نماذج لتوصيف الدوائية من المسوخ جيم ايليجانس نقل متشابك

مرحبا ، أنا كودي لوك من مختبر كالدويل في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ألاباما. أنا كايل لي وسأوضح لك كيفية تحضير الديدان لمقايسات التعرض للكربوهيدرات وPTZ. أنا برنارد تو وسأوضح لك كيفية إجراء فحوصات الكربوهيدرات.

أنا كايلين بيري وأنا مسؤول عن مقاطع فيديو البحر الأناقة. في هذا العرض التقديمي ، سأروي هذا العرض التقديمي وأعرض مقايسة التعرض ل PTZ. اليوم ، سنوضح أنا وزملائي كيفية توصيف طفرات الانتقال المشبكي بنموذج أناقة البحر للصرع بعد التعرض ل PTZ و Alde carb مع سلسلة من السلالات الطافرة التمثيلية.

لذلك دعونا نبدأ. سيبدأنا كايل لي اليوم بإظهار تحضير فحوصات الكربوهيدرات ALD في اليوم الأول من العملية. تأكد من أن ما لا يقل عن 30 ديدة من مرحلة الشباب من كل نمط وراثي ومن كل تكرار ستكون متاحة لمقايسات الكربوهيدرات ALD في اليوم الثاني.

من الأفضل أن يختار المجرب 50 أو أكثر من الديدان L من أربع مراحل على أطباق NGM الطازجة الخالية من مبيدات الفطريات مع e coli OP 50 كمصدر للغذاء. تنمو الديدان لمدة 12 إلى 24 ساعة في درجة حرارة ثابتة ومتساهلة. 20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية هي الأفضل ، على الرغم من أن 25 درجة مئوية مقبولة.

في اليوم الثاني ، اصنع محلول مخزون 100 مللي مولار من الديكارب و 70٪ إيثانول وزعي الكمية المناسبة من الديكارب على ألواح NGM. نحن نستخدم باستمرار 0.5 ملليمولار آل ديكارب عن طريق طلاء 37.5 ميكرولتر من 100 ملليمولار ألدي كربوهيدرات على 60 ملم من ألواح بتري غير مهواة مع 7.5 ملليلتر في الجرام. اترك ألواح الكربوهيدرات ألدي تجف لمدة 30 إلى 60 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.

ليس من الضروري كسر الأغطية بعد جفاف الألواح. أضف كميات متسقة من الإشريكية القولونية في وسط كل طبق من الكربوهيدرات وجففها لمدة 30 إلى 60 دقيقة أخرى. في درجة حرارة الغرفة ، نضيف عادة 25 ميكرولترا من الإشريكية القولونية OP 50.

يخلق هذا الحجم من OP 50 عشبا غذائيا بحجم كاف لإبقاء الديدان في مكان صغير من وسط الطبق دون اكتظاظ. بمجرد أن يجف عشب الطعام ، تابع فحوصات ألبا كربوهيدرات. نظرا للطبيعة الذاتية لمقايسات الكربوهيدرات ALD ، يوصى بشدة بإجراء التجارب بشكل أعمى.

للقيام بذلك. يقوم زميل المجرب الأساسي بإعادة تسمية الألواح الأصلية التي تحتوي على الديدان المراد فحصها ، أو يمكن للزميل نقل الديدان من اللوحات الأصلية إلى تشفير ألواح الكربوهيدرات مباشرة قبل بدء المؤقت. الآن بعد أن تم تصنيع البورون ، سيشرع ABO في التحليل لبدء التحليل ، وحساب عدد الديدان المشلولة.

هناك طريقتان رئيسيتان لتحديد الشلل الناجم عن الديكارب الحاد. يحدد النهج الأول الشلل عن طريق التوقف عن ضخ البلعوم. في ملاحظة الفيديو هذه ، هيكل مظلم يقع داخل تجويف البلعوم الدودي على يمين الشاشة.

