تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

في مختبر كولدويل، والمعروف أيضاً باسم "كوخ الديدان"، ندرس آليات الأمراض العصبية في ديدان *Caenorhabditis elegans*. وبعد يوم طويل من التجارب المثمرة، نكافئ أنفسنا ببعض الأنشطة الترفيهية. مرحباً، أنا آدم نايت، طالب جامعي من مختبر كولدويل في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ألاباما.

سأقوم اليوم، ومعي آخرون، بتوضيح كيفية إجراء مقايسة لتنكس الخلايا العصبية الدوبامينية في ديدان C Elegans. سأقوم بإجراء تهجين لسلالة من الديدان التي تعاني من تنكس عصبي دوباميني مع سلالات معدلة وراثياً تفرز بشكل مفرط جينات مرشحة ذات صلة بالمرض وخلايا عصبية دوبامينية. مرحباً، أنا آدم هارينغتون، طالب دراسات عليا في مختبر كولدويل.

سأعرض لكم اليوم كيفية إعداد الديدان المعدلة وراثياً لتحليل عصبونات الدوبامين. مرحباً، أنا شو أميتشي، طالبة دراسات عليا. سأوضح لكم هنا كيفية فحص عصبونات الدوبامين في ديدان C elegance، والتي تسمى ceps و aides.

بشكل عام، لا تظهر الديدان التي تعبر عن GFP فقط في عصبونات الدوبامين موتاً خلوياً. ومع ذلك، في وجود CLE، ستلاحظ حدوث ذلك والتنكس العصبي المرتبط بالعمر. باستخدام هذا المقايسة، يمكن التعبير المشترك عن جين منقول في عصبونات الدوبامين لتحديد ما إذا كان بإمكانه تعزيز أو تثبيط السُمّية الناتجة عن CLE. لذا، فلنبدأ.

قبل إجراء تحليل عصبونات الدوبامين، يجب أولاً تهجين سلالات GaN المناسبة للبدء بوضع ثماني ديدان تعبر عن كل من α-nucle وGFP تحت تحكم المحفز الخاص بعصبونات الدوبامين dat one على طبق التزاوج. الآن، أضف ديدان ca معدلة وراثياً في المرحلة L4، والتي تُظهر تعبيراً خاصاً بعصبونات الدوبامين للجين المرشح قيد الدراسة، بالإضافة إلى تعبير خلية عضلة جدار الجسم لعلامة الاختيار الفلورية DS red two. من المهم ملاحظة أننا ننشئ ثلاثة خطوط مستقرة معدلة وراثياً لكل بنية جينية منقولة.

لذلك، يجب إجراء هذا التهجين الجيني بشكل فردي لكل سلالة من السلالات المستقرة الثلاث المنفصلة التي تم إنشاؤها. بعد يومين، قم بإزالة الذكور والتخلص منها بعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. ثم افحص جيل F1.

هناك عدة ذروريات من الذكور وكان التزاوج ناجحاً. بعد ذلك، انقل بشكل فردي إلى أطباق جديدة خمسة حيوانات من Aphrodite L four من كل عملية تهجين، على أن تظهر هذه الحيوانات كل من علامة GFP الفلورية الموروثة من الأب الذكر وعلامة DS red two الفلورية لعضلات جدار الجسم الموروثة من الأب hamadi. يجب أن تكون الحيوانات المنقولة في مرحلة L four لضمان أنها لم تصل بعد إلى مرحلة M.

مع وجود الحيوانات الذكرية على الطبق، اترك الحيوانات تقوم بالتلقيح الذاتي لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام لإنتاج نسل الجيل الثاني F two. الآن، قم بتنقية نسل الجيل الثاني F two؛ وللقيام بذلك، انقل من خمسة إلى 10 حيوانات تظهر عليها كلتا العلامتين المرجعين إلى أطباق فردية خاصة بها.

بعد ذلك، يتم فحص الجيل الثالث (F3) لتحديد الأطباق التي يُظهر فيها مائة بالمائة من الحيوانات تعبير GFP في العصبونات الدوبامينية، والتي يعبر فيها بعض الحيوانات عن الوسم الفلوري DS red two في خلايا عضلات جدار الجسم. ستكون هذه الحيوانات متماثلة الزيجوت لجينات alpha synuclein وGFP، كما ستنقل الجين المعدل الذي تم إنشاؤه حديثاً بشكل مستقر. وبمجرد اكتمال عملية الفحص، نكون مستعدين لإجراء تحليل العصبونات الدوبامينية.

لبدء تحليل العصبونات، قم بتجهيز طبق حديث من الحيوانات الثلاثة (F) التي تم تحديدها في الخطوة السابقة. قم بإعداد طبق لكل سلالة من السلالات المعدلة وراثياً الثلاث. بالإضافة إلى ذلك، قم بتجهيز طبق لسلالة alpha-synuclein GFP وحدها كعينة ضابطة، واترك الديدان لتنمو حتى مرحلة البلوغ.

