Name: إلى الوراء وصفها من خلايا الشبكية العقدة من خلال تطبيق الذهب الفلوري على سطح أكيمة فخمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: تعلم تقنية التسمير الرجعي لخلايا العقدة الشبكية باستخدام صبغة الفلورو-غولد على السطح الظهري للتلفيف الدماغي العلوي. تُستخدم هذه الطريقة لتقييم تأثير الأدوية على بقاء الخلايا العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر للدعم من البرنامج الوطني للصحة الزرق الأمريكية مؤسسة مساعد.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (80mg/kg) وزيلازين (8mg/kg) (نسبة حجم في 2:1). تطبيق مرهم العقيمة تشحيم العين لمنع جفاف قرنية العين أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس الفراء (من العين إلى مستوى الأذن) ، وإصلاح وجها لوجه في المرحلة رأسه رئيس المشبك وتعيين القواطع في شريط القاطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير المنطقة بالتعاون مع 10 ٪ بوفيدون محلول اليود تليها الكحول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد والعضلات لفضح الجمجمة وخياطة الجروح (السهمي ، الغرز الاكليلية والعرضي) (الشكل 1). تطبيق مسكن ، bupivicaine باعتبارها البداية لمنطقة شق (لا تتجاوز 2 ملغ / كلغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ثقب الجمجمة (2X2 ø مم ، 0.5 مم من كل من سهمي الغرز والعرضي) على كل جانب من الدرز السهمي. تجنب تمزق السحايا والجيوب الواقعة تحت الغرز. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="بصمات على جمجمة فأر على قيد الحياة." width="469" height="317" /> الشكل 1. بصمات على جمجمة فأر على قيد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض فتح السحايا بواسطة مقص الربيع ، وتجنب تمزق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المحتوى الدماغي التي تقع على السطح الظهري للأكيمة متفوقة بعناية بواسطة مضخة الفراغ ، ويمكن ملاحظة ثلاث نقاط التفتيش : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لون تغييرات أنسجة المخ من الرمادي إلى الأبيض إلى رمادي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف الشفط عندما السائل النخاعي عديم اللون تخرج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير بعناية أدنى مستوى شفط أفقيا لفضح أكيمة متفوقة الصفرة التي تغطيها الجافية </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح محتوى الدماغ عبر SC حتى يمكن شوهد أربعة حواف SC مباشرة تحت المجهر. ينبغي أن تظل جزءا من قشرة الدماغ إزالة إلى الحد الأدنى لتفادي الآثار الجانبية غير المرغوب فيها (على سبيل المثال ، محرك خلل). يجب الحرص على عدم لمس الجيوب الأنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امتصاص السوائل في حفرة مع غرامة شريطية القطن المعقم لجعل سطح SC جافة قدر الإمكان. ثم وضع طبقة رقيقة من الإسفنج الجيلاتين المنقوع مسبقا مع 6 ٪ الذهب الفلوري على سطح SC (FG تؤخذ من قبل المحطات محوار خلايا الشبكية العقدة ونقلها إلى somas retrogradely ثنائيا في شبكية العين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحفرة مع جلفوم وإغلاق الجرح الجلد مع مقاطع خياطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم السماح للحيوانات لاسترداد تحت مصباح ساطع للتدفئة. يتم تطبيق مسكن ، البوبرينورفين (100mcg/kg) ، شفويا في مياه الشرب لمدة 5 أيام بعد وضع العلامات SC. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لماذا استخدام هذه الطريقة الجراحية لشبكية العين عدد خلايا العقدة؟ في الفئران حوالي 98 ٪ من خلايا الشبكية العقدة (RGC) ومن المعروف أن مشروع أكيمة متفوقة في المقابل (SC). ويمكن تطبيق الفلوري الذهب على سطح SC التسمية كلها تقريبا من RGCs ، بحيث نتمكن من التركيز على هذه الخلايا العصبية في الشبكية الأكثر ضعفا في الزرق. إلى الوراء مقارنة مع وضع العلامات من خلال وضع RGC FG في الجذع للعصب البصري مقطوع لمدة 2 يوم ، يتم تصغير تدخل بقاء RGC. مقارنة مع تلوي...

