عزل والتحقق من صحة مجموعات الخلايا الجذعية المتوسطة الإيجابية لبودوبلانين باستخدام استراتيجية خرز مغناطيسي غير مباشر

ركز بحثنا على عزل مجموعة محددة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتليين الخرزات المغناطيسية ذات نقاء ووضوح عالي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي بروتين غشائي باستخدام الأجسام المضادة المترافقة القياسية ل PE. للبدء، اجمع المواد الكيميائية المطلوبة.

اختر الخلايا الجذعية المتوسطة الميزنشيمية، أو MSCs، من الممرات الثالثة إلى الخامسة التي وصلت إلى التقاء بنسبة 80 إلى 90٪. تخلص من وسيط الثقافة. اغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من PBS المسخن مسبقا.

هز الوعاء بلطف وتخلص من PBS. أضف ملليلترين من 0.25٪ تريبسين-إيدتا وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. تحت المجهر، راقب الخلايا حتى تتجمع للأعلى وتبدأ في الانفصال.

أضف أربعة ملليلتر من وسط الزراعة يحتوي على 16.5٪ FBS لتعادلية التربسين. قم بعمل ماصة بلطف على الخلايا لضمان الانفصال الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 ملليتر. قم بعمل جهاز تعليق الخلية بقوة 300 جرام لمدة ثلاث دقائق وتخلص من السوبرناتانت.

أعد تعليق حبيبة الخلية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت (buffer). عد الخلايا لتحديد العدد الكلي للخلية. قم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الفائقة كما تم إثبات سابقا.

أعد تعليق الخلايا باستخدام المخزن لتحقيق كثافة تصل إلى 100 مليون خلية لكل ملليلتر. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب بوليسترين دائري قاع بسعة خمسة مليليتر. أضف 10 ميكرولتر من حاصر Fc غاما RII لكل 10 ملايين خلية.

اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف خمسة ميكرولترات من الجسم المضاد المضاد للفيكوإيريثرين أو المرافق ب PE أو PDPN المضاد لكل 10 ملايين خلية. اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة محميا من الضوء.

أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الانتقاء لكل 10 ملايين خلية. اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استخدم خلاط الدوامة لخلط قارورة الخرزات المغناطيسية بقوة لمدة 30 ثانية.

أضف خمسة ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية لكل 10 ملايين خلية. اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ضع أنبوب البوليسترين ذو القاع المستدير بسعة خمسة مليليتر الذي يحتوي على عينة الخلية الموسومة في حامل الفصل المغناطيسي.

أضف الأنبوب لرفع الحجم الكلي إلى 2.5 إلى 3 مليلتر. واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عند تثبيت المغناطيس والأنبوب معا كوحدة واحدة، قلبهما لصب المادة الفائقة في أنبوب تجميع جديد.

ضع الجزء الخلوي السالب المجمع من PDPN على الثلج. كرر عملية الفصل المغناطيسي ثلاث مرات كما تم شرحها سابقا، مع صب المادة الفائقة في نفس أنبوب جمع الكسور السالبة PDPN بعد كل فصل. بعد الغسل النهائي، قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على جزء الخلية الموجب المرتبط مغناطيسيا من حامل الفصل المغناطيسي.

أضف ثلاثة ملليتر من المخزن لإعادة تعليق الخلايا الإيجابية. انقل تعليق خلية الكسر الموجب إلى أنبوب جديد معلم. عد الخلايا من أنبوبي الكسور الموجبة والسالبة.

سجل عائد الخلية لكل جزء. قم بطرد المركزي بتعليق الخلايا الموجبة بنسبة 300 جرام لمدة ثلاث دقائق ثم تخلص من السوبرناتان. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط مزرعة ألفا MEM يحتوي على 16.5٪ FBS.

قم بضبط كثافة الخلايا حسب الحاجة وازرع الخلايا في ألواح أو قوارير مزرعة. حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد عد الخلايا، قم بزراعتها على طبق زراعة بحجم 100 ملم بكثافة ثلاثة ملايين خلية لكل طبق في وسط زراعة بسعة 12 ملليتر.

بعد 24 ساعة من البذر، راقب التصاق الخلايا. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد لإزالة الخرزات المغناطيسية المتبقية والخلايا غير الالتصقة. احصد الخلايا عن طريق التريبسين.

قم بعمل ماصة بلطف لأعلى وأسفل التعليق الخلوي من 10 إلى 15 مرة لإزالة وإزالة الخرزات المغناطيسية والأجسام المضادة المتبقية. تقييم نسبة الخلايا الإيجابية ل PDPN PE من خلال قياس تدفق الخلية. اجمع الخلايا خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي.

زرع الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئرا. في أوقات مختلفة، أضف مجموعة عد الخلايا 8m أو CCK-8، وكاشف، وقيس الامتصاص حسب تعليمات الشركة المصنعة. قم بجدول بيانات الترتيب المسبق وبعد الفرز لنقاط زمنية مختلفة في برنامج GraphPad Prism، ثم انقر على البيانات لرسم منحنى الانتشار.

بعد حجب مستقبلات FC، ووضع علامات الأجسام المضادة، والفصل المغناطيسي، بلغ العدد النهائي للخلايا حوالي 3.5 مليون خلية للجزء الإيجابي ل PDPN و6.4 مليون خلية للجزء السالب في PDPN. قبل الفرز المغناطيسي، كان تكرار الخلايا الموجبة في PDPN في المجموعة الأولى من الخلايا 38.7٪، بعد الفرز، كان النسبة الإيجابية تحتوي على 97.9٪ من خلايا PDPN الإيجابية PE. كشف تحليل التدفق الخلوي للجزء السالب أن 4.30٪ من خلايا PDPN الإيجابية بقيت، مما يشير إلى استنزاف فعال لخلايا PDPN الإيجابية من الجزء السالب.

لم يظهر منحنى تكاثر الخلايا الإيجابية ل PDPN خلال ثلاثة أيام متتالية من الزراعة فرقا ذا دلالة إحصائية مقارنة بالخلايا الجينية الصلبة غير المفترضة، مما يشير إلى أن استراتيجية الفرز لم تسبب انخفاضا ملحوظا في التكاثر أو النشاط الأيضي القائم على CCK-8 مقارنة بالخلايا العضلية الصلبة غير المفترضة. يتيح هذا النهج للأبحاث دراسة السكان الفرعيين ذوي النقاء العالي وسهولة القراءة. أهم اعتبار في هذا البروتوكول هو الحفاظ على وضوح قراءة الخلية وإزالة الخرزات غير المربوطة.

اتبع هذا الإجراء، يمكن للأبحاث إجراء اختبارات الانتشار، ومتابعة دراسات الرواسب والانكماش.