Name: تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: تعلم تقنيات تجميد وإذابة خلايا الثدييات المزروعة للحفاظ على خطوط الخلايا على المدى الطويل. يوضح هذا الفيديو الإجراءات العملية لضمان حيوية الخلايا بعد التخزين في النيتروجين السائل.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بروتوكول النص الكامل لهذا النهج التجريبي هو متاح في <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">البروتوكولات الحالية في بيولوجيا الخلية.</a>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

وتستخدم خلايا الثدييات تربيتها على نطاق واسع في دراسات بيولوجيا الخلية. ذلك يتطلب عددا من المهارات الخاصة من أجل أن تكون قادرة على الحفاظ على الهيكل ، والوظيفة ، والسلوك ، وبيولوجيا الخلايا في الثقافة. هذا الفيديو يصف المهارات الأساسية اللازمة لتجميد وتخزين الخلايا وكيفية استرداد الأرصدة المجمدة.

وتستخدم خلايا الثدييات تربيتها على نطاق واسع في دراسات بيولوجيا الخلية. هذا الفيديو يصف المهارات الأساسية اللازمة لتجميد وتخزين الخلايا وكيفية استرداد الأرصدة المجمدة.

تُستخدم الخلايا الثديية المستنبتة على نطاق واسع في دراسات بيولوجيا الخلية. ويتطلب الأمر عدداً من المهارات الخاصة لكي يتسنى الحفاظ على...