بمجرد وصول الديدان إلى مرحلة البلوغ، انقل من 30 إلى 40 حيواناً معدلاً وراثياً من كل سلالة إلى طبق جديد. اتركها لتضع البيض لمدة خمس ساعات عند 20 °C. بعد مرور خمس ساعات، قم بإزالتها والتخلص منها.

تُترك الأجنة لتنمو في وجود البالغين لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام عند 20 °C حتى تصل إلى مرحلة L4. بعد ذلك، يتم نقل حوالي مئة حيوان من مرحلة L4 المعدلة وراثياً إلى طبق يحتوي على 0.04 mg/mL من 5-fluorodeoxyuridine.

يمنع هذا النظير النيوكليوتيدي تطور الجيل التالي عن طريق تثبيط تخليق DNA. وبما أن أطباق FDUR حساسة للضوء، يجب حمايتها من الضوء عن طريق إبقاء الأطباق مغطاة وملفوفة بالكامل. قم بإعداد وسادة agar للتحليل الدودي.

تُستخدم هذه المواد طازجة ولا يُسمح بجفافها. ضع شريحتين مجهريتين عليهما قطعة من الشريط اللاصق بشكل طولي. يعمل الشريط اللاصق كفاصل لضمان الحصول على وسادات ذات سمك متساوٍ.

ضع شريحة ثالثة بينهما على طاولة المختبر. لقد تم وضعها الآن، بحيث تكون الثلاث شرائح متراصة جنباً إلى جنب.

ضع قطرة من agar المنصهر في منتصف الشريحة، ثم ضع بسرعة شريحة أخرى فوقها بشكل عمودي، ثم شريحة ثالثة فوقهما. كرر هذه العملية لإعداد عدة منصات إضافية حسب عدد العينات المراد تحليلها. وبمجرد تجهيز منصات agar، ضع قطرة بحجم 6 µL من مسحوق تخدير بتركيز 3 mM على غطاء زجاجي مقاس 22 × 30 mm.

اختر 40 حيواناً بالغاً وضعها في القطرة، ثم اقلب غطاء الشريحة فوق وسادة agarose. كرر هذه العملية لكل سلالة من السلالات الأخرى. قم بتقييم 30 حيواناً لكل سلالة للتحقق من وجود كل من العصبون CEP والعصبون D.

باستخدام مجهر مركب مزود بفلورة فوقية في مكعب ترشيح يسمح برؤية FITC أو GFP، سنستخدم مكعب ترشيح endo G-F-P-H-Y-Q لتسجيل البيانات في ورقة رصد. تحتفظ الحيوانات من النوع البري ببروتين GFP كاملاً في جميع الخلايا العصبية الأربع CEP وخلايا A DE العصبية. يتم تصنيف الحيوانات الفردية التي تظهر فقدان الخلايا العصبية D على أنها نوع بري معروف أو متحللة.

يتم تسجيل هذه الخلايا العصبية على أنها LG أو فقدان لـ GFP. وبالمثل، يمكن تقدير مدى التحلل عن طريق عد إجمالي الخلايا العصبية المفقودة في كل حيوان، كما يكرر الباحث التحليل مرتين إضافيتين، باستخدام 30 حيواناً إضافياً لكل سلالة في كل تجربة.

يتم حساب متوسط العدد الإجمالي للديدان التي تظهر عصبونات دوپامينية من النوع البري من جولات التحليل الثلاث. ثم يُجرى التحليل الإحصائي للحماية العصبية باستخدام اختبار t لطلاب (student's T-test) بقيمة P أقل من 0.05. ولمقارنة الديدان الضابطة مع السلالات التي تفرط في تعبير الجينات المرشحة في العصبونات الدوپامينية، يتم إجراء هذا التحليل في أيام مختلفة تلي وضع البيض، حيث يتم تحديد الأيام المناسبة للتحليل تجريبيًا.

على سبيل المثال، حددنا أن 77% و87% و90% من حيوانات alpha CLE بالإضافة إلى GFP تظهر تدهوراً في الخلايا العصبية الدوبامينية في اليوم السادس والسابع والعاشر بعد التطور على التوالي. وبناءً على ذلك، إذا توقعنا أن الجين المنقول المستهدف قد يعزز التحلل العصبي، فسنقوم بالتحليل في اليوم السادس. وبالمثل، فإن الجينات المنقولة التي قد تثبط التحلل العصبي سيتم تحليلها في اليومين السابع والعاشر.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة للتنكس العصبي للدوبامين في دودة sea elegance. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ما يلي: أولاً، استخدم الواسم المناسب للاختيار أثناء التهجينات الجينية. ثانياً، استخدم ذكوراً سليمة ويرقات في الطور الرابع L4 HEDIS لإجراء التهجينات.

وثالثاً، تأكد من تسجيل عدد عصبونات CEP و DE بدقة وبشكل متسق. سيتيح لك هذا الإجراء الفحص السريع للعوامل الوراثية التي قد تعزز أو تثبط التنكس العصبي الناجم عن alpha alpha CLE. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.