مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

مرحباً، أنا ستيفان بوراني من مختبر الدكتور فرانك زاوا في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا ريفرسايد. سنعرض لكم اليوم إجراء ترسيب مناعي للكروماتين. لذا، فلنبدأ.

تبدأ هذه العملية بالربط التشابكي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام الفورمالديهايد. وقبل عملية الربط التشابكي، يتم تذويب الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من النيتروجين السائل لمدة خمس دقائق عند 37 °C، ثم تُغسل بالوسط الغذائي. بعد ذلك، تُزرع الخلايا في أطباق ذات ستة آبار مغطاة بالجيلاتين وتُترك لتتكاثر لمدة تتراوح بين يومين وثلاثة أيام.

لكل تفاعل تريبسين مناعي، سنحتاج إلى البدء بـ 50 إلى 100 مليون خلية. يتم أولاً تجميع الخلايا في معلق. يضاف فوراً ألدهيد إلى كل معلق خلوي بتركيز 1% ويُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف جزءاً واحداً من عشرة من glycine بتركيز 1.25 molar لإيقاف تفاعل formaldehyde، ثم حضّن المزيج لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 milliliters من PBS، ثم انقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. قم بطرد الأنابيب في جهاز centrifuge بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius من أجل تجميع الخلايا في شكل راسب.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 1.5 milliliters من lyce buffer. وأخيراً، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. وبعد نقل الخلايا، قم بتجميدها سريعاً ثلاث مرات في النيتروجين السائل، ثم استخدم مطحنة أنسجة لتفتيتها.

بمجرد ربط الخلايا تشابكياً، تصبح جاهزة لعملية الترسيب المناعي، أو يمكن تخزينها مجمدة عند درجة حرارة -80 °C لفترة غير محددة. بعد إتمام عملية الربط التشابكي للخلايا، يجب تحضير الحبيبات المغناطيسية للقيام بذلك. قم بإضافة 50 µL من حبيبات DI إلى أنابيب دقيقة ذات استبقاء منخفض سعة 1.5 mL، مع تجهيز أنبوب واحد من الحبيبات لكل عملية ترسيب مناعي.

ثم أضف 1 mL من محلول الحجب. الآن قم بجمع حبيبات dyal باستخدام dyal MPC. ضع الأنابيب في الحامل المغناطيسي.

اترك الخرزات تتجمع على جانب الأنبوب. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 15 ثانية. يمكنك قلب الحامل مرتين للمساعدة في تجميع الخرزات.

بمجرد تجميع الحبيبات، يمكنك إزالة السائل العلوي باستخدام الماصة. وبعد إزالة السائل العلوي، أضف 1 mL من محلول الحجب وأعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق إزالة الشريط المغناطيسي من الحامل وقلب الحامل. وبينما لا يزال الأنبوب في مكانه، يمكنك تكرار هذه العملية من 10 إلى 20 مرة أو حتى تتوزع الحبيبات بالتساوي.

أعد تعليق الحبيبات المجمعة كما فعلت سابقاً. وبمجرد جمعها، يمكنك إزالة السائل الطافي باستخدام الماصة. كرر عملية الغسل هذه باستخدام 1.5 milliliters من محلول الحجب.

بعد الغسلة الثانية، يمكنك إعادة تعليق الخرزات في 750 µL من محلول الحجب، ثم إضافة 10 µg من الجسم المضاد. في بحثنا، نستخدم جسماً مضاداً ضد بروتين MLL ونقوم بحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C لمدة ست ساعات كحد أدنى أو طوال الليل على جهاز هزاز. وخلال فترة الحضن هذه، يمكنك إجراء عملية السونيكيشن للكروماتين المترابط، وهو ما سنقوم بتوضيحه بعد انتهاء الحضن الليلي مباشرة.

أزل محلول الأجسام المضادة ثم اغسل الحبيبات ثلاث مرات. استخدم 1 mL من محلول lyase buffer كما فعلت سابقاً، مع استخدام الحامل المغناطيسي لجمع الحبيبات. بعد عمليات الغسل، ستكون جاهزاً لإضافة الكروماتين المشبع.

قبل البدء في عملية السونكة، يجب أولاً استخراج كرات الخلايا المجمدة من درجة حرارة -80 °C وتركها لتذوب. قم بتجهيز أنبوب مخروطي سعة 15 مل لعملية السونكة؛ ويتم ذلك عن طريق قص الأنبوب إلى قطعتين عند علامة 5 مل والتخلص من النصف العلوي.

يمكن تغطية الأنابيب ببارافيلم أو بغطاء الأنبوب. أثناء الإعداد، ضع الأنبوب في حامل الأنابيب بحيث يكون مسبار ator على ارتفاع يتراوح تقريبًا بين 0.5 إلى 1 cm فوق قاع الأنبوب.

تأكد من أن المسبار يتوسط الأنبوب ولا يلامس جوانبه لمنع تكون رغوة في المحلول. بعد ذلك، قم بمعالجة المعلق بالموجات فوق الصوتية لست جولات، مدة كل جولة 20 ثانية. يجب وضع كل عينة في حمام مائي مثلج بين جولات السونكة لتقليل تكون الرغوة.

اضبط خرج الطاقة في البداية على صفر، ثم قم بزيادته يدويًا إلى الطاقة النهائية خلال الدفعة الأولى. بعد فترة من المعالجة، انقل المادة إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 13,000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة four degrees Celsius، وذلك لترسيب الحطام وجمع الـ sna.

