الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

مرحباً، أنا لورين فرانك من مختبر إيمانويل بوثوس في قسم الفارماكولوجيا والعلاجات التجريبية في كلية الطب بجامعة تافتس. وأنا إيمانويل بوثوس. وسنوضح لكم اليوم إجراءً لاستزراع خلايا الدوبامين الأولية في الدماغ المتوسط من مواليد القوارض.

تتضمن هذه العملية الخطوات التالية: تحضير الأدوات والكواشف، وتشريح الدماغ المتوسط لأدمغة القوارض من العمر P zero إلى P two، وتفتيت قطع الدماغ، وزراعة العصبونات المفككة. لذا، لنبدأ الآن.

في هذا الإجراء، هناك عدد من خطوات التحضير التي يجب تنفيذها مسبقاً قبل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من استزراع الخلايا العصبية الدوبامينية، حيث يجب زراعة الخلايا الدبقية لمنحها الوقت الكافي للتكاثر وتغطية قاع الأطباق. وسيتم استزراع الخلايا العصبية الدوبامينية الأولية فوق طبقة أحادية من الخلايا الدبقية قبل يوم واحد إلى سبعة أيام من استزراع الخلايا العصبية الأولية. يتم إزالة الوسط الغذائي من الخلايا الدبقية واستبداله بـ 2 mL من الوسط العصبي الطازج في اليوم الذي يسبق الاستزراع. يجب تعقيم جميع الأدوات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية، باستثناء أدوات التشريح، بما في ذلك 12 طبق تشريح.

قارورتان للفصل تحتويان على قضيب تحريك مغناطيسي دقيق. غطاءان للقوارير بهما ثقبان صغيران في الأعلى. حلقات انزلاق موزعة.

وبالنسبة لصندوق حلقات الشرائح، تذكر تركه مفتوحاً. يتم تعقيم جميع هذه الأدوات بـ 70% ethanol قبل البدء في يوم الزرع. أولاً، أخرج جميع مكونات محلول pepane الذي سيُستخدم لتفكيك محلول العصبونات الأولية من المجمد واتركها لتذوب.

قم بتجهيز لوح تسخين لتسخين دورق به ماء إلى 34 درجة Celsius من أجل عملية الهضم، وقم بتحضير ماء مشبع بالـ carbogen لأكسجنة محلول الـ pepane. وأثناء عملية الهضم، يتم تحضير 15 أنبوباً معقماً مملوءة بأربعة إلى ستة milliliters من محلول PBS المعقم لغسل الأدمغة قبل عملية التشريح ووضعها على الثلج. كما يتم تخصيص 20 إلى 30 milliliters من الوسط العصبي الطازج ووضعها في الحاضنة.

بعد ذلك، يتم تجهيز قارورة التفكيك باستخدام وحدة ترشيح قلابة معقمة لترشيح محلول pepane، والذي يتم نقله بعد ذلك إلى قارورة التفكيك باستخدام سعة 25 ملليلتر، ثم يتم إغلاق القارورة بسدادة، وإدخال حقنة معقمة عبر ثقب في السدادة، والتي تكون متصلة بمرشح بمسامية 0.2 micron. يتم توصيل الـ carbogen بالمرشح وتثبيته باستخدام شريط para film. ثم توضع القارورة في القرص المصنوع من البوليسترين (styrofoam).

بمجرد وضع أنبوبة الفصل في مكانها، تأكد من تحرك قضيب التقليب المغناطيسي. يتسرب الغاز إلى داخل الأنبوبة، وتكون درجة الحرارة قد استقرت عند 34 °C. يتم إدخال مجهر التشريح إلى غطاء السحب وتوضع أدوات التشريح على رقاقة من رقائق الألومنيوم.

بعد ذلك، قم بفرد مربع كبير واحد من رقائق الألومنيوم و12 مربعاً أصغر. اترك مقصاً لاستخدامه في عمليات قطع الرؤوس مع رقائق الألومنيوم. ضع صندوقاً من البوليسترين يحتوي على ماء ومثلج خارج غطاء الشفط.

بعد ذلك، قم بتحضير المخدر، وهو خليط مكون من 0.075 milliliter من الكيتامين و 0.075 milliliter من الزيلازين. ثم أحضر ما لا يقل عن 12 جروًا من العمر P0 إلى P2 لاستخدامها في أطباق بقطر 135 millimeter مع بئر زجاجي بقطر 23 millimeter للفئران، مع التأكد من تطابق النمط الجيني لجميع الجراء في البطن الواحد.

إذا كان النمط الجيني غير معروف، فستحتاج إلى زراعة خلايا كل حيوان في أطباق منفصلة والاحتفاظ بسجلات دقيقة لمطابقة الخلايا مع نتائج تحديد النمط الجيني اللاحقة. لبدء عملية التشريح، قم بتخدير الحيوان الأول عن طريق حقن ketamine Xylazine داخل الصفاق. وعندما لا يستجيب الحيوان لاختبار نفضة الذيل، وضعه في ماء مثلج لمدة 30 ثانية حتى تنخفض درجة حرارته.

بعد ذلك، قم بشطف مربع صغير من رقائق الألومنيوم ومقص قطع الرأس ورأس الحيوان بـ 70%ethanol لتجنب تلوث أنسجة الدماغ أثناء عملية التشريح، ثم قم بقطع الرأس باستخدام المقص، واترك الرأس يسقط على مربع رقائق الألومنيوم وانقله إلى تحت غطاء السحب. أخرج الدماغ برفق عن طريق قص الجلد أولاً باستخدام المقص الصغير لكشف الجمجمة، ثم قم بالقص حول الجمجمة بزاوية 360 درجة.

