توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

منذ أكثر من 50 عاما ، كان من المفترض أن الخلايا المتمايزة نهائيا مثل الخلايا الليفية الجلدية يمكن أن تضطر إلى اتخاذ حالة متعددة القدرات مشابهة للخلايا الجذعية الجنينية. كان أساس هذا المفهوم هو ملاحظة أن جميع أنواع الخلايا مع بعض الاستثناءات الطفيفة ، لها نفس الشفرة الجينية وأن الاختلاف الوحيد بين أنواع الخلايا هو كيفية قراءة الشفرة. تسمى هذه القدرة على تغيير الهوية الخلوية لخلية متمايزة إلى حالة متعددة القدرات إعادة البرمجة الخلوية.

بعد نصف عقد من البحث ، تبين مؤخرا أن التعبير القسري لأربعة عوامل نسخ يمكن أن يعيد برمجة الخلايا الليفية الجلدية لتصبح متعددة القدرات. تأثير هذه النتيجة هائل. بالإضافة إلى أهمية علم الأحياء الأساسي ، فإنه يتغلب أيضا على الاعتراضات الأخلاقية الرئيسية على استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لعلاج الزرع.

من أجل إعادة البرمجة ، يجب تعبئة أربعة جينات تشفر عوامل النسخ OC four و sox two و cmic و K four ووضعها في ثقافة أنسجة الفيروس العدسي. ثم يضاف الفيروس المنقى الذي يحتوي على وسيط إلى طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على كثافة عالية من الخلايا الليفية ، وداخل هذا الطبق ، يحدث شيء مذهل. يصاب جزء صغير من الخلايا الليفية بجميع عوامل النسخ الأربعة التي تحمل الفيروسات وتبدأ في التمايز.

يخضعون لتغييرات جذرية في مورفولوجيتهم وتكاثرهم ويبدأون في الانقسام إلى مجموعات روحية كبيرة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المتكونة. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الزراعة في ظروف الخلايا الجذعية الجنينية ، يمكن عزل مستعمرات الخلايا الليفية المعاد برمجتها يدويا وتوسيعها في المختبر. بمجرد تنقيتها ، يمكن استخدام هذه الخلايا لتوليد الفئران الوهمية التي يمكن أن تساهم فيها نسبة معينة من الخلايا المستمدة من تلك الخلايا الليفية المتمايزة في أنسجة مختلفة من الفأر.

في الدقات التي ساهمت فيها المادة الوراثية للأرومات الليفية الأصلية في السلالة الجرثومية ، يتم تمرير الشفرة الجينية إلى الجيل التالي ثم الجيل التالي ثم التالي. على الرغم من أن استخدام نظام توصيل الفيروس يمثل حاليا عائقا أمام التطبيقات السريرية ، فمن المحتمل أن يتم التغلب على ذلك في وقت قصير. في هذا الفيديو ، سيوضح أعضاء مختبر يين كيف يتم اشتقاق الخلايا الجذعية القوية المستحثة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

مرحبا ، أنا جرانت ويلتد من مختبر رودولف جيش في معهد وايتهيد للأبحاث الطبية الحيوية في كامبريدج ، ماساتشوستس. وأنا توبياس إخوان برينك أيضا من مختبر عش. سنعرض لك اليوم توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من خلال إدخال أربعة CDNAs OCT أربعة SOX واثنين CIC KF أربعة باستخدام فيروسات العدسات التي تعبر عن هذه CDNAs الأربعة من مروج Tet OCMV.

هذا يسمح بالتحكم الدقيق في التعبير عن هذه الجينات الأربعة المعدلة وراثيا بعد إصابة الخلايا الليفية الجنينية للفأر. يتضمن البروتوكول الذي نعرضه لكم اليوم التعامل مع فيروس العدسات الذي يمكن أن يصيب الخلايا البشرية. من الأهمية بمكان أن تتبع دائما الإجراءات الآمنة وأن تتصل بمكتب السلامة الخاص بك قبل محاولة القيام بذلك بنفسك.