يسمى هذا الهيكل المطحنة ويتقلص بشكل إيقاعي من خلال آلية اتروبين. تباطأت حركة الدودة في هذا الفيديو بشكل كبير من التعرض ل Al Decarb. ومع ذلك ، لا تزال طاحونة البلعوم لهذه الدودة تتحرك بوضوح.

لذلك ، لا تصاب هذه الدودة بالشلل بسبب توقف تعريف الضخ. يجب على المرء أن يرى في هذا الفيديو أن طاحونة البلعوم الموجودة على يمين الشاشة لا تتعاقد مع توقف الضخ كتعريف عملي للشلل الناجم عن الديكارب. يجب أن تسجل هذه الدودة على أنها مشلولة.

ومع ذلك ، مثل الدودة في الفيديو السابق ، تظهر هذه الدودة حركات طفيفة للبحث عن الطعام. على الرغم من إعاقة حركتها بواسطة Al Decarb ، فإن هذه الحركات ستمنع المجرب من اعتبار هذه الدودة مشلولة بسبب النهج الثاني لتحديد الشلل الناجم عن Al Decarb ، وعدم حركة الجسم بالكامل وعدم الاستجابة للمس. يتضمن النهج الثاني لتحديد الشلل الناجم عن الديكارب حث كل دودة باستمرار بسلك بلاتيني والتحقق من الاستجابة.

إذا تعذر اكتشاف حركات الجسم بالعين المجردة ، فإن نهجنا المفضل هو دفع الديدان مرتين على الرأس ومرتين على الذيل كل 30 دقيقة لمدة ثلاث ساعات. كما يجب أن ترى ، من الواضح أن الدودة في هذا الفيديو لا تحرك جسمها. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الدودة تستجيب للحث عن طريق تحريك ذيلها بوضوح ، فإننا لا نسمي هذه الدودة مشلولة.

حسب التعريف الثاني للشلل الناجم عن الديكارب. مثل الدودة في الفيديو السابق ، من الواضح أن هذه الدودة لا تحرك جسمها وبالتالي تتطلب اختبار حث. ومع ذلك ، على عكس الدودة في الفيديو السابق ، فإن هذه الدودة لا تستجيب بوضوح للحث.

لذلك ، تصاب هذه الدودة بالشلل بسبب التعريف الثاني للشلل الناجم عن الديكارب. على الرغم من أن الفرق بين المشلول وغير المشلول بسبب ألد كربوهيدرات يمكن أن يكون دقيقا ، إلا أن المجربين يجب أن يكونوا قادرين على تحديد التغيرات الجوهرية والانتقال المشبكي ببساطة عن طريق مراقبة أعداد كبيرة من الديدان التمثيلية المعرضة ل Al Decarb مباشرة بعد التقاطها على ألواح Al Decarb. الديدان البرية لا تزال متحركة.

في هذا الفيديو. سيرى المرء نفس الديدان البرية من الفيديو السابق بعد ساعة واحدة من التعرض ل Al Decarb. لاحظ أن الديدان تتباطأ إلى حد ما ولكنها لا تزال تتحرك بشكل واضح.

على عكس الديدان البرية ، فإن طفرات Tomasin one في هذا الفيديو إما مكدودة تماما أو بالكاد تتحرك بعد ساعة واحدة من التعرض. تتوافق هذه النتيجة مع طفرات توماسين واحدة التي تحتوي على إفراز أستيل كولين زائد من عدم القدرة على تنظيم إطلاق الناقل العصبي سلبا عند التقاطعات العصبية العضلية ، والأستيل كولين الزائد والشقوق المشبكية عند التقاطعات العصبية العضلية جنبا إلى جنب مع تثبيط تحلل الأسيتيل كولين ، فإن Bial Decarb يجعل توماسين طفرات شديدة الحساسية ، على الرغم من عدم عرضه هنا ، فقد تم افتراض أن نتائج مماثلة تنشأ من فحوصات ألدي الكربوهيدرات مع فقدان الأليلات الوظيفية في 43 ، الذي يشفر C elegance ortho log من الكالسيوم كال مولين يعتمد على بروتين كيناز اثنين. يظهر هذا الفيديو على 25 طفرة ، والتي تعاني من نقص في انتقال GABAergic المثبط.

