توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

منذ أكثر من 50 عاماً، وُضعت فرضية مفادها أن الخلايا المتمايزة نهائياً، مثل الخلايا الليفية الجلدية، يمكن إجبارها على اتخاذ حالة متعددة القدرات تشبه الخلايا الجذعية الجنينية. واستند هذا المفهوم إلى ملاحظة أن جميع أنواع الخلايا، مع وجود استثناءات طفيفة، تمتلك الشفرة الوراثية نفسها، وأن الفرق الوحيد بين أنواع الخلايا يكمن في كيفية قراءة هذه الشفرة. وتُسمى هذه القدرة على تغيير الهوية الخلوية لخلية متمايزة إلى حالة متعددة القدرات بإعادة البرمجة الخلوية.

بعد نصف عقد من الأبحاث، تبيّن مؤخراً أن التعبير القسري لأربعة عوامل نسخ يمكن أن يعيد برمجة الأرومات الليفية الجلدية لتصبح متعددة القدرات. إن تأثير هذا الاكتشاف هائل؛ فبعيداً عن أهميته في علم الأحياء الأساسي، فإنه يتجاوز أيضاً الاعتراضات الأخلاقية الرئيسية على استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في العلاج بالزراعة.

من أجل حدوث عملية إعادة البرمجة، يجب تغليف أربعة جينات تشفر عوامل النسخ Oct4 وSox2 وKlf4 وc-Myc ووضعها في ناقل فيروسي لينتي (lentivirus). ثم يُضاف وسط زراعة أنسجة يحتوي على الفيروس المُنقى إلى طبق زراعة خلوية يحتوي على كثافة عالية من الخلايا الليفية، وفي هذا الطبق، يحدث أمر مذهل؛ حيث يصاب جزء صغير من الخلايا الليفية بجميع الفيروسات الأربعة الحاملة لعوامل النسخ وتبدأ في فقدان تمايزها.

تخضع هذه الخلايا لتغيرات جذرية في شكلها وتكاثرها، وتبدأ في الانقسام لتشكل تجمعات كروية كبيرة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. وبعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الزرع في ظروف الخلايا الجذعية الجنينية، يمكن عزل مستعمرات الخلايا الليفية المعاد برمجتها يدويًا وإكثارها في المختبر. وبمجرد تنقيتها، يمكن استخدام هذه الخلايا لتوليد فئران خيمرية، حيث تساهم نسبة معينة من الخلايا المشتقة من تلك الخلايا الليفية منزوعة التمايز في تكوين أنسجة مختلفة في الفأر.

في الحالات التي تساهم فيها المادة الوراثية للخلايا الليفية الأصلية في الخط الجرثومي، يتم نقل الشفرة الوراثية إلى الجيل التالي ثم الذي يليه والذي يليه. وعلى الرغم من أن استخدام نظام توصيل فيروسي يشكل حالياً عائقاً أمام التطبيقات السريرية، فمن المرجح التغلب على ذلك في وقت قريب. في هذا الفيديو، سيقوم أعضاء مختبر yin بتوضيح كيفية اشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

مرحباً، أنا جرانت ويلتد من مختبر رودولف جيش في معهد وايت هيد للأبحاث الطبية الحيوية في كامبريدج، ماساتشوستس. وأنا توبياس بروبرينك، أيضاً من مختبر جيش. سنعرض لكم اليوم كيفية توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات عن طريق إدخال أربعة CDNAs وهي OCT four وSOX two وCIC وKF four باستخدام الفيروسات البطيئة التي تعبر عن هذه الـ CDNAs الأربعة من محفز Tet OCMV.

يتيح ذلك التحكم الدقيق في تعبير هذه الجينات المنقولة الأربعة بعد إصابة الخلايا الليفية الجنينية للفأر. يتضمن البروتوكول الذي نعرضه لكم اليوم التعامل مع فيروسات لينتيفيروس (lentivirus) التي يمكن أن تصيب الخلايا البشرية. ومن الضروري اتباع إجراءات السلامة دائمًا والتواصل مع مكتب السلامة لديكم قبل محاولة القيام بذلك بأنفسكم.