انقل SINA إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter. احفظ 50 microliters من محلل الخلايا من كل عينة كـ DNA مدخل. سيُستخدم هذا لاحقاً للتحقق من حجم الكروماتين المشترك.

يمكن تخزين هذا عند درجة حرارة -20 °C. يجب الاحتفاظ بعليقة واحدة على الأقل من الحمض النووي DNA المدخل لكل دفعة من المستخلص المحلل بالموجات فوق الصوتية. والآن نحن مستعدون لإجراء الترسيب المناعي للكروماتين.

أولاً، أضف ما يعادل الكروماتين لـ 50 إلى 100 مليون خلية من العينات التي تم جمعها في الخطوة السابقة إلى 50 µL من مزيج تغذية الأجسام المضادة المغناطيسية الذي تم تحضيره مسبقاً، ليصل الحجم النهائي إلى 1 mL. وإذا لزم الأمر، يمكن تعديل هذا الحجم باستخدام lyce buffer، ثم اقلب الأنبوب لإعادة تعليق الخرزات. قم بحضن هذا المزيج طوال الليل في الحاضنة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد فترة التحضين، اجمع الخرزات باستخدام dyl MPC وضع الأنابيب في الحامل، مما يسمح بتجمع الخرزات على جانب الأنبوب. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 20 ثانية بعد ذلك. قم بهز الحامل مرتين للمساعدة في جمع كافة الخرزات.

بعد ذلك، قم بإزالة الراسب باستخدام ماصة مع تغيير الرؤوس بين العينات. تالياً، نحتاج إلى غسل الخرزات. وللقيام بذلك، أضف 1 mL من محلول lyase buffer إلى كل أنبوب وأعد تعليق الخرزات برفق.

يمكن القيام بذلك عن طريق إزالة الشريط المغناطيسي من الحامل وقلب الحامل مع إبقاء الأنابيب في مكانها حوالي 10 إلى 20 مرة أو حتى يتم إعادة تعليق الحبيبات بشكل متجانس. بعد ذلك، يتم تجميع الحبيبات عن طريق إعادة وضع الشريط المغناطيسي. ثم يتم إزالة المادة الموجودة في الأعلى باستخدام الماصة.

كرر عملية الغسل هذه من ثلاث إلى خمس مرات إضافية. تذكر تغيير الرؤوس بين عمليات الغسل. بعد ذلك، اغسل الحبيبات من أربع إلى ست مرات في 1 mL من IP one buffer كما هو موضح أعلاه.

وبالمثل، اغسل الخرزات من أربع إلى ست مرات في 1 mL من منظم IP two. وأخيراً، اغسل الخرزات من أربع إلى ست مرات في 1 mL من منظم TE buffer pH 8.0 كما تم في عمليات الغسل الأخرى. قم بإزالة TE بعد عملية الغسل الأخيرة.

الآن، قم بالتدوير بسرعة 3000 RPM لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لإزالة أي محلول TE buffer متبقٍ. الحبيبات الآن جاهزة لعملية الاستخلاص (elution) لإزالة الكروماتين. أولاً، أضف 210 µL من محلول elution buffer واستخلص المادة من الحبيبات عن طريق تحضين الأنابيب في جهاز خلط حراري (thermal mixer) عند درجة حرارة 65 °C وبسرعة 800 RPM؛ قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة أو حتى 30 دقيقة لتحسين استعادة المادة المستخلصة.

قم بطرد الخرزات مركزياً بسرعة 13,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة 200 µL من الرائق وانقله إلى أنبوب جديد، ثم أضف 200 µL من TE 0.0. الآن أصبحت عيناتنا جاهزة لعملية عكس الروابط التساهمية لتحرير الـ DNA المترسب.

يتم تحضين السائل الطافي في حمام مائي عند درجة حرارة 65 °C لمدة لا تقل عن ست ساعات وبحد أقصى 15 ساعة. يمكن إجراء هذه العملية في حمام مائي لتقليل التكثف. بعد ذلك، يتم إضافة 50 µL من الحمض النووي DNA المدخل.

تم تخزين ذلك بعد عملية السونيكاتيون (sonication) لعكس طول الارتباط التشابكي لهذا الحمض النووي DNA المدخل عن طريق تحضينه عند 65 درجة مئوية كما تم فعله مع المادة المستخلصة (eluate). والآن نحن مستعدون لتنقية الحمض النووي. بعد ذلك، يتم تنقية الحمض النووي DNA وترسيبه باستخدام استخلاص الفينول والكلوروفورم، متبوعاً بتقنيات الترسيب بالإيثانول.

تُعاد إذابة حبيبات DNA المترسبة في الماء، ومن ثم يمكن تخزينها في درجة حرارة 20- درجة مئوية. وللاستخدام المستقبلي، يمكن تشغيل DNA المدخل المنقى على هلام agarose للتحقق من حجم الكروماتين الممزق. ومن الناحية المثالية، يجب أن يتراوح طول الكروموسوم بين 250 و 750 قاعدة.

لقد استعرضنا للتو كيفية إجراء الترسيب المناعي للكروماتين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. عند إجراء هذه التجربة، من المهم استخدام جسم مضاد عالي الألفة للكروماتين ضمن النطاق الحجمي المناسب، واتباع خطوات غسيل عالية الصرامة. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.