لذلك دعونا ننشئ بعض خلايا IPS من أجل توليد فيروس عدسي يحول mes إلى خلايا IPS. يجب نقل 2 9 3 خلايا بثلاثة بلازميدات Paks two ، والتي توفر العناصر الجينية المطلوبة للتغليف الفيروسي. العمود الفقري الفيروسي ، وهو فيروس عدسي FUW TE OCMV مع أحد الأقراص المضغوطة الأربعة T four SOX two أو KLA four أو CMIC PMDG ، والذي يعبر عن البروتين السكري المغلف لفيروس التهاب الفم الحويصلي أو VSV.

هذا يجعل الفيروس الذي سيولد فيروسا متروبا. لذلك يجب اتباع إجراءات BL الصحيحة اثنين زائد. في هذا الفيديو بالذات ، نحن لا نتعامل فعليا مع الفيروسات المعدية ، لذلك نحن لا نرتدي عباءاتنا النموذجية ولسنا في منشأة BL two plus.

قبل التعداء 2 ، يتم إذابة 9 3 خلايا من النيتروجين السائل وتنمو إلى 90٪ من خلايا الطلاقة المشتركة ثم يتم نقلها بجين FU وإعطائها 48 إلى 72 ساعة للتعبير عن الفيروس ، وفي ذلك الوقت يتم ترشيح وسط الاستحمام للخلايا باستخدام مرشح 0.45 ميكرون وتركيزه باستخدام الطرد المركزي الفائق بعد تركيز الفيروس. نحن الآن مستعدون لإصابة MES من أجل توليد مجموعات IPS أثناء خطوات التحضير الفيروسي ، يتم نمو مرور الخلايا الليفية الجنينية للفأر أقل من ثلاث مرات إلى 90٪ من الطلاقة المشتركة في أطباق 10 سم ، أي ما يقرب من مرتين في 10 خلايا إلى الخلايا الست لكل طبق. في هذا البروتوكول التجريبي بالذات ، نستخدم MES الذي يعبر عن RTTA ، وهو أمر بالغ الأهمية لتعبير الدوكسيسيكلين و GFP من موضع OC الأربعة الداخلي.

MES سلبية GFP ، لكن خلايا IPS الحقيقية تصبح إيجابية GFP. تسمح هذه العلامة بطريقة يمكن من خلالها تحديد mes المعاد برمجتها ، واستنشاق وسط الثقافة من الخلايا الليفية وغسلها ب 10 ميل من الهيبيين ، EDTA ، والتخلص من الهيبيين EDTA وإضافة خمسة ميل من التربسين مرة واحدة واحتضانها عند 37 درجة لمدة 10 دقائق. سوف يساعد التربسين في رفع الخلايا من قاع الأطباق.

أضف الآن تسعة ميل من وسط الثقافة لإعادة تعليق الخلايا في معلق خلية واحدة ونقلها إلى أنبوب 15 مل. ثم يتم تدوير هذه الخلايا وحبيباتها. بعد تعليق الحبيبات ، يتم حساب عدد الخلايا في المعلق ويتم ضبط التركيز إلى ثمانية أضعاف 10 إلى الخلايا الأربع لكل مل.

ثم يتم نقل 10 مل من تعليق الخلية إلى طبق 10 سم مغطى بالجيلاتين. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بعد شفط وسط الحضانة الليلية من طبق الخلايا الليفية ويضاف 10 ميل من الوسط المحتوي على الفيروس إلى الميثامفيتامين. احتضان الخلايا من أربع ساعات إلى ليلة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، استنشق الوسط من طبق الألياف ثم أضف 10 مل من وسائط ESL الطازجة. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الخلايا أو توسيعها أو تحضيرها لبدء إعادة البرمجة. لبدء إعادة البرمجة ، استبدل وسيط ESL العادي بوسط يحتوي على الدوكسيسيكلين لبدء التعبير عن الجينات الأربعة.