تُستخدم المزارع الخلوية في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية والتشخيصية. ومن المرغوب فيه أحياناً تخزين الخطوط الخلوية من أجل العمل المستقبلي للحفاظ على الخلايا، وتجنب الشيخوخة الخلوية، وتقليل مخاطر التلوث، والحد من آثار الانحراف الجيني. ويمكن تجميد الخطوط الخلوية من أجل التخزين طويل الأمد.نوضح لكم في هذا الفيديو كيفية تجميد الخلايا النامية في كل من الطبقة الواحدة والمعلق، وكيفية إذابتها من أجل نموها مرة أخرى. مرحبًا، أنا ريكي من مختبر Dr.LAN في شبكة مختبرات الباثولوجيا الجزيئية في شرق تينيسي. سأوضح لكم اليوم كيفية تجميد الخلايا للتخزين طويل الأمد وكيفية إذابتها من النيتروجين السائل.لتجميد الخلايا البشرية الملتصقة، ابدأ بفصلها عن الطبق كما تفعل عند تحضيرها للتعبئة. ضع في اعتبارك أنه من الأفضل استخدام الخلايا التي تكون في طور النمو اللوغاريتمي لغرض الحفظ بالتجميد. وبمجرد انفصال الخلايا وإيقاف تفاعل التربسين عن طريق إضافة المصل أو وسط يحتوي على المصل، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم وأضف اثنين مل.يمكن تجميع الوسط الكامل مع مصل الخلايا من ثلاثة أطباق أو أكثر من نفس المزرعة الفرعية ومن نفس المصدر في أنبوب واحد. تُطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 300 إلى 350 Gs في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب في 10 mils عند درجة حرارة 4 °C.أضف حجماً مساوياً من وسط التجميد عند درجة حرارة 4 °C إلى الوسط الكامل، وامزج الخلايا جيداً، ثم ضع الأنبوب على الثلج لعد الخلايا. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، قم بتخفيف المعلق بمزيد من وسط التجميد للوصول إلى تركيز نهائي للخلايا يبلغ 1 مليون أو 10 مليون خلية لكل milliliter لتجميد الخلايا المستمدة من دورق بمساحة 25 centimeter square يكون شبه متراص. أعد تعليق الخلايا في حوالي 3 mils من وسط التجميد، ثم انقل حصصاً حجمها 1 mil من معلق الخلايا بواسطة الماصة إلى أنابيب حفظ بالتجميد (cryovials) سعة 2 mil مُصنفة.تأكد من إحكام إغلاق أغطية القنينات. ضع القنينات لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة في مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية، ثم انقلها إلى مجمد تخزين النيتروجين السائل. إن تجميد الخلايا من المزارع المعلقة يماثل في مبدأه تجميد الخلايا من الطبقة الأحادية.يكمن الفرق الرئيسي في أن المزارع العالقة لا تحتاج إلى المعالجة بالتريبسين أولاً؛ انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي وقم بتدويره لمدة 10 دقائق بسرعة 300 إلى 350 Gs في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الراسب في وسط تجميد عند درجة حرارة 4°C بكثافة تتراوح من 1 مليون إلى 10 مليون خلية لكل mL.بعد ذلك، يتم نقل حصص مقدارها 1 ml من معلق الخلايا إلى أنابيب حفظ بالتجميد (cryo vials) ثم تجميدها. وكما تم تطبيقه في مزارع الطبقة الواحدة، والتي تم توضيحها في الفصل السابق، يتم إذابة الأنابيب المجمدة واستعادة الخلايا. أولاً، يتم إخراج أنبوب الخلايا من مجمد النيتروجين السائل ووضعه فوراً في حمام مائي درجة حرارته 37 °C.رج القارورة باستمرار حتى يذوب الوسط، وهو ما يستغرق عادةً أقل من 60 ثانية. وبمجرد الذوبان، امسح الجزء العلوي من القارورة بـ 70%ethanol قبل فتحها. ثم انقل معلق الخلايا المذاب إلى أنبوب طرد مركزي معقم يحتوي على 2 mils من الوسط الكامل الدافئ و 20%fetal bovine serum centrifuge.يُترك هذا لمدة 10 دقائق عند 150 إلى 200 Gs في درجة حرارة الغرفة. ستعمل هذه الخطوة على إزالة أي DMSO متبقٍ بعد عملية الطرد المركزي، ثم تخلص من الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف في كمية صغيرة تبلغ حوالي 1 ml من الوسط الكامل و20% FBS، ثم انقل هذا إلى طبق زرع مُصنف بشكل صحيح يحتوي على الكمية المناسبة من الوسط. وبشكل عام، يلزم وجود 1 ml من معلق الخلايا في 5 إلى 20 ml من الوسط.الآن، يمكنك وضع الخلايا في حاضنة عند 37 °C لتنمو لمدة 24 ساعة. يجب التأكد من التصاق الخلايا بالطبق، وبعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، أو عندما يتغير لون مؤشر pH في الوسط، يجب تغيير الوسط الغذائي. يُنصح بالاحتفاظ بالمزارع في وسط يحتوي على 20% FBS حتى يتم إعادة إنشاء الخط الخلوي.إذا كان معدل الاسترداد منخفضاً للغاية، فقد تكون مجموعة فرعية فقط من المزرعة الأصلية هي التي تنمو. يجب توخي الحذر الشديد بهذا الشأن عند العمل مع الخطوط الخلوية المعروفة بأنها فسيفسائية. وفي حال الحاجة إلى شحن المزارع، يمكن القيام بذلك بسهولة لكل من مزارع الطبقة الواحدة ومزارع التعليق.في دوارق زراعة الأنسجة سعة 25 سنتيمتر، تُنمى الخلايا حتى تصل إلى مرحلة تقارب الاندماج (confluency) في طبقة أحادية، أو إلى الكثافة المطلوبة في حالة الزراعة المعلقة. بالنسبة للمزارع ذات الطبقة الأحادية، يُزال الوسط أولاً ثم يُملأ الدورق بوسط جديد. من الضروري ملء الدورق بالوسط تماماً لمنع جفاف الخلايا في حال انقلبت الدوارق أثناء النقل.بالنسبة للمزارع العالقة الطازجة، يُضاف الوسط الغذائي لملء القارورة. يتم إحكام إغلاق الغطاء وتثبيته في مكانه باستخدام شريط Parafilm. تُغلق القارورة في كيس بلاستيكي مانع للتسرب أو في أي حاوية أخرى مانعة للتسرب مصممة لمنع الانسكاب.في حال تعرض القارورة للتلف، يُوضع الوعاء الأساسي في وعاء عازل ثانوي لحمايته من درجات الحرارة القصوى أثناء النقل. يتم تثبيت ملصق مخاطر المشتري على الجزء الخارجي من الطرد. وبوجه عام، تُنقل المزارع عبر خدمات البريد السريع في نفس الليلة أو خلال الليل.لقد قدمنا لكم للتو كيفية تجميد وإذابة مزارع الخلايا البشرية لكل من الخلايا الملتصقة والخلايا العالقة. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في جميع تجاربكم.