دعونا نقوم بإنتاج خلايا IPS من أجل توليد فيروسات لينتيفيروس (lentivirus) ستقوم بتحويل الخلايا المتوسطة (mes) إلى خلايا IPS. يجب ترانسفكشن (transfection) خلايا 2 9 3 بثلاثة بلازميدات: Paks two، والذي يوفر العناصر الجينية المطلوبة للتعبئة الفيروسية؛ والعمود الفقري الفيروسي، وهو عبارة عن فيروس لينتيفيروس FUW TE OCMV مع واحد من أربعة CD aids T four SOX two أو KLA four أو CMIC PMDG؛ والذي يعبر عن البروتين السكري الغلافي لفيروس التهاب الفم الحويصلي (vesicular stomatitis virus) أو VSV.

يؤدي ذلك إلى تكوين الفيروس الذي سينتج الفيروس الضامر. لذا، يجب اتباع إجراءات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية المطور (BL2+) بدقة. في هذا الفيديو تحديداً، لا نتعامل فعلياً مع فيروسات معدية، لذا لا نرتدي المآزر المعتادة ولسنا متواجدين في مرفق المستوى الثاني من السلامة البيولوجية المطور.

قبل عملية عفن الخلية (transfection)، يتم إذابة خلايا 2, 9 3 من النيتروجين السائل وزراعتها حتى تصل كثافتها إلى 90% من المساحة المتاحة (confluency). بعد ذلك، يتم عفن الخلايا باستخدام جين FU وتُترك لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة للتعبير عن الفيروس، وعند هذه النقطة يتم ترشيح الوسط المغذي للخلايا باستخدام مرشح بمسامية 0.45 ميكرون وتركيزه باستخدام الطرد المركزي الفائق. بعد تركيز الفيروس، نصبح مستعدين الآن لإصابة خلايا MES من أجل توليد تجمعات IPS. خلال خطوات تحضير الفيروس، يتم زراعة أرومات ليفية جنينية للفئران (mouse embryonic fibroblasts) لم تتجاوز ثلاثة ممرات زراعية (passages) حتى تصل كثافتها إلى 90% في أطباق قطرها 10 سنتيمتر، بمعدل حوالي 2 × 10⁶ خلية لكل طبق. في هذا البروتوكول التجريبي المحدد، نستخدم خلايا MES التي تعبر عن RTTA، وهو أمر ضروري للتعبير عن doxycycline وGFP من موقع OC four الداخلي.

تكون خلايا MES سالبة لبروتين GFP، بينما تصبح خلايا IPS الحقيقية موجبة لبروتين GFP. يتيح هذا الواسم طريقة لتحديد الخلايا المتوسطة المعاد برمجتها؛ يتم سحب وسط الزرع من الخلايا الليفية والغسل بـ 10 mils من hippies, EDTA، ثم التخلص من hippies EDTA وإضافة خمس mils من trypsin بتركيز one times والتحضين عند 37 درجة لمدة 10 دقائق. سيساعد trypsin في فصل الخلايا عن قاع الأطباق.

أضف الآن 9 mL من وسط الزرع لإعادة تعليق الخلايا في معلق خلوي مفرد، ثم انقلها إلى أنبوب سعة 15 mL. بعد ذلك، يتم تدوير هذه الخلايا بالطرد المركزي لترسيبها. وبعد إعادة تعليق الراسب، يتم عد عدد الخلايا في المعلق وضبط التركيز ليكون 8 × 10⁴ خلية لكل mL.

يتم بعد ذلك نقل 10 mL من معلق الخلايا إلى طبق قطر 10 cm مغلف بالجيلاتين. تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 °C و5% CO2. بعد فترة التحضين الليلي، يتم سحب الوسط من طبق الخلايا الليفية (fibroblast) وإضافة 10 mL من الوسط المحتوي على الفيروس إلى الطبق. تُحضن الخلايا لمدة تتراوح من أربع ساعات إلى ليلة كاملة عند 37 °C و5% CO2.

في اليوم التالي، يتم سحب الوسط من طبق الخلايا الليفية (fibroblast dish)، ثم إضافة 10 mils من وسط ESL الطازج. في هذه المرحلة، يمكن تجميد الخلايا، أو توسيعها، أو تحضيرها لبدء عملية إعادة البرمجة. ولبدء إعادة البرمجة، يتم استبدال وسط ESL العادي بوسط يحتوي على doxycycline لتحفيز تعبير الجينات الأربعة.