بعد ساعة واحدة من التعرض لكربوهيدرات ألدي ، على غرار طفرات توماسين واحد و M 43 ، تظهر هذه الطفرات إعاقات حركية كبيرة ناتجة عن الكربوهيدرات ويبدو أنها أكثر تأثرا من الديدان البرية التي تتعرض ل al Decarb لفترة زمنية مماثلة. تتوافق هذه النتيجة مع طفرات M 25 التي فرطت في تحفيز عضلات جدار الجسم من مزيج من التعرض ل Al Decarb وانخفاض انتقال GABAergic مما يؤدي إلى زيادة نسبة الانتقال المثبطة إلى المثبطة في الوصلات العصبية العضلية CL ELs والشلل اللاحق. ومع ذلك ، نظرا لأن توماسين واحد على 43 و 25 متحولات يظهران حساسيات مماثلة ل Al Decarb في هذه المرحلة الزمنية.

على الرغم من وجود أسباب مختلفة للتحفيز المفرط لعضلات جدار الجسم ، إلا أن المجرب لم يستطع معرفة الآلية الأساسية لفرط الحساسية دون معرفة هويات الطفرات المسببة أولا. في هذا الفيديو ، عدنا إلى نفس الديدان البرية من مقطع فيديو سابق بعد ثلاث ساعات من التعرض ل Al Decarb في هذه النقطة النهائية من اختبار الكربوهيدرات ALD ، يجب على المرء أن يرى بوضوح أن هذه الديدان ، على الرغم من كونها من النوع البري ، إما مشلولة تماما أو بالكاد تتحرك. تشبه هذه الديدان الآن ظاهريا طفرات TOM one و M 25 الموضحة بعد ساعة واحدة من التعرض لكربوهيدرات ألدي ، على الأرجح لأن انتقال الكولين الاستثاري قد وصل إلى مستويات مماثلة على عكس الديدان البرية ، تظل طفرات Synap Bren one متحركة إلى حد كبير في ثلاث ساعات من التعرض لكربوهيدرات الألدي.

تتوافق هذه النتيجة مع Synaptive Bren ، والتي تفتقر إلى المستويات الطبيعية لإفراز الناقل العصبي ، ولديها تحفيز كوليني أقل في عضلات جدار الجسم من الديدان البرية الخشبية بعد مستويات متطابقة من التعرض للكربوهيدرات الألدي في هذا الوقت. يجب أن يكون لنقطة على أربعة طفرات ، والتي تعاني من نقص في انتقال اتروبين ، حساسيات مماثلة ل Al Decarb مثل Synaptive Bren واحد المسوخ. على العكس من ذلك ، لا تزال الطفرات شديدة الحساسية Tomasin one و O 25 مشلولة ، على عكس الديدان البرية.

تجدر الإشارة إلى أن بعض الديدان ، خاصة تلك المقاومة ل Al Decarb ، قد تحاول الزحف من اللوحة. في هذه الحالة ، قد ينشر المجرب كمية ثابتة من حمض البالمتيك ، وهو حاجز مادي لحركة الديدان. حول ألواح الديكارب ، ننشر 25 ميكرولترا من 10 ملليغرام من حمض البالمتيك لكل مليلتر من الإيثانول.

هذا يكمل نموذج التعرض ل Decarb. الآن ، سأوضح نموذج التعرض Penta Lean Terazol. سوف تساعدنا كايلين بيري في فحوصات PTZ.

يعد تحضير الديدان لمقايسات PTZ في الأساس نفس تحضير الديدان لمقايسات ألدي كربوهيدرات. الاختلافات المهمة الوحيدة بين المقايسين هي كما يلي. نستخدم DDH two O كمذيب PTZ بدلا من 70٪ من الإيثانول.