إلى الوراء وصفها من خلايا الشبكية العقدة من خلال تطبيق الذهب الفلوري على سطح أكيمة فخمة

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

العقدة الشبكية الخلية (RGC) عد أمر ضروري لتقييم تنكس الشبكية وخاصة في الزرق. RGC موثوق بها الوسم هو أمر أساسي لتقييم الآثار المترتبة على أي علاج. في الفئران ، هو معروف عن 98 ٪ من المشروع لRGCs أكيمة متفوقة في المقابل (SC) (فورستر وبيترز ، 1967). ويمكن تطبيق الفلوري الذهب (FG) على سطح SC تسمية تقريبا جميع RGCs ، بحيث نتمكن من التركيز على هذه الخلايا العصبية في الشبكية الأكثر ضعفا في الزرق. يؤخذ FG من قبل المحطات محوار من الخلايا الشبكية العقدة ونقلها إلى الصعيد الثنائي retrogradely somas في شبكية العين. إلى الوراء مقارنة مع وضع العلامات من خلال وضع RGC FG في الجذع للعصب البصري مقطوع لمدة 2 يوم ، يتم تصغير تدخل بقاء RGC. مقارنة مع تلوين البنفسج cresyl أن البقع RGCs ، وخلايا البطانة وعديم الاستطالات من الاوعية الدموية في طبقة الخلايا العقدية للشبكية ، وهذه الطريقة هي أكثر العلامات محددة لRGC. هذا الفيديو يصف طريقة لوضع العلامات إلى الوراء من خلال تطبيق RGC FG على سطح SC. الإجراءات الجراحية وتشمل حفر الجمجمة ؛ الشفط القشرة لفضح SC وتطبيق الاسفنج الجيلاتين على السطح الظهري كامل SC هي معروضة. أعطيت نصائح مفيدة لتجنب نزيف داخل الجمجمة الضخمة وتطلع اللجنة الدائمة.

هذا الفيديو يصف طريقة لوضع العلامات إلى الوراء من خلال تطبيق RGC الفلوري الذهب (FG) على سطح أكيمة متفوقة (SC). الأسلوب الذي ينطوي على الحفر في الجمجمة ، الشفط القشرة ، وتطبيق الاسفنج الجيلاتين على السطح الظهري كامل SC.

يعد عد الخلايا العقدية الشبكية (RGC) أمراً ضرورياً لتقييم تنكس الشبكية، لا سيما في حالات الزرق. ويُعتبر الوسم الموثوق للخلايا العقدية الشبكية أساساً لـ...