freezing-thawing-and-packaging-cells-for-transport

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية.

تجميد الخلايا البشرية ES

منذ جيمس طومسون وآخرون تطوير تقنية في عام 1998 لعزل وتنمو HES في الثقافة ، وتصبح خلايا لاستخدامها لاحقا تجميد والذوبان ، وتوسيع الخلايا من الأوراق المالية المجمدة الاجراءات الهامة التي أجريت في خلية ثقافة HES الروتينية. منذ HES خلايا حساسة للغاية لتؤكد للتجميد والذوبان ، يجب توخي الحذر خاصة. نحن هنا لشرح الطريقة المناسبة لإذابة الخلايا بسرعة HES من المخزونات النيتروجين السائل ، والطلاء لهم على الخلايا الجنينية الماوس المغذية ، وتجميد ببطء لهم على المدى الطويل التخزين.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

نحن هنا لتوضيح كيفية استخدام الإلكترون cryotomography (ECT) لدراسة التركيب الدقيق للخلايا بكتيرية في القريب الناطقين الدول ، والى "الجزيئات" (~ 4 نانومتر) القرار.

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

تجميد التجفيف هو في كثير من الأحيان وسيلة سهلة ومريحة للحصول على المنتجات الجافة من الخلايا البكتيرية قابلة للحياة. قضية من هذه العملية هو بقاء الخلية. ونحن من التفصيل هنا إجراء التحقيق في كيفية ويتأثر بقاء الخلية أثناء التجميد والتجفيف عن طريق خصائص الصيغة المستخدمة.

تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

يعد الحصول على صور مجهرية إلكترونية عالية الجودة أمرا صعبا ، خاصة في حالة الخلايا النباتية ، التي تحتوي على فجوات كبيرة مملوءة بالماء ومساحات جيدة التهوية. يقلل التجميد بالضغط العالي جنبا إلى جنب والاستبدال السريع للتجميد بشكل كبير من وقت تحضير عينات النبات ل TEM مع إنتاج عينات مع الحفاظ على البنية التحتية الممتازة.

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

خطوط الخلية المورفولوجية هي الكواشف هامة للبحوث الأساسية والطب الأحيائي على حد سواء. توفر هذه المقالة بروتوكولات لذوبان الجليد، وسوبكولتورينج، ونعد من خطوط الخلايا المورفولوجية المستخدمة عادة لمساعدة الباحثين في إدماج استخدام هذه الكواشف في أبحاثهم.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

هنا ، يتم تقديم بروتوكول يصف خطوات إعداد العينات وجمع البيانات المطلوبة في التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد (SXT) لتصوير البنية الفائقة للخلايا المحفوظة بالتبريد بالكامل بدقة 25 نانومتر نصف الملعب.

وصف رسم الخرائط 3D للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo

هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.

التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

تعلم تقنيات تجميد وإذابة خلايا الثدييات المزروعة للحفاظ على خطوط الخلايا على المدى الطويل. يوضح هذا الفيديو الإجراءات العملية لضمان حيوية الخلايا بعد التخزين في النيتروجين السائل.

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

استكشف المزيد من الفيديوهات