Name: الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: اكتشف تقنية SDD-AGE لكشف تجمّعات الأميلويد في العينات البيولوجية باستخدام هلام الأغاروز. توفر هذه الطريقة بروتوكولاً موثوقاً لتحليل البوليمرات البروتينية المقاومة للتغيّر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر سايمون البرتي للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM25874) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي Investigatorship (لSL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم منح التدريب predoctoral (لRH).

<html> الجزء 1 : تحضير هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع علبة صب جل. ويمكن استخدام المعدات القياسية للالكهربائي الحمض النووي الأفقي. لأعداد كبيرة من العينات ، ونحن نستعد سم 20 × 24 سم البلاطة مع ما يصل الى 50 أمشاط جيدا الأربعة. تأكد من لوح لايوجد خدوش ، وهذه يمكن أن تشوه صورة لطخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايجاد حل agarose 1.5 ٪ (متوسطة أو عالية القوة هلام ، تكافؤ فرص العمل قليلة) في تاي 1X. ينبغي أن تكون كافية لحجم غمر أسنان المشط تماما -- ستحتاج لتحميل عينة أكبر قدر ممكن لتعظيم الكشف. الميكروويف الخليط حتى يذوب تماما agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة SDS بسرعة إلى 0.1 ٪ من الأسهم 10 ٪. دوامة إلى المزيج. إذا كانت بعض agarose يتصلب خلال هذه الخطوة ، redissolve باستخدام صفيحة ساخنة وتوخي الحذر لتجنب الغليان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الحل في درج الصب. استخدام المشط لأشعل النار من أي فقاعات ، لأنها يمكن أن تتداخل مع نقل في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد وضعت بعد جيل ، وإزالة أمشاط ووضع الجل في خزان هلام. يغرق تماما في الجل 1X TAE تحتوي على 0.1 ٪ SDS. </li></ol> الجزء 2 : تحضير عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنتاجية العالية للتحليل lysates الخميرة ، ونحن نبدأ مع 2 مل الثقافات نمت بين عشية وضحاها مع الانفعالات السريعة في كتل 96 - جيدا. في هذه الحالة ، كل ثقافة هو overexpressing بروتين من الفائدة. عند تحليل البروتينات وفرة منخفضة ، يجب استخدام كميات أكبر ثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 2000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في جهاز الطرد المركزي والمياه مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في حل 1 مل spheroplasting. احتضان لحوالي 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية (قد تؤكد كفاءة spheroplasting بواسطة الفحص المجهري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 800 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts مكعبات في 100 مل تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كتلة مع الشريط ودوامة على سرعة عالية لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحطام الخلوي في 4000 RCF لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف إلى حاوية جديدة ، على سبيل المثال ، وكذلك لوحة 96 - PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك ، تحديد تركيز البروتين من lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4X العازلة العينة إلى عينات لتوليد lysates 1X العازلة التي تحتوي على العينة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل هلام. إذا رغبت في ذلك ، حفظ نصف حجم العينة وأنها تغلي لSDS - PAGE التحليل. من أجل رصد مدى نقل في وقت لاحق ، وتشمل ما قبل الملطخة SDS - PAGE علامة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علامة الوزن الجزيئي التي تتكون من البروتينات كبيرة جدا (على سبيل المثال ، والدجاج استخراج الصدرية) لتقدير أحجام المجمعات حلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل في الجهد المنخفض (3 ≤ طول هلام V / سم) حتى تصل إلى الجبهة صبغ ~ 1 سم من نهاية الجل. وسوف يستغرق ذلك عدة ساعات. من المهم أن تظل جل بارد ، وإلا نشر منخفضة الوزن الجزيئي بروتين (على سبيل المثال ، مونومرات) يمكن أن تحد من الكشف عنها. </li></ol> الجزء 3 : نقل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة من النيتروسليلوز للأبعاد نفس الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 قطعة من قطع GB004 و 8 قطع من الورق النشاف GB002 ، للأبعاد نفس الجل. قطع قطعة إضافية من GB004 لاستخدامه بمثابة الفتيل ؛ جعله حوالي 20 سنتيمترا على نطاق أوسع من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر النيتروسليلوز ، الفتيل ، و 4 قطع من GB002 في TBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وعاء من البلاستيك وتجميع كومة من الأوراق على النحو التالي : 20 قطعة من GB004 الجافة ، ثم 4 قطع من GB002 الجافة ، ثم قطعة واحدة من قبل GB002 الرطب. النيتروسليلوز وضع على رأس هذا المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجل على الدرج لفترة وجيزة في صب الماء لإزالة الزائدة العازلة على التوالي. ثم ، تبدأ بعناية لشريحة الجل قبالة الدرج إلى المكدس. في حين ينزلق الجل قبالة الدرج ، مع غشاء اخماد TBS حسب الضرورة. المخزن المؤقت إضافية تساعد على منع هذه الفقاعات من أن تصبح محاصرين تحت الجل. ماصة نقل يعمل بشكل جيد لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم نقله الجل إلى المكدس ، تحقق بدقة عن الفقاعات. إذا أي وجود ، ورفع حافة جل وتطبيق العازلة حتى يمكن عمل فقاعات الخروج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الثلاثة المتبقية قبل المبللة GB002 القطع على قمة هلام. ضمان الاتصال بين جميع طبقات شامل من قبل المتداول ماصة بحزم عبر الجزء العلوي من المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجناح المكدس نقل مع اثنين من الأدراج التي تحتوي على TBS مرتفعة. ثنى الفتيل قبل الرطب عبر مكدس بحيث يتم إما مغمورة نهاية الفتيل في TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية المكدس نقل تجميعها مع علبة بلاستيكية إضافية تحمل الوزن الزائد (على سبيل المثال ، زجاجة 500 مل من الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للنقل على المضي مدة لا تقل عن ثلاث ساعات ، أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل ، يمكن معالجتها من خلال الغشاء القياسية الغربية النشاف. </li></ol> Spheroplasting الحل 1.2 D - M السوربيتول 0.5 مم MgCl 2 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 50 ملي BME (إضافة جديدة) 0.5 ملغ / مل Zymolyase 100T (إضافة جديدة) coration : تسطير &quot;؛ الاحتياطي تحلل&gt; 100 ملي تريس 7.5 50 ملي كلوريد الصوديوم 10 ملي BME (إضافة جديدة) مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة) 4X نموذج العازلة 2X TAE 20 ٪ الجلسرين 8 ٪ SDS زرقة البروموفينول إلى تفضيل