مرحباً، أنا Tu من مختبر GOSO في جامعة هونغ كونغ. سأقوم اليوم بشرح كيفية وسم الخلايا العقدية في شبكية الجرذ باستخدام التتبع الرجعي.سيتم وسم الخلايا العقدية الشبكية تراجعياً عن طريق تطبيق صبغة فلورية على سطح النواة الركبية الإنسية لتمكيننا لاحقاً من عد الخلايا العقدية الشبكية على الشبكية المسطحة المحضرة لتقييم موت الخلايا أو تأثير الدواء المستخدم. توضح هذه الصورة المسار من الشبكية إلى النواة الركبية الإنسية؛ حيث يمكن نقل الصبغة الفلورية تراجعياً من النواة الركبية الإنسية عبر السبيل البصري.مرر القسطرة البصرية عبر العصب البصري وصولاً إلى الشبكية في العين. نستخدم مجهراً جراحياً لإجراء العملية. استخدم مضخة لشفط القشرة المخية فوق السطح الظهري، ومنصة تثبيت CLE لتثبيت الرأس في موضعه.استخدام مفتاح الربط والمثقاب لتوسيع فتحة الجمجمة لدى الجرذ ووضع إسفنجة امتصاص لتطبيق الصبغة الفلورية FG على سطح القشرة المخية. تم تعقيم الأدوات بجهاز الأوتوكلاف قبل العملية، بما في ذلك الملاقط الدقيقة، ومقص الزنبرك، وإبرة الشفط، ورأس المثقاب، ومشابك الخياطة. كما تم تعقيم شفرة الجراحة لقص الجلد، والمسطرة للقياس، والقطن.قمنا بتحليل الجرذ عن طريق الحقن الوريدي للكيتامين وهلام السين. بعد حلاقة منطقة الرأس من مستوى العين إلى مستوى الأذنين، قمنا بتطهير منطقة العملية باستخدام البروبيدون اليود، يليه كحول بتركيز 70%. ثم وضعنا رأس الجرذ في الموضع المحدد على منصة الرأس.قم بشق الجلد في الخط المتوسط للرأس، بدءاً من مستوى العين وصولاً إلى مستوى الأذنين. وبذلك نحصل على كشف جيد للدرز الإكليلي، والدرز السهمي، والدرز المستعرض، وهذا هو الـ BMA وهذا هو الـ Lambda. حدد موقع البرغي على مسافة تتراوح من 0.5 إلى 1 mm من النهاية الأمامية للدرز المستعرض، ثم قم بتمييزهما على كلا الجانبين بشكل متماثل للتأكد من أن العلامة تبعد 0.5 mm على الأقل عن الدروز.بعد ذلك، يمكننا البدء في حفر ثقب على طول جانب العلامة، مع التحكم في سرعة واتجاه المثقاب لإحداث تمزق واسع في السحايا وبطانة الجيب تحت الغرزة. يتم إيقاف الحفر عندما يصل القطر إلى حوالي 2 mm. ثم نبدأ في فحص الجانب الآخر بالمرآة مجدداً للتأكد من أن الثقب بالحجم المناسب وفي المكان الصحيح.قم بقطع السحايا باستخدام مقصات الزنبرك، واستخدم ملقطاً دقيقاً لتنظيف بقايا العظام من الثقب. الآن يمكننا البدء في عملية الشفط باستخدام مضخة الفراغ. الطبقة الأولى من الدماغ (BR) هي المادة الخضراء التي قُطعت مع السحايا مرة أخرى.بعد ذلك، يمكنك ملاحظة تغير لون الخلية التائية (tcell) إلى اللون الأبيض. تمثل هذه المادة البيضاء في السيرو. قم بعملية الشفط بعناية وببطء.والآن يمكننا رؤية المادة الرمادية مرة أخرى. اللون يتغير ويصبح أقل بياضاً. يمكنك ملاحظة أنها رمادية في الأسفل.أفهم ذلك. لذا يمكنك أن ترى خروج السائل الدماغي الشوكي (CSF) الشفاف. وهذا يعني أننا نصل إلى السطح الظهري للمسند العلوي.تظهر هنا ثانيةً فتحة موسعة عند هذا المستوى. ومن ثم، يمكننا رؤية الجافية ذات اللون المائل للاصفرار وهي تغطي السرج التركي العلوي. يتم إجراء الشفط الأفقي عند هذا المستوى لتجنب تدمير محتويات السرج التركي العلوي.بعد ذلك، يمكننا البدء بالعملية ككل. يمكنك رؤية المادة الخضراء، وهي في الواقع ذات لون أخضر.ثم ننتقل إلى المادة البيضاء. لون النسيج أبيض. والآن يمكنك رؤية السائل الدماغي الشوكي CSF وهو يتدفق أسفل ذلك اللون الرمادي بشكل واضح للغاية.قم بإزالة الطبقة الأخيرة من المادة الرمادية، وعندها ستنكشف الأم الجافية الصفراء. كن حذرًا الآن عند تمزيق الأم الجافية فوق النواقض المنفصلة، ثم قم بتوسيع الفتحة. حاول التأكد من إمكانية رؤية الحافة الكاملة للنواقض تحت المجهر.قم بتوجيه مشبك الرأس في مرحلة الرأس بزوايا مختلفة، وقم بإجراء عملية شفط نهائية حتى يمكن رؤية الحواف الأربع لـ CLE مباشرة تحت المجهر. امتص السوائل الموجودة في الفتحة باستخدام شريط قطني رفيع لجعل سطح CLE قوياً قدر الإمكان. خذ قطعة من الجيلاتين، المغموسة مسبقاً في ذهب بتركيز 6%، وقسمها إلى قطع صغيرة.اجعلها في طبقة رقيقة بحيث يكون حجمها أكبر قليلاً من كامل السطح الظهري للجزء العلوي. ضعها بعناية على سطح الملاقط العلوية، ثم على الجانب المقابل. ضعها داخل الثقب بحيث تغطي كامل سطح العنقود من خلال الثقوب مع زيادة تدفق السائل.أخيراً، أغلق جرح الجلد باستخدام مشابك الخياطة ونظف الجرح بعد الجراحة، ثم أعد الفأر الأحمر إلى قفص نظيف واتركه ليتعافى في ظروف دافئة. ويظهر الفأر الأحمر سلوكاً طبيعياً بعد العملية عند الاستيقاظ.بعد سبعة أيام من وسم الخلايا بالـ SC، نقوم بتشريح الشبكية وتثبيتها بشكل مسطح، ثم نعدّ خلايا العقد الشبكية باستخدام المجهر فوق البنفسجي مع مرشح UV. وبما أن 98% من خلايا العقد الشبكية ترسل محاورها إلى الكوليكولوس العلوي (superior colliculus)، فإن وسم ST الموثوق يعد أساسياً لتقييم تطور المرض وتأثير الدواء. هذا مثال لخلايا عقد شبكية موسومة تراجعيًا على شبكية مثبتة بشكل مسطح.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

العصب البصري transection هو النموذج المستخدم على نطاق واسع من اصابة الجهاز العصبي المركزي للبالغين. تسعين في المئة من خلايا الشبكية العقدة (RGCs) التي هي محاور عصبية مقطوع تماما (axotomy) يموت في غضون 14 يوما بعد axotomy. هذا النموذج هو قابل للتلاعب بسهولة تجريبية وقابلة للتكرار للغاية.

