بروتوكول محسن لعدوى الكانديدا ألبيكانس في شميدتي البحر الأبيض المتوسط لدراسة مسببات الفطريات والدفاع عن المضيف

يركز بحثي على عدوى الكانديدا ألبكانس وكيف تؤثر استجابات المضيف على ما إذا كانت النتيجة هي التخلص من المرض أو تقدمه. التحدي الرئيسي هو نقص النماذج للعدوى الفطرية المبكرة. يستخدم هذا البروتوكول البلاناريان كحل سهل التنفيذ وعالي الإنتاجية.

يمكن النظام البلاناري دراسة بدء المرض، وتطوره، وإزالته، وفتكه، مع قياس عالي الدقة للاستجابات المناعية الفطرية. للبدء، اختر البلاناريات المتوسطية من شميدتي بطول حوالي خمسة مليمترات تحت المجهر المجسم، وتأكد من أن الحيوانات ممتدة بالكامل قبل القياس. تجنب استخدام البلاناريان الأصغر من خمسة مليمترات، فقد يشمل أفرادا يعانون من بلاستيمات أو نمو غير مكتمل قد ينتج عنه نتائج غير متسقة.

أيضا، استبعد البلانارية التي تزيد عن خمسة مليمترات، لأن الحيوانات الأكبر أقل ملاءمة للتلوين المناعي بالفلورة. استبعد الحيوانات التي لديها أورام بلاستيم، أو نسيج يفتقر إلى التصبغ، أو تطور تصبغي غير مكتمل. انقل البلاناريان الصحي الذي يفي بجميع معايير الإدراج إلى ملليلتر من ماء البلاناريين الطازج لكل بئر في طبق بوليسترين بستة آبار غير معالجة بزراعة الأنسجة.

خصص آبارا للضبطات السلبية التي تتكون من الحيوانات غير المصابة أو المعالجة الوهمية، والحيوانات المصابة بأنواع البرية من كانديدا ألبيكانس. أزل كل الماء من كل بئر واستبدله بملليتر من مياه العواصف الطازجة لضمان التساوي عبر الآبار. اسمح للحيوانات بالتوازن في البيئة الجديدة ليوم واحد قبل العدوى.

قم بإمالة لوحة الستة آبار وإزالة الماء من بئر واحد بلطف باستخدام تقنية المعقمة. أضف فورا الحجم المحسوب لماء البلاناريين وزراعة كانديدا ألبيكانس إلى البئر قبل التوجه إلى البئر التالي. سجل تاريخ ووقت التطعيم.

ضع الطبق المطعم ذو الستة آبار في مكان مظلم وثابت في درجة حرارة الغرفة. حضن البلاناريان مع كانديدا ألبيكانس لمدة تصل إلى 72 ساعة، حسب النقطة النهائية المطلوبة. في أول نقطة زمنية، بعد 24 ساعة من العدوى، قم بإمالة الصفيحة قليلا.

ثم، باستخدام ماصة نقل معقمة، استنشق السائل الذي يحتوي على زراعة كانديدا ألبيكانس ووزعه بلطف في منطقة خالية من الحيوانات لخلط طبقة الفطريات الراسخة. كرر هذه الخطوة من خمس إلى عشر مرات لكل بئر لتفكيك الطبقة الفطرية الراسخة، وتجنب الاتصال المباشر مع البلاناريان. راقب ترسيب الفطريات على خلفية داكنة قبل وبعد خطوات إعادة التعليق للحصول على أفضل رؤية.

أعد تعليق آبار التحكم غير المصابة تحت نفس الظروف. كرر هذا الإجراء بعد 48 ساعة من العدوى. بعد 72 ساعة من العدوى، انقل البلاناريات إلى آبار جديدة تحتوي على ملليلتر من الماء النظيف، مما يقلل من انتقال الفطريات باستخدام أقل كمية من السائل.

بمجرد نقل الحيوانات، قم بإزالة كل الماء واستبدله بماء بلاناري عذب. ابدأ تقييم نتائج المضيف بعد يوم واحد من الإصابة واستمر يوميا حتى نقطة التجربة المرغوبة. قم بقياس ضرر المضيف باستخدام نظام النقاط الموحد من صفر إلى ثلاثة.

بعد ثلاثة أيام من العدوى، انقل البلاناريان بلطف إلى صفيحة جديدة مكونة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر من ماء البلاناريان الطازج في كل بئر، مع تجنب نقل بقايا الزراعة الفطرية. راقب الحيوانات باستخدام المجهر الضوئي مع هدف لا يقل عن 10 أضعاف. سجل نتائج المضيف باستخدام ورقة التقييم الموحدة.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء صبغ مناعي مضاد للكانديدا لمراقبة استعمار الفطريات لظهارة المضيف أثناء العدوى والتخلص منها. انخفض استعمار الظهارة الفطرية بشكل ملحوظ بعد أربعة أيام من العدوى، وبحلول سبعة أيام من العدوى تم التخلص تقريبا من جميع الفطريات المرتبطة بالسطح تحت ظروف ID50. وظلت الضوابط غير المصابة بدون أعراض تماما.

بقوة تقارب 7.0 أضعاف 10 لقوة سبع خلايا كانديدا ألبيكانس لكل ملليلتر، حوالي 30٪ كانت بدون أعراض، و50٪ كانت أعراض، و20٪ ماتت. بقوة تقارب 8.0 أضعاف 10 لقوة سبع خلايا كانديدا ألبكانس لكل ملليلتر، حوالي 30٪ كانت بدون أعراض، و20٪ كانت أعراض، و50٪ ماتت. انخفض متوسط البقاء من حوالي 90٪ عند 7.0 مضروبة في 10 إلى قوة سبع خلايا كانديدا ألبكانس لكل ملليلتر إلى حوالي 50٪ عند 8.0 مضروبا في 10 إلى قوة سبع خلايا لكل ملليلتر، وإلى أقل من 25٪ عند 8.5 في 10 بقوة سبع خلايا لكل ملليلتر.

كان النجاة الإجمالية حوالي 50٪ في البلاناريين المصابين بكانديدا ألبيكانس البرية بنسبة تقارب 8.0 أضعاف 10 مقابل قوة سبع خلايا لكل ملليلتر، مقارنة ببقاء 100٪ في المجموعات غير المصابة. يتيح هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات المضيف والممرض في الجسم الحي من خلال دمج التصوير والأساليب الجزيئية في مضيف قابل للعلاج وراثيا. تشمل التطبيقات المستقبلية فحص الطفرات عالية الإنتاجية، ودراسات مقارنة عبر الأنواع الميكروبية، والتكيف مع السموم واختبار فعالية الأدوية.