تأسيس الثقافات الأولية الغنية بالمناطق من قشرة الغدة الكظرية للفأر

بحثت أبحاثي في تنظيم البيئة الدقيقة للغدة الكظرية، مع التركيز على إشارات ACM وWnt في المنطقة الكبيبة والزونة، وتمايز الحزمة اللوثية، وتطور الأورام. الطرق الحالية لا تستطيع التمييز بوضوح بين مناطق الغدة الكظرية. يثري هذا البروتوكول ZG وZF، مما يمكن من دراسة أنواع الخلايا المختلفة.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة فيزيولوجيا الأدرينوفيليا في ZG وZF، بما في ذلك تقسيم المناطق وتمايز الخلايا. لعزل الغدة الكظرية لزراعة أولية غنية بمناطق، استخدم من 10 إلى 15 فأرا ذكرا شابا، يبلغ عمرهم حوالي ستة إلى سبعة أسابيع. بعد قتل الفأر، ضعه في وضعية الديكوزيبوس الظهرية على سطح مستو معقم وتعقيم فرو الحيوان بنسبة 70٪ كحول.

باستخدام المقص، قم بعمل شق أولي في منطقة البطن الإربية. مد الشق جانبيا نحو الصدر من كلا الجانبين لكشف الصفاق. اسحب الجلد بحذر.

ثم قم بسحب عضلات البطن بلطف لكشف التجويف، مع تجنب تلف الأوعية الدموية للحفاظ على رؤية واضحة للغدد الكظرية. غير الأدوات الجراحية لتقليل التلوث الميكروبي. حدد الغدة الكظرية اليسرى الواقعة في وسط وأعلى الكلية اليسرى في خلف الصفاق ذات الشكل البيضاوي واللون الوردي محاط بأنسجة دهنية بيضاء.

باستخدام ملقط حاد، قم بإزاحة الأعضاء المجاورة بعناية لتحسين رؤية الغدة الكظرية. باستخدام المقص، قم بإزالة معظم الأنسجة الدهنية المحيطة باستخدام قص قصير متحكم به لعزل الغدة الكظرية. تجنب الإمساك المباشر بالغدة الكظرية لمنع تلف كبسولتها.

ضع الغدة الكظرية المعزولة فورا في طبق زراعة P60 يحتوي على 10 ملليلتر من وسط DMEM F-12 المسخن مسبقا حتى يتم جمع جميع العينات. بعد ذلك، حدد الغدة الكظرية اليمنى الواقعة جانبيا وأعلى الكلية اليمنى في خلف الصفاق، مع ملاحظة أن قربها من الكبد، والقولون الصاعد، والأوعية الدموية القريبة قد تجعل الرؤية أكثر صعوبة. تعامل بحذر مع الأوردة الكلوية والشرايين الكلوية لتجنب الجروح والنزيف العرضي.

بعد عزل الغدة الكظرية اليمنى، باستخدام نفس الإجراء المستخدم في الغدة الكظرية اليسرى، ضع الغدتين معا في نفس الطبق. امسح طبق الزراعة بماء 70٪ كحول قبل نقل الغدد إلى غطاء تدفق الطبق. ثم اغسل الغدد الكظرية ثلاث مرات عن طريق نقلها بشكل متسلسل عبر أطباق تحتوي على PBS عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.

بعد الغسل النهائي، اجمع وحافظ على الأنسجة المفصولة في طبق رابع يحتوي على DMEM مسخن مسبقا للحفاظ على صلاحيتها أثناء تحضير عدة غدد. انقل الغدد الكظرية إلى ورقة مرشحة للتشريح. بعد ذلك، باستخدام ملقط دقيق، أمسك الغدة الكظرية بواسطة النسيج الدهني اللاصق.

قم بتشريح الدهون على ورق الفلتر بحركات متحكم بها لتجنب تلف الكبسولة. تأكد من أن الغدة ناعمة وسليمة، وخالية من الدهون الزائدة والأنسجة الضامة. انقل الغدد الكظرية بعناية إلى ورق ترشيح جديد لتسهيل التشريح الدقيق الدقيق.

باستخدام ملقط دقيق، اضغط بلطف على كبسولة الغدة الكظرية. باستخدام شفرة المشرط، قم بعمل شق شعاعي في الغدة دون قطع الأنسجة بالكامل. اضغط ضغطا ميكانيكيا طفيفا لطرد المحتويات الداخلية للقشرة إلى الخارج عبر الشق.

كشف المادة الغدية الداخلية مع إبقاء الكبسولة والكبيبة الزونا-كبيبة متصلة بطرف الملقط. حدد المادة الغدية الداخلية المطرودة على أنها المنطقة الفاشيكولاتة والنخاع. ابدأ الهضم الإنزيمي فقط بعد معالجة جميع الغدد، لضمان الفصل الميكانيكي الصحيح للمناطق الخارجية والداخلية.

بعد الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا المجمعة في وسط الزراعة. بعد تأسيس زراعة خلايا الغدة الكظرية، قم بتوصيف جزيئي للخلايا المزروعة باستخدام تحليل التعبير الجيني وصبغ المناعة. تم تأسيس زراعة خلايا الغدة الكظرية الأولية بنجاح من الجزء الخارجي المغني لخلايا زوناجلوميرولوزيس والجزء الداخلي المغني لخلايا الحزمة الزونية.

مكن نموذج تتبع النسب من تصور تعبير mGFP الخاص بمنطقة الكبيبة الزائدة مدفوعا بمحفز Cyp11b2. لوحظ تعبير mGFP بشكل رئيسي في الثقافات الغنية بالزوناجلوميرولوزا، بينما كانت الثقافات المغنية بالزونا فاسيكولاتا تعبر بشكل أساسي عن mTomato. لوحظت مستويات تعبير نسبية أعلى ل Cyp11b2 وDab2 وSonic hedgehog في ثقافات الكسور الخارجية مقارنة بثقافات الكسور الداخلية.

أظهرت ثقافات الكسور الداخلية تعبيرا نسبيا أعلى ل Cyp11b1 وAkr1b7 مقارنة بثقافات الكسور الخارجية. كان إفراز الألدوستيرون أعلى في الثقافات الغنية بالزوناجلوميرولوزا مقارنة بالثقافات المغنية بالزونا فاسيكولاتا. في مزرعات الكسور الخارجية، زاد إفراز الألدوستيرون أكثر عند التحفيز بأنجيوتنسين II، والبوتاسيوم، وهرمون الأدرينوكورتيكوتروبيك.

كان إفراز الكورتيكوستيرون أعلى في الثقافات الغنية بالزونة الفاسيكولاتا مقارنة بالثقافات المغنية بمنطقة الكلوميرولوزا. أظهرت المزارع المغنية بالحزمة الزونية زيادة في إفراز الكورتيكوستيرون استجابة لهرمون الأدرينوكورتيكوتروبيك وتحفيز الفورسكولين. يتيح هذا البروتوكول دراسة فسيولوجيا وتمايز المناطق المحددة، بما في ذلك إنتاج الهرمونات، ومسار الإشارة، والمصفوفة خارج الخلية.

يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف آليات تقسيم الغدة الكظرية والتمايز، واستخدام هذه الخلايا لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد ودراسة تفاعلات ECM.