سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

الميتوكوندريا لها أدوار عديدة في فسيولوجيا الخلية من التمثيل الغذائي وإنتاج الطاقة لبرمجة موت الخلايا إلى تخليق هرمون الستيرويد. على الرغم من أهمية الميتوكوندريا في كل من الوظائف الخلوية الأساسية والمرض ، لا يعرف سوى القليل جدا عن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وذريتها المتمايزة. في هذا الفيديو ، سنوضح لك كيف يمكن تحليل مجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا لخلايا الأميري الجذعية البشرية باستخدام فحوصات نشاط إنجل.

مرحبا ، أنا إيفان OV من مختبر مايكل تيتيل في قسم علم الأمراض والطب المخبري بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. سنعرض لك اليوم إجراء لتقييم وظيفة المركب التنفسي للميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. هذه في نشاط الهلام تقييم هذا الإجراء ينطوي على عزل الحنك الخام للميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وفصل مجمعات الميتوكوندريا لنظام الفسفرة النضحية مع دقة أعلى واضحة واضحة من هلام بولي أكريلاميد الأصلي ، وما يليها في نشاط الهلام sa.

لذلك دعونا نبدأ. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. في هذا الاختبار ، سنستخدم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي نمت على صفيحة مغطاة ب matrigel في حالة خالية من التغذية.

من أجل جمع الميتوكوندريا من خلايا العرق البشرية ، نبدأ بغسلها بدرجة حموضة XPDS دافئة 7.4 ، ثم التربسين الخلايا لمدة خمس دقائق. يمكنك استخدام مل واحد من التربسين لكل بئر في طبق مكون من ستة آبار. بعد خمس دقائق ، يمكنك إيقاف التفاعل عن طريق إضافة كمية متساوية من مثبط التربسين الطازج ملليغرام واحد لكل مل في XPBS وحصاد الخلايا.

يتم الطرد المركزي للخلايا المجمعة عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغزل ، تخلص من المادة الطافية والمقاومة ، الخلايا المحببة في 0.8 إلى 1.7 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا المثلجة مع كوكتيل طازج من مثبط البروتياز x واحد. يعتمد مقدار المخزن المؤقت الذي تستخدمه على حجم حبيبات الخلية التي تحصل عليها بعد إعادة تعليق الحبيبات ، احتضنها على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد الحضانة على الخلايا باستخدام الخالط ، قد يستغرق ذلك حوالي 40 إلى 50 ضربة. يمكننا التحقق من القائمة الكاملة للتجانس عن طريق تلطيخ جزء من خلايا DOD باللون الأزرق الثلاثي والنظر من خلال المجهر الضوئي. يجب أن تبدو مثل هذا.

هذه هي اللقطة الأولى بعد 50 ضربة مع هبوط. هذه هي اللقطة الثانية بعد 80 ضربة مع هبوط. بمجرد أن يتم تجانس الخلايا ، قم بطردها عند 20 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وهذا سيعطينا حبيبات الميتوكوندريا الخام ، والتي ستحتوي أيضا على نوى وشظايا خلايا أكبر.

قبل جمع الحبيبات, علينا أن نزن أنبوب التجميع من أجل تقدير وزن الحبيبات اللاحق, صب المادة الطافية والتخلص منها, ثم وزن حبيبات الميتوكوندريا الخام المترسبة. عن طريق طرح وزن الأنبوب في هذه المرحلة ، يمكن للمرء المضي قدما في إذابة الحبيبات ، والتي ستظهر في الخطوة التالية. من أجل إذابة حبيبات الميتوكوندريا الخام ، نبدأ بإبقاء الحبيبات على الجليد والدوامة مع 35 ميكرولتر من محلول الذوبان البارد المثلج.