العصب البصري Transection : نموذج من موت الخلايا المبرمج الخلية العصبية الكبار في الجهاز العصبي المركزي

العصب البصري transection هو النموذج المستخدم على نطاق واسع من اصابة الجهاز العصبي المركزي للبالغين. هذا نموذج مثالي لأداء عدد من المعالجات التجريبية التي تستهدف الشبكية عالميا أو تستهدف مباشرة السكان من الخلايا العصبية جرح العقدة الشبكية.

أساليب التلاعب التجريبية بعد Transection العصب البصري الثدييات في الجهاز العصبي المركزي

هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت تسميات فرعية السكان من الخلايا العصبية على أساس إسقاط التشريحية. المحاور صفت يمكن استهداف...

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

المصدر: Inal, M. A. et. al., التتبع الرجعي ل ذبابة الفاكهة  الخلايا العصبية الحركية الجنينية باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون. J. Vis. Exp. (2020)يوضح هذا الفيديو طريقة وضع العلامات الرجعية ل ذبابة الفاكهة  الخلايا العصبية الحركية باستخدام الأصباغ المحبة للدهون. تدخل الصبغة إلى المحور العصبي ، وتنتقل إلى الوراء ، وتصنف الخلايا العصبية باللون الأخضر ، مما يسمح بتصور مفصل لمورفولوجيتها وإسقاطاتها تحت مجهر متحد البؤر.

وضع العلامات الرجعية للخلايا العصبية الحركية ذبابة الفاكهة باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون

المصدر: Laboissonniere, et. al. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية. J. Vis. Exp. (2017).   يوضح هذا الفيديو تقنية تتبع الفلورسنت لتحديد الأنواع الفرعية للخلايا العقدية الشبكية (RGC) في شبكية الفأر المعدلة وراثيا. تتضمن العملية تأمين شبكية العين المعزولة في غرفة التسجيل ، والحفاظ على صلاحية الخلية من خلال التروية المؤكسجة ، واستهداف RGCs المسمى بالفلورسنت باستخدام ماصة مع متتبع. من خلال تحليل التشكل الشجيري والتقسيم الطبقي ، تتيح الطريقة تصنيف...

تحديد الأنواع الفرعية لخلايا العقدة الشبكية للفأر من خلال تتبع الفلورسنت

نقدم طريقة فعالة لتسمية الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) في أسماك الزرد البالغة.

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

تعد طريقة ما بعد التضمين المناعي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتوفير تحليلات عالية الدقة للتوطين الخلوي لجزيئات معينة. نصف هنا بروتوكولا لتحليل مستقبلات الغلوتامات كميا في نقاط الاشتباك العصبي الشريطية للشبكية.

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

يعاني الملايين من الناس من أمراض تنكسية في شبكية العين تؤدي إلى عمى لا رجعة فيه. وهناك عنصر شائع في العديد من هذه الأمراض هو فقدان خلايا العقدة الشبكية (رغس). يصف هذا البروتوكول تفصيلا عزل رغس الفئران الأولية عن طريق اختيار الإيجابية والسلبية مع التدفق الخلوي.

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

الثانوي تنكس خلايا العقدة الشبكية (رجكس) يحدث عادة في المياه الزرقاء. تصف هذه الدراسة نهجاً مبتكراً من منطوق للعصب البصري الجزئي ترانسيكشن. استخدام هذا النهج المنطوق توفير مساحة يمتد نطاق تطبيق هذا النموذج، ويتيح استكشاف آليات الإصابة الثانوية في رجكس بطريقة جديدة.

ترانسيكتيون جزئي في العصب البصري في الفئران: نموذج المنشأة مع نهج منطوق جديد لتقييم ثانوي ضمور خلايا الشبكية العقدة

تعلم تقنية التسمير الرجعي لخلايا العقدة الشبكية باستخدام صبغة الفلورو-غولد على السطح الظهري للتلفيف الدماغي العلوي. تُستخدم هذه الطريقة لتقييم تأثير الأدوية على بقاء الخلايا العصبية.

إلى الوراء وصفها من خلايا الشبكية العقدة من خلال تطبيق الذهب الفلوري على سطح أكيمة فخمة

استكشف المزيد من الفيديوهات