بعد ذلك، قم بإزالة غطاء الجمجمة باستخدام الملقط. ارفع الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة وضعه في أنبوب سعة 15 milliliter من PBS البارد على الثلج. أعد الأنبوب إلى الثلج قبل إزالة دماغ S التالي.

كرر عمليات التشريح حتى يتم الحصول على ثلاثة أدمغة في أنابيب منفصلة على الثلج. صب دماغاً واحداً مع PBS في طبق التشريح الأول. تحت المجهر، ضع الدماغ على منصة من غراء sill guard كدعامة لضمان بقاء الشفرة حادة.

استخدم ماصة نقل لوضع القطع في أنبوب جديد يحتوي على PBS لغسل القطع قبل نقلها إلى محلول papain. ابدأ تشغيل المؤقت عند وضع القطع الأولى، وواصل عمليات التشريح حتى يتم هضم جميع الأدمغة في محلول papain.

ستكون القطاعات الأولى من الدماغ قد خضعت للهضم لمدة ساعة تقريبًا. وبحلول الوقت الذي تُضاف فيه القطاعات الأخيرة، اترك عملية الهضم تستمر لمدة ساعة أخرى. تأكد من استقرار درجة الحرارة في حمام البيبسين عند 34 درجة Celsius.

لبدء خطوة التثبيت، استخدم ماصة نقل لوضع قطع الدماغ في أنبوب معقم سعة 15 milliliter. حاول تجنب نقل كمية زائدة من محلول pepane. ومع ذلك، إذا حدث ذلك، قم بإزالة الـ pepane الزائد.

بعد ذلك، اغسل القطع بإضافة 2 mL من الوسط العصبي الدافئ من الحاضنة. اترك القطع لتستقر، ثم تخلص بعناية من أكبر قدر ممكن من المحلول دون تحريك القطع. كرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالاً.

تذكر تغيير الماصات بين عمليات الغسيل لتجنب التلوث باستخدام ماصة نقل جديدة. ابدأ التكرارات في 2 mL من الوسط العصبي. قم بعملية الترجيد (Triturate) 25 مرة، مع تجنب دخول فقاعات الهواء.

بعد ذلك، اترك القطع غير المرتبطة تترسب لمدة ثلاث دقائق. استخدم ماصة نقل لجمع أكبر قدر ممكن من السائل العلوي دون تحريك القطع الموجودة في القاع. احتفظ بالسائل العلوي في أنبوب معقم جديد سعة 15 مليلتر.

كرر الخطوة السابقة باستخدام طرف ماصة سعة 1000 µL ثم طرف ماصة سعة 200 µL، وبعد ذلك يجب أن تظهر القطع منفصلة تماماً بالعين المجردة. يتم تجميع السائل الطافي من جميع العمليات في نفس الأنبوب سعة 15 mL. نحن الآن جاهزون لزراعة الخلايا؛ وأخيراً، يتم تكرار عملية النقل 10 مرات باستخدام ماصة نقل لتحقيق معلق خلوي متجانس من أجل العد.

باستخدام طرف ماصة أصفر معقم لتغطية كل طرف من ملاقط الإمساك. أسقط بحذر حلقة انزلاق بحيث تكون مركزة على الزجاج قدر الإمكان. ستُستخدم هذه الحلقات داخل كل طبق لعزل منطقة معينة ضمن طبق الزرع حيث سيتم توزيع العصبونات.

استخدم رأس الماصة لتمرير الحلقات فوق البئر المركزي لكل طبق. ثم أضف بلطف الحجم المناسب من الخلايا إلى الطبق. أضف الخلايا إلى مركز الحلقة التي قمت بوضعها مسبقاً في الطبق.

تذكر تغيير الرؤوس لكل طبق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول GDNF المخفف بالقرب من الحافة الخارجية للحلقة قدر الإمكان في كل طبق للمساعدة في تكاثر العصبونات. بعد ذلك، يتم إضافة مثبط الانقسام الفتيلي fluoro dioxine أو FDU خارج الحلقة لمنع نمو الخلايا الدبقية بشكل مفرط.

تُعاد رؤوس الماصات في كثير من الأحيان إلى الحاضنة وتُترك الخلايا لتترسب طوال الليل، وفي اليوم التالي، وباستخدام رؤوس ماصات معقمة لتغطية أطراف الملاقط، تُزال الحلقات وتُعاد الأطباق إلى الحاضنة مع تجنب تحريكها قدر الإمكان حتى يحين وقت التجارب. يجب فحص الأطباق يومياً للتأكد من عدم وجود تلوث محتمل، وفي حال ملاحظته، تُزال الأطباق الملوثة على الفور. وتكون المزارع جاهزة للاستخدام في تجارب الفيزيولوجيا الكهربائية، والبيولوجيا الجزيئية، والكيمياء النسيجية المناعية في غضون ثلاثة أسابيع.

بعد أن تم استزراع الخلايا، دعونا نلقي نظرة على بعض الأمثلة النموذجية للخلايا في المزرعة. نحن ننظر هنا إلى مزرعة أولية تم استزراعها قبل 14 يوماً. هذا مثال على مزرعة جيدة لأنك تستطيع رؤية أجسام خلوية متميزة مع استطالات تمتد منها.

بالإضافة إلى ذلك، لاحظ عدم وجود أي عفن أو نمو فطري في الطبق قد يشير إلى حدوث تلوث. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إنشاء مستنبتات أولية مفككة لخلايا الدوبامين في الدماغ المتوسط من مواليد القوارض. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على بيئة معقمة، واستخدام المواليد من P zero إلى P two فقط، والزراعة على ركائز دبقية صحية باستخدام وسط مكيف دبقي، والحفاظ على كثافة زراعة ثابتة.

هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.