لكل 20 ملليغرام من الحبيبات لدينا معلومات مفصلة عن المركبات العازلة مذكورة في البروتوكول المكتوب المصاحب. بعد الدوامة وإضافة المخزن المؤقت للذوبان وقبل إضافة الرقم ، نقوم بنقل الحبيبات المعلقة إلى أنبوب مناسب للطرد المركزي عالي السرعة ، ثم نضيف 20 ميكرولتر من الوزن البالغ 10٪ لكل رقم الحجم ل 20 ملليغرام من وزن الحبيبات ونخلط عن طريق تحريك الأنبوب بعد خلطه جيدا ، واحتضان حبيبات الميتوكوندريا لمدة خمس إلى 10 دقائق على الجليد. يمكن استبدال Doil beta D متعدد الجوانب أو DDM أو Triton X 100 باللون الرقمي للبروتينات القابلة للذوبان.

قد يؤثر اختيار المنظف وكميته على تكوين المجمعات فوق الكمية أو الأشكال متعددة المجمعات من مجمعات الميتوكوندريا بعد الحضانة على الجليد. وبمجرد إذابة الحبيبات، سنقوم بطردها بمقدار مائة ألف مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية، ثم نجمع المادة الطافية الصافية. نحن الآن على استعداد لإعداد المادة الطافية للتشغيل على جل التدرج الخاص بنا للرحلان الكهربائي للهلام المتدرج الأصلي للميتوكوندريا.

نوصي باستخدام جل متدرج أكريلاميد من خمسة إلى 13٪ مع جل تكديس بنسبة 3.5٪. لتحضير الجل ، سنستخدم مزيج أكريلاميد مكرر أكريلاميد كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يتم تحضير محلول أكريلاميد مكرر الأكريلاميد مسبقا وتخزينه عند أربع درجات مئوية في مكان مظلم.

مادة الأكريلاميد ومكرر الأكريلاميد هي مواد كيميائية سامة كمسحوق وفي شكل سائل ، لذلك يجب إيلاء اهتمام خاص عند العمل معها. نحن نجمع بين محلول أكريلاميد مكرر أكريلاميد مع حصة من ثلاثة × هلام عازلة تتكون من 1.5 مولار ستة حمض أمينو سداسي نويك ، و 75 مليمولار أولي عند الرقم الهيدروجيني 7.0. تعتمد كمية محلول الأكريلاميد مكرر الأكريلاميد الذي نضيفه إلى المخزن المؤقت على النسبة المئوية للهلام الذي نصنعه لصنع هلام التدرج.

سنصنع مزيجا واحدا بنسبة 4٪ ومزيج 13٪ ، وسيكون جل التكديس مزيجا بنسبة 3.5٪. لا تنس إضافة الجلسرين إلى مزيج 13٪. عندما تكون جميع الخلائط الثلاثة جاهزة ، نضيف كمية مناسبة من الأمونيوم لكل كبريتات وتميد إلى الخلائط ونسكب الخلائط في غرفة صب سابقة متدرجة.

الجزء الأيسر من الغرفة على مزيج 5٪. يحتوي الجزء الأيمن من الغرفة على مزيج 13٪ في شريط تحريك مغناطيسي صغير. نبدأ في صب الجل عن طريق فتح الجزء الأيمن من الغرفة.

ثم نفتح على الفور الجزء الأيسر من الغرفة ونترك محلول 5٪ يختلط بمحلول 13٪ لعمل التدرج. نضيف كمية صغيرة من الأيزوبروبانول إلى الجزء العلوي من الجل لتشكيل حدود مستقيمة حادة للهلام بعد البلمرة. بعد ساعة واحدة تقريبا عند اكتمال بلمرة هلام التدرج ، نزيل الأيزوبروبانول ونسكب جل التراص 3.5 في الجهاز وندخل مشط جل.

سنقوم بتجميع المواد الهلامية وتشغيلها في غرفة باردة تتراوح درجة حرارتها من أربع إلى سبع درجات مئوية. لتشغيل هذا الجل ، سنستخدم مخازن مؤقتة مختلفة. في حجرة الأنود، سنستخدم حاجزا يحتوي على 25 مللي مولار من حمض الهيدروكلوريك الأس الهيدروكلوريك 7.0.

