Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

وجدت تقنية زراعة الأنسجة تطبيقا واسعا في مجال بيولوجيا الخلية. ومع ذلك ، تتطلب الخلايا المستنبتة صيانة دورية للبقاء بصحة جيدة. عندما تصل الخلايا إلى الطلاقة المشتركة ، يجب أن تكون مستزرعة فرعية أو عبرها.

عدم القيام بذلك إلى انخفاض النمو وموت الخلايا في النهاية. في هذا الفيديو، نوضح كيفية الحفاظ على خلايا زراعة الأنسجة لكل من خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة. مرحبا ، أنا ريكي هنا في مختبر Dr.LAN في شبكة مختبرات علم الأمراض الجزيئية في شرق تينيسي.

اليوم أريد أن أريكم طريقتين لتعبئة التعليق والخلايا الملتصقة. لتمرير صفيحة من الخلايا. سنرغب في البدء بثقافة أولية نمت لتتزامن في طبق بتري 60 ملم أو قارورة زراعة الأنسجة بحجم 25 سم مربع تحتوي على وسط زراعة الأنسجة بسعة خمسة مل

نبدأ بإزالة كل الوسيط من الثقافة الأولية باستخدام الماصة المعقمة. ثم نقوم بغسل طبقة أحادية الخلية الملتصقة مرة أو مرتين بحجم صغير يبلغ 37 درجة مئوية HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. لإزالة أي مصل بقري للجنين قد يثبط عمل إنزيم التربسين الذي سيضيف في الخطوة التالية.

بعد ذلك ، أضف ما يكفي من محلول التربسين EDTA الدافئ إلى المزرعة بحيث تغطي طبقة الخلية الملتصقة. ثم يمكنك وضع الطبق على صينية تسخين 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد الحضانة ، اضغط على الجزء السفلي من اللوحة على سطح مستو لإخراج الخلايا.

تحقق من المزرعة بمجهر مقلوب للتأكد من تقريب الخلايا ، مما يشير إلى أنها منفصلة عن السطح. إذا لم يتم فصل الخلايا بشكل كاف ، فأعد اللوحة إلى صينية التسخين لمدة دقيقة أو دقيقتين إضافيتين. بعد النظر في المنظار ، اشطف الطبق في وسط كامل وقم بتقطيع التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على ملين من الوسط الكامل.

قم بتدوير الخلايا لأسفل لحبيبات التكبيل وإعادة تعليق الحبيبات في وسط كامل. الآن ، أضف حجما متساويا من تعليق الخلية إلى كل لوحة من الألواح الجديدة التي تم تصنيفها بشكل مناسب. بدلا من ذلك ، يمكن حساب الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي وتخفيفها إلى الكثافة المطلوبة بحيث يمكن إضافة عدد محدد من الخلايا إلى كل لوحة.

تأكد من تسمية كل طبق بتاريخ الثقافة الفرعية ورقم المقطع. بعد إضافة تعليق الخلية ، ضع مل واحد من الوسط الطازج لكل مزرعة جديدة. الآن احتضان الألواح في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية 5٪ CO2.

بعد احتضان الخلايا طوال الليل ، أضف وسطا جديدا إلى الأطباق وأعدها إلى 37 درجة. بمجرد أن تنمو اللوحة إلى الطلاقة ، يمكنك تمرير اللوحة مرة أخرى عن طريق تكرار هذا الإجراء والاستمرار في المرور حسب الضرورة. سنوضح لك الآن كيفية تمرير الخلايا في ثقافة التعليق.

خلايا التعبئة في ثقافة التعليق أبسط من خلايا الالتصاق. قبل تعبئة مزارع التعليق ، يجب الحفاظ على الخلايا عن طريق التغذية كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل إلى الطلاقة ، وهو عندما تتكتل الخلايا معا في المعلق ويبدو الوسط عكا. عندما يتم تدوير القارورة.

للقيام بذلك ، قم بإزالة قارورة خلايا التعليق من الحاضنة ، مع الحرص على عدم إزعاج أولئك الذين استقروا في القارورة. قم بإزالة حوالي ثلث الوسط والتخلص منه من القارورة واستبدله بحجم متساو من وسط التدفئة عند 37 درجة مئوية. بعد تغيير الوسط ، قم بتدوير القارورة وأعدها إلى الحاضنة ، والتي تكون عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

إذا كان هناك أقل من 15 مل ، فإن وسيطا في القارورة يحتضن القارورة في وضع أفقي لتعزيز الخلية إلى التلامس المتوسط. خلاف ذلك ، يمكن احتضان القارورة عموديا في الأيام التي لا يتم فيها تغذية الثقافات. افحصها عن طريق تدوير المسطحات لإعادة تعليق الخلايا.

تأكد من ملاحظة أي تغيرات في اللون في الوسط تشير إلى نمو التمثيل الغذائي الجيد. بمجرد أن تتلاقى الثقافات ، والتي يجب أن تكون حوالي 2.5 مليون خلية لكل مل ، يمكنك تمريرها. مرة أخرى ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية تمرير الخلايا المستزرعة لكل من الثقافات الملتصقة والمعلقة.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في جميع تجاربك.