تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

في مختبر كالدويل ، AKA ، كوخ الدودة ، ندرس آليات الأمراض العصبية بأناقة البحر. وبعد يوم طويل من التجارب المثمرة ، نكافئ أنفسنا ببعض الأنشطة الترفيهية. مرحبا ، أنا آدم نايت ، طالب جامعي من مختبر كالويل في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ألاباما.

اليوم ، سأوضح أنا وآخرون كيفية إجراء اختبار تنكس الخلايا العصبية الدوبامين في C Elegants. سأعبر سلالة الدودة التنكسية العصبية الدوبامين مع السلالات المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن الجينات المرتبطة بالأمراض المرشحة والخلايا العصبية الدوبامين. مرحبا ، أنا آدم هارينجتون ، طالب دراسات عليا في مختبر كالدويل.

سأوضح لك اليوم كيفية إعداد الديدان المعدلة وراثيا لتحليل الخلايا العصبية الدوبامين. مرحبا ، أنا شو أميتشي وأنا طالب دراسات عليا. هنا سأوضح لك كيفية فحص إدخال الخلايا العصبية الدوبامين الخاصة بك من أناقة C ، والتي تسمى ceps و aides.

بشكل عام ، لا تظهر الديدان التي تعبر عن GFP فقط في الخلايا العصبية الدوبامين موت الخلايا. ومع ذلك ، في وجود CLE ، ستلاحظ هؤلاء والتنكس العصبي المعتمد على العمر باستخدام هذا الاختبار ، يمكن التعبير عن الجين المعدل بشكل مشترك في الخلايا العصبية الدوبامين لتحديد ما إذا كان بإمكانه تعزيز أو قمع السمية الناجمة عن CLE. لذلك دعونا نبدأ.

قبل إجراء تحليل الخلايا العصبية الدوبامين ، يجب علينا أولا عبور سلالات GaN المناسبة للبدء في وضع ثماني مطاحن تعبر عن كل من نواة ألفا و GFP تحت سيطرة المحفز المحدد للخلايا العصبية الدوبامين على لوحة التزاوج. أضف الآن اثنين من L أربعة مراحل من أفروديت كاليفورنيا المعدلة وراثيا والتي تظهر تعبيرا محددا عن الخلايا العصبية الدوبامين للجين المرشح الذي يثير اهتمامنا ، بالإضافة إلى تعبير خلايا عضلية جدار الجسم لعلامة DS الحمراء القابلة للاختيار من الفلورسنت. من المهم ملاحظة أنه لكل بناء جيني معدل وراثيا ، فإننا ننتج ثلاثة خطوط معدلة وراثيا مستقرة.

لذلك يجب إجراء هذا التهجين الجيني بشكل فردي لكل من الخطوط المستقرة الثلاثة المنفصلة التي تم إنشاؤها. بعد يومين ، قم بإزالة الذكور والتخلص منها بعد يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. افحص جيل F1.

هناك العديد من النسل الذكور وكان التزاوج ناجحا. بعد ذلك ، انقل بشكل فردي إلى لوحات جديدة خمسة من أفروديت L أربعة من كل صليب تظهر كلا من علامة الفلورسنت GFP الموروثة من الوالد الذكر و DS الأحمر اثنين من علامات عضلة جدار الجسم الفلورية الموروثة من الوالد الحمادي. يجب أن تكون المنقولة في المرحلة الرابعة L للتأكد من أنها لم تقم بتشغيلها بعد.

مع وجود الذكور على الطبق ، اسمح للحيوانات بالتخصيب الذاتي لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام لإنتاج ذريتين. الآن قم بتنظيف ذرية F اثنين للقيام بذلك. انقل خمسة إلى 10 تظهر علامات السنت إلى لوحاتها الفردية.

ثم قم بفحص الجيل F الثلاثة للصفائح التي تعبر فيها مائة بالمائة من عن GFP في الخلايا العصبية الدوبامين والتي عبرت عنها بعض عن DS الأحمر وعلامتين الفلورسنت وخلايا عضلة جدار الجسم. ستكون هذه متماثلة اللواقح لجينات ألفا سينوكلين وجينات GFP وستنقل أيضا الجينات المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها حديثا بثبات. بمجرد اكتمال الفحص ، نكون مستعدين لإجراء تحليل الخلايا العصبية الدوبامينية.

لبدء تحليل الخلايا العصبية ، قم بإعداد صفيحة جديدة من الثلاثة F التي تم تحديدها في الخطوة السابقة. قم بإعداد لوحة لكل من الخطوط الثلاثة المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى اللوحة ، فإن سلالة ألفا سينوكلين GFP وحدها كعنصر تحكم يسمح للديدان بالنمو حتى مرحلة البلوغ.