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

وكانت أول SDD - AGE بواسطة Kryndushkin آخرون 1 ، لدراسة SDS المقاوم للمجمعات [PSI +] بريون في الخميرة ، ولقد وجدت دراسة على نطاق واسع منذ استخدام كلا بريون وعدم بريون المجاميع 2-9. ومع ذلك ، نقل البروتينات إلى غشاء التالية الكهربائي في هلام agarose إشكالية ، ويمكن أن يؤدي في صورة مشوهة لطخة 5. بالإضافة إلى ذلك ، تقنية المغمورة electroblotting الأكثر استخداما يقدم القيود العملية لحجم الهلام ، وبالتالي عدد العينات التي يمكن معالجتها. وقد تناولنا هذه المشاكل من خلال توظيف نقل الشعرية النزولي 10 ، وهو إجراء بسيط والذي يستخدم كومة من الأوراق الجافة النشاف لنقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز. نقل الشعرية يمنع تشويه ويسمح معالجة المواد الهلامية كبيرة بسهولة. هناك بضعة أشياء يجب مراعاتها قبل استخدام SDD - AGE. لعينات الخام (على سبيل المثال ، lysates) ، مناعي من بروتينات معينة أمر ضروري. SDD - AGE لا تفسد تماما مجمعات البروتين من الفائدة ، ولذلك فإن بروتين (ق) ليتم الكشف يجب أن تحمل علامة حاتمة خارج المنطقة amyloidogenic. عموما يمكن Lysates يكون مستعدا لأنها ستكون لSDS - PAGE عادية ، مع اثنين من الاختلافات الهامة. أولا ، يجب زيادة العناية التي يجب اتخاذها لمنع تدهور بواسطة التحلل البروتيني. تغيير طبيعة الظروف جزئيا المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل البروتياز ، ويمكن أيضا جعل البروتينات المستهدفة أكثر عرضة للتحلل البروتين. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل في تركيز كامل على الأقل شقين الموصى بها. ثانيا ، ينبغي تجنب التدفئة العينات. إذا كان هو المطلوب لمراقبة جميع مونومر سلبية ، على سبيل المثال للتأكد من أن ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع ليست بسبب التعديلات التساهمية ، والحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية يمكن استخدامها ، والتي سوف استعادة معظم amyloids موحودي للبروتين.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>شركة Seikagaku</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>مزيج مثبطات البروتياز Halt</td><td>شركة Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>غشاء نيتروسليلوز Hybond-C extra</td><td>شركة Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>ورق ترشيح GB004</td><td>شركة Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>ورق ترشيح GB002 (3MM Chr)</td><td>شركة Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز (UltraPure)</td><td>شركة Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - agarose