أيضا ، نظرا لأننا كثيرا ما نقوم بطلاء كميات أكبر من PTZ من كربوهيدرات ALDE ، فإننا نسمح للألواح بالجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إضافة OP 50. يمكن أيضا استخدام حمض البالمتيك مع PTZ. أيضا ، من المهم ملاحظة أن PTZ أقل استقرارا بكثير من ألد كربوهيدرات ويجب تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

لبدء التحليل ، احسب عدد الديدان المتشنجة بالضوء الصرعي كل 30 دقيقة لمدة ساعة واحدة. من الأفضل تسجيل أعداد من الديدان بأنواع مختلفة من التشنجات في فئات منفصلة مثل التشنجات لكامل الجسم والتشنجات الأمامية ، والتي نسميها مزيج من الرأس من التشنجات الأمامية مع شلل عضلات جدار الجسم ، والذي نسميه الشلل المنشط الرمعي أو شلل كامل الجسم ، والذي نسميه منشط منشط. غالبا ما يتبع النشاط الشبيه بالنوبات كما يظهر مع الدودة على اليمين تشنجات منشطة رمعية كما هو موضح مع الدودة الموجودة على المنشط الأيسر.

يمكن أن ينتج النشاط الشبيه بالنوبات ببساطة عن إجهاد العضلات بعد التشنجات المنشطة الرمعية المتكررة. ومع ذلك ، تشير بياناتنا غير المنشورة إلى أن بعض الديدان يمكن أن تصبح منشطة على PTZ بطريقة مشابهة للشلل الناجم عن aldecarb دون أن تكون قد تم إغراقها من قبل. نعرض هنا دودة متحولة ممثلة للانتقال المشبكي تزحف في غياب مضاد مستقبلات PTZA GABA ومحفز النوبات الشائع في نماذج حيوانية مختلفة من النوبات والصرع.

لاحظ أن طرف أو أنف الدودة يتأرجح من جانب إلى آخر أثناء البحث عن الطعام. في هذا الفيديو، نعرض دودة أخرى من نفس السلالة المتحولة للإرسال المشبكي المستخدمة في الفيديو السابق. لاحظ أن هذه الدودة ، الموجودة في وجود 2.5 ملليغرام PTZ لكل مليلتر من الماء ، تستمر في الغالب في تحريك رأسها من جانب إلى آخر أثناء البحث عن الطعام.

ومع ذلك ، تتوقف هذه الدودة أحيانا عن البحث عن الطعام من جانب إلى آخر وبدلا من ذلك تدفع بشكل متكرر إلى الأمام. أخيرا ، يجب على المرء أن يرى دودة تحمل نفس الطفرة مثل الديدان في مقطعي الفيديو السابقين في وجود 10 ملليغرام PTZ لكل مليلتر من الماء. لاحظ أن هذه الدودة قد انخفضت في البحث عن الطعام من جانب إلى آخر وتدفع إلى الأمام بتردد وشدة أكبر من التركيز المنخفض ل PTZ.

توضح هذه النتائج اعتماد جرعة PTZ ، والذي نلاحظه مع جميع طفرات الإرسال المشبكي الحساسة ل PTZ. الأهم من ذلك ، أن التعرض ل PTZ لا يكفي للحث على تشنجات الصرع في الديدان البرية. وبالمثل ، فقد حاولنا ولكن لم نلاحظ تشنجات صرع ناتجة ب PTZ في الديدان ذات العجز المحدد في انتقال الكولين مثل أربعة أو الديدان ذات الانتقال الكوليني المفرط مثل توماسين واحد.

لذلك ، يجب أن يكون من الممكن توصيف طفرات الإرسال المشبكي بمقاومة ألدي كربوهيدرات إما من عجز في الوظيفة المشبكية العامة أو عجز محدد في الانتقال الكوليني بناء على حساسياتهم النسبية ل PTZ. ربما من المدهش أن هناك انخفاضا قويا في وظيفة ONC 25 متحولة ، والتي تفتقر إلى تعبير GABA القابل للاكتشاف في أناقة C. لا تظهر الخلايا العصبية الحركية المثبطة تشنجات ضوئية صرعية تلقائية كما هو موضح في هذا الفيديو.