ضع هذه الخلايا في الحاضنة وقم بتغيير الوسط كل يوم حتى تصبح المستعمرات كبيرة بما يكفي لقطفها. يجب أن تصبح المستعمرات مرئية أولا بعد أسبوع تقريبا من بدء إعادة البرمجة. يجب أن تصبح كبيرة بما يكفي ليتم التقاطها في اليوم 20 تقريبا.

الآن بعد مرور 20 يوما ، يمكننا المضي قدما واختيار مستعمرات IPS قبل اختيار المستعمرات. يجب على المرء أن يتذكر أن يرى العدد المطلوب من 24 لوحة بئر مطلية بالجيلاتين مع أربعة أساطير DR مشعة جاما قبل ساعة إلى ساعتين من قطفها. يجب على المرء إطعام المستعمرات الموجودة على الأطباق عن طريق إضافة وسيط طازج قبل الانتقاء مباشرة ، وإضافة 50 ميكرولترا من مخزن HEPA المؤقت إلى آبار طبق V 96 Well ذو القاع مباشرة قبل قطفه مباشرة ، وغسل الطبق الذي يحتوي على المستعمرات المراد قطفها مرة واحدة باستخدام PBS وإضافة 10 مل من PBS إلى الطبق ، يمكن اختيار مجموعات خلايا IPS إما تحت مجهر استريو أو مقلوب.

اختر المستعمرات بطرف ماصة صغير وانقلها إلى بئر في طبق البئر 96 الذي يحتوي على PBS لإزالة المجموعات. يتم رسم دائرة بطرف ماصة حول المجموعة لتفكيك الرياضيات. الآن يمكن استخراج الخلايا المعاد برمجتها الآن باستخدام الماصة متعددة القنوات ، ويتم إضافة 20 ميكرولترا من التريبسين إلى كل منها.

قم بتثبيته لأعلى ولأسفل ثلاث مرات ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. بعد الحضانة لمدة أربع دقائق ، تتم إضافة 100 ميكرولتر من وسط ES إلى مستعمرات الطيران. قم بتثبيته لأعلى ولأسفل 10 مرات وانقل ستة نسخ في المرة الواحدة.

من طبق البئر 96 إلى طبق 24 بئر باستخدام طرف في كل موضع آخر على 12 مكانا ، تزرع خلايا الماصة على صفيحة 24 بئر بدرجة 37 سنتا ، حاضنة CO2 بنسبة 5٪ حتى تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من المحتمل أن تكون الأطعمة الجاهزة الملائمة للطلاقة مع الخلايا المتوسطة للخلايا الجذعية الجنينية جاهزة للتوسع في غضون ثلاثة إلى سبعة أيام بعد بضعة أيام. الآن بعد أن أصبحت خلايا IPS ملتقية ، استنشق الوسط واغسل الخلايا بميل واحد من الهيبيز تماما قم بإزالة الهيبيين وأضف 100 ميكرولتر من التربسين مرة واحدة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة مع التربسين ، أضف 400 ميكرولتر من وسط ESL الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل وإنتاج معلق خلية واحدة.

ثم يتم نقل معلق الخلية المفردة سعة 500 ميكرولتر من البئر 24 إلى بئر واحد من ستة آبار ويحتضن في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من الطلاقة المشتركة في لوحة الآبار الستة. في هذه المرحلة ، يمكنك إما المضي قدما في تضخيم الخلايا للتحليل الجنوبي أو الانفجارات أو الحقن أو فحوصات الورم المسخي أو فحوصات التمايز في المختبر. ويجب أن تتذكر تجميد صمامات مخزون هذه الخلايا حتى لا تفقد هذا المخزون الثمين من خلايا IPS.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحفيز تعدد القدرات في الخلايا الليفية الجنينية للفأر باستخدام نظام مضاد للفيروسات المحفز. لذا شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.