ضع هذه الخلايا في الحاضنة وقم بتغيير الوسط يومياً حتى تصبح المستعمرات كبيرة بما يكفي ليتم التقاطها. يجب أن تصبح المستعمرات مرئية لأول مرة بعد حوالي أسبوع من بدء عملية إعادة البرمجة، على أن تصبح كبيرة بما يكفي لالتقاطها في اليوم 20 تقريباً.

بعد مرور 20 يوماً، يمكننا البدء في التقاط مستعمرات IPS قبل البدء في عملية التقاط المستعمرات. يجب تذكر توفير العدد المطلوب من أطباق الـ 24 بئراً المطلية بالجيلاتين والمحضرة بـ gamma irradiated DR قبل ساعة إلى ساعتين من عملية التقاط المستعمرات. يجب تغذية المستعمرات الموجودة في الأطباق عن طريق إضافة وسط غذائي طازج قبيل عملية الالتقاط مباشرة، ثم إضافة 50 µL من HEPA buffer إلى آبار طبق 96 بئراً ذي قاع على شكل حرف V قبل الالتقاط مباشرة. يُغسل الطبق الذي يحتوي على المستعمرات المراد التقاطها مرة واحدة باستخدام PBS، ثم يُضاف 10 mL من PBS إلى الطبق. يمكن التقاط تجمعات خلايا IPS باستخدام مجهر ستيريو أو مجهر مقلوب.

التقط المستعمرات باستخدام طرف ماصة صغير وانقلها إلى بئر في طبق مكون من 96 بئراً يحتوي على PBS من أجل إزالة التكتلات. يتم رسم دائرة بطرف الماصة حول التكتل لتفكيك الكتل. الآن يمكن استخلاص الخلايا المعاد برمجهتها باستخدام الماصة متعددة القنوات، مع إضافة 20 microliters من tripsin إلى كل منها.

يتم سحب السائل ودفعه بالماصة للأعلى والأسفل ثلاث مرات، ثم يُحضن عند 37 °C لمدة أربع دقائق. بعد فترة التحضين التي تستغرق أربع دقائق، يُضاف 100 µL من وسط ES إلى مستعمرات tripps nice. يتم سحب السائل ودفعه بالماصة للأعلى والأسفل 10 مرات، ثم تُنقل ست مستعمرات في المرة الواحدة.

من طبق ذي 96 بئرًا إلى طبق ذي 24 بئرًا، وباستخدام رأس ماصة في كل وضع بديل في الماصة ذات الـ 12 قناة، تُزرع الخلايا بعد ذلك في طبق الـ 24 بئرًا داخل حاضنة عند 37 °C و 5% CO2 حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80 إلى 90%، مع تزويدها بوسط زراعة خلايا ES. ستكون الخلايا جاهزة للتوسع على الأرجح في غضون ثلاثة إلى سبعة أيام. بعد بضعة أيام، وعندما تصبح خلايا IPS متلاقية، يتم سحب الوسط وغسل الخلايا بـ 1 mL من PBS. يُزال PBS تمامًا ويُضاف 100 µL من trypsin بتركيز 1× وتُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة 10 دقائق. بعد التحضين مع trypsin، يُضاف 400 µL من وسط ESL وتُعلّق الخلايا عن طريق السحب والضخ بالماصة لإنتاج معلق من الخلايا المفردة.

يُنقل بعد ذلك معلق الخلايا المفردة بحجم 500 µL من الطبق ذي الـ 24 بئراً إلى بئر واحد من طبق ذي ستة آبار، ويُحضن في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C و5% CO2 حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80 إلى 90% في الطبق ذي الستة آبار. عند هذه النقطة، يمكنك إما البدء بتكثير الخلايا من أجل تحليل Southern، أو لصنع الأرومات، أو عمليات الحقن، أو فحوصات المسخ، أو فحوصات التمايز في المختبر. ويجب أن تتذكر تجميد مخزونات احتياطية من هذه الخلايا حتى لا تفقد هذا المخزون الثمين من خلايا IPS.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية تحفيز تعدد القدرات في الخلايا الليفية الجنينية للفأر باستخدام نظام مضاد للفيروسات قابل للتحفيز. نشكركم على المشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.