سيحتوي المخزن المؤقت للكاثود على 50 ملم تراك ، 7.5 مليمولار أولي حمض الهيدروكلوريك ، 0.02٪ الوزن لكل حجم ، زيت بيتا D متعدد الجوانب أو DDM و 0.05٪ من الوزن إلى الحجم ، درجة الحموضة deoxy coate 7.0. من أجل تحضير المادة الطافية ليتم تشغيلها في الجل الذي سكبناه للتو ، تتم إضافة المخزن المؤقت للتحميل لإنتاج تركيز نهائي يبلغ 5٪ من الوزن إلى حجم الجلسرين و 0.01٪ من الوزن إلى الحجم. Ponto S ، نضيف عادة محلول مخزون 10 × يحتوي على الجلسرين والمعطف مباشرة إلى المواد الطافية

نحن الآن جاهزون لتحميل عينة الجل على الجل. سنقوم بتحميل آبار الجل بحجم يحتوي على 20 إلى 40 ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا الخام لكل حارة. مباشرة بعد التحميل ، يتم تشغيل الجل عند 100 فولت.

بمجرد دخول العينة إلى هلام التكديس ، يمكن رفع الجهد إلى 500 فولت مع اقتصار التيار على 15 مللي أمبير. على الرغم من أننا عادة ما نقوم بتشغيل الجل طوال الليل عند 70 إلى 100 فولت ، إلا أننا نوقف الرحلان الكهربائي عندما يقترب خط حاد من صبغة zos الحمراء من مقدمة الجل. الآن بعد أن تم تشغيل الجل ، يمكننا تحليل نشاط مجمعات البروتين المختلفة مباشرة في الجل.

وقت الحضانة لكل اختبار على كفاءة إذابة البروتين وكمية المواد المحملة لكل بئر. عادة ما تنتج المجمعات الأول والرابع والخامس إشارات أقوى من المجمعات الثانية والثالثة. هذا هو السبب في أن وقت تلطيخ المجمعين الثاني والثالث يجب أن يكون أطول.

لاختبار النشاط المعقد ، سنحتاج إلى استخدام مخازن مؤقتة محددة لكل مجمع. يمكنك العثور على مكونات المخازن المؤقتة الفردية في البروتوكول المكتوب. الآن سنقوم بقطع الممرات الفردية للهلام لإجراء فحوصات نشاط Ingel بشكل منفصل.

بالنسبة لجميع المجمعات ، احتضن شريحة الجل في المخازن المؤقتة الخاصة بها لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة لجميع المجمعات باستثناء المركب الخمس. بعد الحضانة ، قم بتثبيت الجل في 50٪ ميثانول و 10٪ حمض الأسيتيك لمدة 15 إلى 45 دقيقة. يتم حفظ الجل الثابت في حمض الخليك بنسبة 10٪.

ترى هنا كيف يظهر تلطيخ المعقد. يوجد شريط أرجواني غامق واحد في شريحة الجل يتوافق مع الشريط المعقد. تتيح لك المواد الهلامية الشفافة إجراء قياس الكثافة من الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا وإجراء تحليلات مقارنة.

بعد القياس الخلوي الكثيف ، عادة ما نقوم بتجفيف شرائح الجل للتخزين طويل الأجل و / أو للمسح الضوئي من أجل الحصول على مركب صورة عالي الجودة ، بقعتان بنفس اللون الأرجواني مثل مركب واحد ثلاثة ومركب أربعة. كلاهما يعطي شريط تلطيخ برتقالي أو مصفر. فيما يلي أمثلة على أنشطة تلطيخ معقدة اثنين وثلاثة وأربعة

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحليل نشاط مجمعات النضح الميتوكوندريا ، والتي تم استخراجها من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وفصلها بدقة أعلى ، بما في ذلك إلكتريكات الهلام الأصلية. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.