بمجرد أن تصل الديدان إلى سن الرشد ، انقل 30 إلى 40 معدليا وراثيا من كل سطر إلى طبق جديد. اسمح لهم بوضع البيض لمدة خمس ساعات عند 20 درجة مئوية. بعد خمس ساعات ، قم بإزالته والتخلص منه.

يسمح البالغون للأجنة بالتطور لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة الرابعة. بعد ذلك ، اختر حوالي مائة من L أربعة معدلة وراثيا إلى صفيحة تحتوي على 0.04 ملليغرام لكل مليلتر من خمسة فلورو. اثنين من الديوكسي يوريدين.

يمنع هذا التناظري للنيوكليوتيدات تطور الجيل التالي عن طريق تثبيط تخليق الحمض النووي. نظرا لأن ألواح FDUR حساسة للضوء ، فقم بحمايتها من الضوء عن طريق إبقاء الألواح مغطاة وملفوفة بالكامل. اصنع وسادة إجمالية لتحليل الدودة.

تستخدم هذه طازجة ولا يسمح لها بالجفاف. ضع شريحتين مجهريين لهما قطعة من الشريط العبر. طوليا. يعمل الشريط كمبادر للوسادات السميكة المتكافئة.

ضع شريحة ثالثة بينهما على المقعد. إنهم في وضعهم. ثلاثة جنبا إلى جنب.

ضع قطرة من arus المنصهر على الجانب الأوسط وقم بوضع شريحة أخرى بسرعة فوق agros عموديا اثنين وعبر جميع الشرائح الثلاث. كرر ذلك لعمل عدة وسادات إضافية بقدر ما هو مطلوب لعدد العينات المراد تحليلها. بمجرد أن تصبح وسادات المثقاب جاهزة ، ضع قطرة ستة ميكرولتر من ثلاثة ملليمولات ، منشار 11 ميلا ومخدر على غطاء زجاجي مقاس 22 × 30 ملم.

اختر 40 بالغا في القطرة ثم اقلب زجاج الغطاء على وسادة agros. كرر لكل من السطر الآخر. سجل 30 في كل سطر لوجود كل CEP وخلية عصبية D.

باستخدام مجهر مركب مع مضان epi في مكعب مرشح يسمح بتصور FITC أو GFP ، سنستخدم بيانات سجل مكعب مرشح endo G-F-P-H-Y-Q على ورقة تسجيل. تحتفظ البرية ب GFP الكامل للحصول على دروس في جميع الخلايا العصبية الأربعة CEP واثنين من الخلايا العصبية A DE. يتم تسجيل الفردية التي تظهر فقدان الخلايا العصبية D على أنها نوع بري معروف أو متدهور.

يتم تسجيل هذه الخلايا العصبية على أنها LG أو فقدان GFP. وبالمثل ، يمكن تسجيل مدى التنكس عن طريق حساب إجمالي الخلايا العصبية المفقودة في كل بالإضافة إلى تكرار السكان للتحليل مرتين أخريين. استخدام 30 إضافيا لكل سطر لكل تجربة.

يتم حساب متوسط العدد الإجمالي للديدان التي تظهر الخلايا العصبية الدوبامين من النوع البري من الجولات الثلاث من التحليل. ثم يتم إجراء التحليل الإحصائي للحماية العصبية باستخدام قيمة P لاختبار T للطالب أقل من 0.05. لمقارنة الديدان الضابطة مع السلالات التي تفرط في التعبير عن الجينات المرشحة في الخلايا العصبية الدوبامين إجراء هذا التحليل لأيام مختلفة بعد حارة البيض, الأيام المناسبة من التحليل المحددة تجريبيا.

على سبيل المثال ، قررنا أن 77٪ 87٪ و 90٪ من alpha CLE plus GFP تظهر خلايا عصبية دوبامين متدهورة في اليوم السادس والسابع والعاشر بعد التطوير على التوالي. لذلك ، إذا توقعنا أن الجين المعدل المعني قد يعزز التنكس العصبي ، فسنقوم بتحليله في اليوم السادس. وبالمثل ، سيتم تحليل الجينات المعدلة وراثيا التي قد تثبط التنكس العصبي في اليومين السابع والعاشر.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء اختبار التنكس العصبي للدوبامين في أناقة البحر. عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه استخدم علامة مناسبة للاختيار أثناء التهجين الجيني. ثانيا ، استخدم الذكور الأصحاء و L four HEDIS للصلبان.

وثالثا ، تأكد من تسجيل الخلايا العصبية CEP و DE بعناية وباستمرار. سيسمح لك هذا الإجراء بإجراء فحص سريع للعامل الوراثي الذي قد يعزز أو يثبط التنكس العصبي الناجم عن ألفا ألفا CLE. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.