تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

تُستخدم المزارع الخلوية في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية والتشخيصية. ومن المرغوب فيه أحياناً تخزين الخطوط الخلوية من أجل العمل المستقبلي للحفاظ على الخلايا، وتجنب الشيخوخة الخلوية، وتقليل مخاطر التلوث، والحد من آثار الانحراف الجيني. ويمكن تجميد الخطوط الخلوية من أجل التخزين طويل الأمد.

نوضح لكم في هذا الفيديو كيفية تجميد الخلايا النامية في كل من الطبقة الواحدة والمعلق، وكيفية إذابتها من أجل نموها مرة أخرى. مرحبًا، أنا ريكي من مختبر Dr.LAN في شبكة مختبرات الباثولوجيا الجزيئية في شرق تينيسي. سأوضح لكم اليوم كيفية تجميد الخلايا للتخزين طويل الأمد وكيفية إذابتها من النيتروجين السائل.

لتجميد الخلايا البشرية الملتصقة، ابدأ بفصلها عن الطبق كما تفعل عند تحضيرها للتعبئة. ضع في اعتبارك أنه من الأفضل استخدام الخلايا التي تكون في طور النمو اللوغاريتمي لغرض الحفظ بالتجميد. وبمجرد انفصال الخلايا وإيقاف تفاعل التربسين عن طريق إضافة المصل أو وسط يحتوي على المصل، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم وأضف اثنين مل.

يمكن تجميع الوسط الكامل مع مصل الخلايا من ثلاثة أطباق أو أكثر من نفس المزرعة الفرعية ومن نفس المصدر في أنبوب واحد. تُطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 300 إلى 350 Gs في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب في 10 mils عند درجة حرارة 4 °C.

أضف حجماً مساوياً من وسط التجميد عند درجة حرارة 4 °C إلى الوسط الكامل، وامزج الخلايا جيداً، ثم ضع الأنبوب على الثلج لعد الخلايا. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، قم بتخفيف المعلق بمزيد من وسط التجميد للوصول إلى تركيز نهائي للخلايا يبلغ 1 مليون أو 10 مليون خلية لكل milliliter لتجميد الخلايا المستمدة من دورق بمساحة 25 centimeter square يكون شبه متراص. أعد تعليق الخلايا في حوالي 3 mils من وسط التجميد، ثم انقل حصصاً حجمها 1 mil من معلق الخلايا بواسطة الماصة إلى أنابيب حفظ بالتجميد (cryovials) سعة 2 mil مُصنفة.

تأكد من إحكام إغلاق أغطية القنينات. ضع القنينات لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة في مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية، ثم انقلها إلى مجمد تخزين النيتروجين السائل. إن تجميد الخلايا من المزارع المعلقة يماثل في مبدأه تجميد الخلايا من الطبقة الأحادية.

يكمن الفرق الرئيسي في أن المزارع العالقة لا تحتاج إلى المعالجة بالتريبسين أولاً؛ انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي وقم بتدويره لمدة 10 دقائق بسرعة 300 إلى 350 Gs في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الراسب في وسط تجميد عند درجة حرارة 4°C بكثافة تتراوح من 1 مليون إلى 10 مليون خلية لكل mL.

بعد ذلك، يتم نقل حصص مقدارها 1 ml من معلق الخلايا إلى أنابيب حفظ بالتجميد (cryo vials) ثم تجميدها. وكما تم تطبيقه في مزارع الطبقة الواحدة، والتي تم توضيحها في الفصل السابق، يتم إذابة الأنابيب المجمدة واستعادة الخلايا. أولاً، يتم إخراج أنبوب الخلايا من مجمد النيتروجين السائل ووضعه فوراً في حمام مائي درجة حرارته 37 °C.

رج القارورة باستمرار حتى يذوب الوسط، وهو ما يستغرق عادةً أقل من 60 ثانية. وبمجرد الذوبان، امسح الجزء العلوي من القارورة بـ 70%ethanol قبل فتحها. ثم انقل معلق الخلايا المذاب إلى أنبوب طرد مركزي معقم يحتوي على 2 mils من الوسط الكامل الدافئ و 20%fetal bovine serum centrifuge.

يُترك هذا لمدة 10 دقائق عند 150 إلى 200 Gs في درجة حرارة الغرفة. ستعمل هذه الخطوة على إزالة أي DMSO متبقٍ بعد عملية الطرد المركزي، ثم تخلص من الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف في كمية صغيرة تبلغ حوالي 1 ml من الوسط الكامل و20% FBS، ثم انقل هذا إلى طبق زرع مُصنف بشكل صحيح يحتوي على الكمية المناسبة من الوسط. وبشكل عام، يلزم وجود 1 ml من معلق الخلايا في 5 إلى 20 ml من الوسط.

الآن، يمكنك وضع الخلايا في حاضنة عند 37 °C لتنمو لمدة 24 ساعة. يجب التأكد من التصاق الخلايا بالطبق، وبعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، أو عندما يتغير لون مؤشر pH في الوسط، يجب تغيير الوسط الغذائي. يُنصح بالاحتفاظ بالمزارع في وسط يحتوي على 20% FBS حتى يتم إعادة إنشاء الخط الخلوي.

إذا كان معدل الاسترداد منخفضاً للغاية، فقد تكون مجموعة فرعية فقط من المزرعة الأصلية هي التي تنمو. يجب توخي الحذر الشديد بهذا الشأن عند العمل مع الخطوط الخلوية المعروفة بأنها فسيفسائية. وفي حال الحاجة إلى شحن المزارع، يمكن القيام بذلك بسهولة لكل من مزارع الطبقة الواحدة ومزارع التعليق.

في دوارق زراعة الأنسجة سعة 25 سنتيمتر، تُنمى الخلايا حتى تصل إلى مرحلة تقارب الاندماج (confluency) في طبقة أحادية، أو إلى الكثافة المطلوبة في حالة الزراعة المعلقة. بالنسبة للمزارع ذات الطبقة الأحادية، يُزال الوسط أولاً ثم يُملأ الدورق بوسط جديد. من الضروري ملء الدورق بالوسط تماماً لمنع جفاف الخلايا في حال انقلبت الدوارق أثناء النقل.

بالنسبة للمزارع العالقة الطازجة، يُضاف الوسط الغذائي لملء القارورة. يتم إحكام إغلاق الغطاء وتثبيته في مكانه باستخدام شريط Parafilm. تُغلق القارورة في كيس بلاستيكي مانع للتسرب أو في أي حاوية أخرى مانعة للتسرب مصممة لمنع الانسكاب.

في حال تعرض القارورة للتلف، يُوضع الوعاء الأساسي في وعاء عازل ثانوي لحمايته من درجات الحرارة القصوى أثناء النقل. يتم تثبيت ملصق مخاطر المشتري على الجزء الخارجي من الطرد. وبوجه عام، تُنقل المزارع عبر خدمات البريد السريع في نفس الليلة أو خلال الليل.

لقد قدمنا لكم للتو كيفية تجميد وإذابة مزارع الخلايا البشرية لكل من الخلايا الملتصقة والخلايا العالقة. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في جميع تجاربكم.