مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية

سأوضح لكم اليوم كيفية تحضير شرائح شبكية العين لسمندل النمر لإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp). أولاً، سأقوم بتحضير نوعين من شرائح المجهر؛ حيث نستخدم شرائح مزودة ببئر لاصق مثبت بها، لتمكيننا من استخدامها كغرف سوائل.

على الشريحة الأولى، أضع شريطين متوازيين من الشحم المفرغ. ثم آخذ بعض ورق الترشيح وأقصه إلى قطع مستطيلة باستخدام مسطرة. الآن، أضع إحدى القطع على مسارات الشحم وأضغط عليها لأسفل لضمان التصاقها جيداً بالشريحة.

أقوم بنفس الإجراء مع القطعة الأخرى. تحتوي النوعية الثانية من الشرائح على كتل مطاطية صغيرة ملصقة بها. في الوقت الحالي، أقوم فقط بإضافة القليل من شحم التخلخل بين الكتل، كما أضع شفرة حلاقة جديدة في جهاز تقطيع الأنسجة.

أخيرًا، أقوم بتجهيز الأدوات التي سأحتاجها أثناء عملية التشريح، وهي زوجان من الملاقط، وزوج واحد من المقصات، وأداة لإزالة العين من الرأس لتسجيل التيارات المستحثة بالضوء. يجب إجراء عملية التشريح تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء IR، ولكن لأغراض التوضيح، سأعمل الآن في الضوء. أقوم أولاً بإزالة العين ووضعها تحت المجهر على قطعة من ورق الأنسجة، والتي قمت بترطيبها بمحلول رينجر المبرد بالثلج.

ثم أقوم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة من مقلة العين للتأكد من أنها لن تتسبب في إتلاف العين. أقوم دائمًا بالقص على طول السطح. هذا ما تراه عبر المجهر.

بعد ذلك، أستخدم شفرة حلاقة لإحداث شق صغير في القرنية. وللقيام بذلك، أثبت العين باستخدام الملقط مع الضغط بحافة شفرة الحلاقة على القرنية. ثم أمسك القرنية بالملقط أثناء إزالتها باستخدام المقص لاستخراج العدسة.

أضغط قليلاً على حواف كأس العين حتى أتمكن من الوصول إلى العدسة بسهولة باستخدام الملقط. بعد ذلك، أقوم بإزالة القزحية؛ حيث أمسك بالقزحية باستخدام الملقط أثناء القص على طول aura serato حتى لا يتبقى سوى كأس العين.

بعد ذلك، أقوم بقص كوب I إلى قطعتين مستطيلتين؛ حيث أقصه أولاً إلى نصفين، ثم أقلم الحواف العلوية والسفلية. والآن آخذ إحدى الشرائح التي جهزتها مسبقاً، وألتقط قطعة من كوب I وأضعها بحيث تكون جهة الشبكية لأسفل على ورقة الترشيح.

ثم أقوم بسحب هذه الصلبة بحيث لا تبقى سوى الشبكية على الشريحة. بعد ذلك، أضيف بسرعة محلول الشطف إلى الحجرة. دعونا نكرر الإجراء لقطعة الشبكية الثانية.

ولكن هذه المرة يمكنك المراقبة عبر المجهر أثناء وضع الشبكية على ورق الترشيح. أستخدم الملقط في يدي اليسرى للضغط بعناية على الصلبة. وأخيراً، أقوم بتقطيع الشبكية إلى شرائح بعرض 200 إلى 300 micrometer.

بعد ذلك، أختار شريحة لاستخدامها في تجاربي. ولاختيار شريحة جيدة، أحتاج إلى تدوير الشرائح بمقدار 90 درجة حتى أتمكن من رؤية طبقات الشبكية. أختار شريحة تبدو غير تالفة وتظهر فيها حزم أفقية متميزة تشير إلى الطبقات المختلفة.

لنقل الشرائح من شريحة إلى أخرى، أقوم بإنشاء جسر من محلول رينجر، ثم أنقل الشرائح بعناية عبر المحلول. وعند وضع الشريحة، أدفعها مقابل الكتل المطاطية بحيث تكون ورقة الترشيح موجهة عمودياً على الزجاج. الآن أصبحتُ جاهزاً لتسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording).

نقوم بتخزين المحلول داخل الخلوي في حصص صغيرة في المجمد حتى لا نقوم بإذابة الكمية التي نحتاجها فعلياً في اليوم الواحد فقط. وقبل ملء الأقطاب الكهربائية، نقوم بترشيح المحلول لإزالة الجسيمات الصغيرة التي قد تسد طرف القطب. يتم سحب أقطاب الرقعة (patch electrodes) من أنابيب زجاجية بوروسليكاتية للتسجيل من الخلايا العقدية.

أختار إعداد سحب ينتج مقاومات أقطاب تتراوح بين 2 و4 mega ohms. وعندما أملأ الأقطاب، أريد التأكد من عدم وجود فقاعات هواء في طرف القطب. ويساعد نقر الزجاج بالإصبع على إزالة الفقاعات.

هذا هو حامل القطب المتصل بمرحلة الرأس. يحتوي الأسطوانة الكهربائية على سلك من كلوريد الفضة. هذا هو القطب الأرضي المزود بجسر niga.