متحولة ONC 25 على 10 ملليغرام PTZ لكل مليلتر من الماء. ومع ذلك ، يعرض تشنجات قوية منشط ورمعي ، على الرغم من عدم إظهار التشنجات الأمامية فقط مع بعض الحركة التي سبقت ONC 25 المرتبطة بالتشنجات المنشطة الرمعية وتحاكي تشنجات المشبك برين واحد الطفر. لذلك ، يجب ألا يفترض المجرب أن جميع طفرات GABA المثبطة ستظهر تشنجات منشطة أو نشاطا شبيها بنوبة منشط مرتبطة ارتباطا وثيقا في وجود PTZ ، لا سيما بالنظر إلى احتمالية الحصول على أليلات متحولة ناقص الشكل.

الآن بعد أن أظهرنا فرط الحساسية لكربوهيدرات الألد و PTZ عن طريق طفرات GABA المثبطة ، ولكن فقط فرط الحساسية لكربوهيدرات ألدي والحساسية الطبيعية ل PTZ بواسطة الطفرات التي تفتقر إلى التنظيم السلبي للانتقال الكوليني. قد يتساءل المرء كيف تبدو طفرات UNC 43 التي تفقد الوظيفة على PTZ لأنها أيضا شديدة الحساسية لكربوهيدرات Alda مثل طفرات النقل المشبكي الأخرى على 43 طفرة لا تظهر صرعا واضحا مثل التشنجات في غياب PTZ ، على الرغم من أن هذه الطفرات لديها تقلصات نادرة غير متكررة ، ولكنها لا تزال عفوية لكامل الجسم بعد التعرض ل 10 ملليغرام PTZ لكل مليلتر من الماء على 43 ، فقدان المسوخ الوظيفي موجودة ، قوية ، متكررة ، وتعتمد على الجرعة تشنجات لكامل الجسم. في هذا الوقت, هذه النتائج غامضة ولكن يبدو أنها تشير إلى أنه على 43 يجب ألا يكون لها دور محدد في انتقال جابايرجيك المثبطة أو دور في التنظيم السلبي فقط لإطلاق الناقل العصبي.

في الجهاز العصبي C elegance ، أوضحنا لك للتو كيفية توصيف طفرات النقل المشبكي CL elgan بالمنشطات العصبية المجانية ، وكربوهيدرات الألد ، ومثبط الكولينستراز ، ومضاد مستقبلات PTZA GABA. عند اتباع نموذج دوائي تكميلي ، تذكر أن درجة الحساسية لأحد المنشطات العصبية لا يمكن أن تتنبأ بدرجة الحساسية للمنشط العصبي الآخر ، يجب أن يساعد استخدام فحوصات ألدي كربوهيدرات في التمييز بين طفرات GABA المثبطة ، والتي تترأس بوب على PTZ ، ولكنها شديدة الحساسية لكربوهيدرات Alde من الطفرات التي تعاني من نقص الوظيفة المشبكية العامة ، والتي تترأس أيضا بوب على PTZ ، لكنها مقاومة لكربوهيدرات الألد. علاوة على ذلك ، يجب على المرء أن يدرك أن طفرات GABA المثبطة ترأس بوب على PTZ بينما تظهر الديدان التي تفتقر إلى التنظيم السلبي للانتقال الكوليني من النوع البري على PTZ.

لذلك ، يمكن أيضا استخدام اختبار PTZ للتمييز بين هذه الفئات من طفرات النقل المشبكي ، وكلاهما شديد الحساسية لكربوهيدرات Alde. باختصار ، يجب أن يسمح النهج التكميلي مع فحوصات PTZ و Alde carb للمجرب بتوصيف طفرات الإرسال المشبكي الأنيقة C بطريقة مستحيلة مع أي من الدواءين وحده. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.