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مليليتر معنونة.

احتفظ بكل الكسور على الثلج. الآن، حدد وتجميع الأجزاء السابعة والثامنة التي تحتوي على CME-AAV المنقاة في أنبوب طرد مركزي فوق مفتوح جديد. اجعل الحجم يصل إلى 11 ملليلتر باستخدام PBS.

ثم اخلط بلطف مع ماصة بسعة ملليلتر واحد. باستخدام تسارع وتباطؤ سريعين، قم بطرد مركزي للأجزاء المجمعة عند 150,000 جرام لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بحذر.

أعد تعليق الحبيبة في 50 إلى 200 ميكرولتر من PBS المعقمة، حسب التركيز المطلوب. Aliquot التحضير المنقي. ثم خزن عند 80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

تحضير حلول فعالة للفيروس المغلف ومكافحة الفيروس في PBS المعقمة. أضف نسخا جينومية متساوية من الفيروس المغلف أو فيروس التحكم مباشرة إلى وسط الزراعة في كل بئر. يشمل آبار التحكم السلبية التي تحتوي على حجم مكافئ من PBS أو جزيئات الفيروس الفارغة.

حرك اللوح بلطف لضمان توزيع منتظم وحضانه لمدة 24 إلى 72 ساعة، حسب التصميم التجريبي. بعد ذلك، استنشق وسيط الزراعة بلطف. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS دون إزاحة الكلمات.

قم بتلوين نوى الصبغ باستخدام Hoechst 33342 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إجراء تصوير فلوري بالخلايا الحية باستخدام مجهر فلوري مقلوب مع مجموعات مرشح مناسبة لتعزيز بروتين فلوري أخضر وهوشست. اختر أهدافا بمقدار 10x أو 20x للقياس الكمي، وهدف 63x للتصوير عالي الدقة إذا لزم الأمر.

اكتساب خمسة مجالات رؤية على الأقل لكل بئر، باستخدام معاملات تصوير متطابقة. احفظ جميع الصور بصيغ خام وألوان رمادية للتحليل الكمي. كشف المجهر الإلكتروني الناقل أن CME-AAV أظهرت أبعاد حجم وهياكل مرتبطة بالغشاء مشابهة للحويصلات خارج الخلية.

تم اكتشاف علامات غشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية، CD73 وCD90، في CME-AAV من خلال تحليل البقعة الغربية. تم تحديد البروتينات الثلاثة الرئيسية المرتبطة بالفيروسات الكبسيدية للأدينو، VP1 وVP2 وVP3، في CME-AAV بواسطة SDS-PAGE. أظهر تحليل النانوسايت أن CME-AAV9.

كان متوسط قطر EGFP 128.6 نانومتر وتركيز جسيمات إجمالي يبلغ 1.32 مضروبا في 10 بقوة 10 جسيمات لكل مليلتر. أظهر المجهر الفلوري أن CME-AAV9. أنتج EGFP مستوى أعلى بكثير من تعبير البروتين الفلوري الأخضر المحسز في خلايا HEK293T.

حقق الفيروس المغطى بالغشاء تعبيرا جينيا أعلى بحوالي 2.5 ضعف، مما يشير إلى زيادة في امتصاص الخلايا وربما تحسنا في حركة الخلايا داخل الخلايا. أظهر التصوير الحيوي للإضاءة الحية أن الكبد أظهر أقوى إشارة توهج بعد إعطاء CME-AAV. كشف التحليل الكمي لمناطق الكبد أن إعطاء CME-AAV أدى إلى مستويات تعبير جينية أعلى بشكل ملحوظ.

تصف هذه البروتوكولات خطوات الحصول على AAVs مغلفة بغشاء الخلية المنقي، أو CME-AAV، عبر الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة والبثق. هناك عاملان رئيسيان يتطلبان دراسة دقيقة: معالجة شظايا الخلايا مسبقة للبثق وتحسين نسبة خلط شظايا الغشاء إلى AAV للتحكم في نسبة الجسيمات إلى الجينوم بين CME-AAV. يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف غلاف غشاء الخلية لتعزيز الحماية المناعية وخصائص السطح الوظيفية، مما يحسن CME-AAV كمنصة متعددة الاستخدامات لتوصيل AAV.