إليك ماصة التروية. وهي متصلة بنظام تروية دقيقة ثماني القنوات. تعتمد التروية الرئيسية على الجاذبية، لذا فهي عبارة عن زجاجة مملوءة بالمحاليل، حيث ينساب المحلول عبر هذا الأنبوب وصولاً إلى غرفة التسجيل.

لكي أتمكن من التسجيل في الظلام، لدي كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء (IR) متصلة بالمنفذ الجانبي للمجهر، وهي مرتبطة بشاشة تلفزيون. وفي المنفذ العلوي، قمت بتوصيل جهاز عرض صور، والذي يسمح لي بإسقاط المحفزات البصرية على الشبكية. وأخيراً، مضخم تسجيل الجهد الغشائي (patch clamp amplifier).

أقوم الآن بوضع شريحة الشبكية تحت المجهر وإضافة القطب الأرضي إلى الحوض لإعداد عملية التروية الرئيسية. بعد ذلك، أضيف الأنبوب الخاص بنظام التروية بالجاذبية. يتصل الأنبوب الزجاجي في الجانب الآخر بشفاط تفريغ، مما يحافظ على مستوى السائل ثابتاً.

أتحقق أيضاً من توصيل أنبوب شفط بـ The electro shoulder. بعد ذلك، أقوم بوضع ماصة التروية الدقيقة، ثم أخفضها في الحمام متبوعة بعدسة المجهر.

بمجرد أن أقترب من الشريحة، أتراجع قليلاً حتى يصطدم المحلول بالشريحة. عند تشغيل عملية التروية، يجب أن ألاحظ تحرك الشريحة قليلاً كما يحدث هنا. لنبحث الآن عن خلية مناسبة للتسجيل منها.

نحن نبحث عن الخلايا العقدية الموجودة في الجزء السفلي من الشريحة. الآن أقوم بتجهيز القطب الكهربائي، وقبل إدخاله في الحوض، أقوم بإضافة بعض الضغط الإيجابي. وبمجرد تحديد موقع القطب تحت المجهر، أقوم بخفضه ليكون فوق الشريحة مباشرةً من أجل تثبيت الرقعة على الخلية.

لقد انتقلت إلى العدسة الشيئية بقوة 40x. الآن أقوم بتصفير التيار القاعدي والتحقق من مقاومة القطب الكهربائي. يتكون اختبار الختم من سلسلة من نبضات بجهد 10 millivolt، مما يساعدني في معرفة ما إذا كنت قد حققت ختماً محكماً بين القطب الكهربائي والخلية.

أقوم الآن بخفض القطب الكهربائي على الخلية المستهدفة. وبمجرد رؤية انبعاج في جسم الخلية، أقوم بتحرير الضغط الإيجابي من الأنبوب، مما يؤدي إلى إنشاء سدادة محكمة. تصبح المقاومة الآن عالية جداً بحيث يظهر تتبع التيار بشكل مسطح.

إن هذه الارتفاعات الصغيرة هي تشوهات سعة كهربائية ناجمة عن القطب الكهربائي. يمكن تعويض هذه التشوهات على النحو التالي، وبذلك ستختفي الآن. سأحاول الآن اختراق الخلية.

للقيام بذلك، أقوم بتسليط نبضات شفط صغيرة بعناية على الأنبوب المتصل بكتف القطب الكهربائي، وإذا سارت الأمور على نحو صحيح، ستلاحظ تغير أثر التيار بهذا الشكل. أما المسننات التي تراها الآن فهي ناتجة عن سعة الغشاء، ويمكن تعويضها؛ وهذه العينة قد جُهزت في الظلام. فلنرَ ما إذا كان بإمكاننا تسجيل الاستجابات المستحثة بالضوء.

إن المخطط الذي تراه على راسم الإشارة هو استجابة التيار لخلية عقدية مثبتة الجهد عند 60- millivolts. أما المحفزات الضوئية التي نستخدمها فهي عبارة عن أشرطة مضيئة ومظلمة تُعرض على خلفية موحدة وثابتة. ويعرض برنامج المختبر الخاص بنا السجل الكامل لتجربة واحدة.

يمكن ملاحظة أن هذه الخلية هي خلية "إيقاف" (off cell) كاستجابة لبداية ظهور شريط مظلم وانتهاء شريط مضيء. يشير الخط الأبيض في الأعلى إلى مدة التحفيز. يمكننا الآن إجراء تجارب نقوم فيها بتروية عوامل دوائية مختلفة.

على سبيل المثال، يمكننا تثبيط عمل GABAergic وGly التآزري. وبعد الانتظار لمدة تقل عن دقيقة واحدة، يمكننا عادةً البدء في رؤية تأثيرات الدواء هنا. وقد أصبحت الاستجابة أقوى وأكثر استدامة.

لقد استُخدم تحضير الشرائح الشبكية على نطاق واسع لتسجيل التيارات المشبكية من خلايا مختلفة في الشبكية، وإذا أضاف المرء صبغة فلورية إلى محلول القطب الكهربائي، يمكن التأكد من نوع الخلية بسهولة. ومن الناحية التشريحية، نستخدم هنا يرقة سمندل TGA كنموذج حيواني. وحقيقة أن السمندل من الحيوانات ذات الدم البارد وتمتلك خلايا شبكية كبيرة توفر ظروف تسجيل مواتية، ولكن يمكن تطبيق التقنية نفسها على تحضيرات الثدييات.