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

ويرتبط مع العديد من تجميع اميلويد الأمراض misfolding البروتين وراء خصائص البريونات المعدية ، والتي هي conformationally الذاتي قالبي templating البروتينات التي يعتقد أن لها أدوار مفيدة في أقل الكائنات الحية. وقد Amyloids بالغ الصعوبة لدراسة بسبب عدم التجانس والصلابة الهيكلية. ومع ذلك ، فقد تم قرار من البوليمرات اميلويد على أساس حجم واللاانحلال المنظفات ممكن عن طريق تغيير طبيعة شبه منظفات - Agarose الكهربائي جل (SDD - AGE). هذا الأسلوب هو العثور على الاستخدام الواسع النطاق للكشف وتوصيف المتغيرات اميلويد بتكوين جزئي. هنا ، علينا أن نظهر للتكيف من هذه التقنية التي تسهل استخدامه في تطبيقات واسعة النطاق ، مثل شاشات البريونات للرواية والبروتينات amyloidogenic الأخرى. الجديد SDD - AGE يستخدم أسلوب نقل الشعرية لمزيد من الموثوقية وسهولة الاستخدام ، ويسمح استيعاب أي هلام الحجم. وبالتالي ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات ، وأعدت من الخلايا البروتينات أو المنقى ، في الوقت نفسه عن وجود SDS - الملتزمون غير قابلة للذوبان البروتينات المفتاحية.

SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

يرتبط تجمع الأميلويد بالعديد من اعتلالات سوء طي البروتين، وهو ما يكمن وراء الخصائص المعدية للبريونات، والتي تعد...

أهلاً بكم، أنا راندال هوفمان، طالب دراسات عليا في مختبر سوزان لينوس بقسم الأحياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT). سأقوم اليوم بتعريفكم على تقنية الفصل الكهربائي للهلام باستخدام أغاروز والمنظفات شبه المسخ، أو ما يعرف بـ SDD-AGE. يستخدم مختبرنا هذه التقنية للكشف عن البريونات والبروتينات الأخرى المكونة للتجمعات البروتينية.إن إصدارنا من تقدير العمر بواسطة SDD بسيط وموثوق ويمكن توسيع نطاقه لاستيعاب أي عدد من العينات. وتتميز الأميلويدات بمقاومة استثنائية للمسخ بواسطة SDS، مما يسمح بفصلها عن البروتينات الأخرى باستخدام SDDH. ومع ذلك، لا يمكن استخدام البيانات المستمدة من SDDH بمفردها لتأكيد أن مادة ما هي أميلويد.للقيام بذلك، ستحتاج إلى استخدام تقنيات أخرى. ومع وضع ذلك في الاعتبار، دعني أوضح لك. يمكن إجراء S-D-D-H-S-D-D-H باستخدام المعدات القياسية للهجرة الكهربائية الأفقية لـ DNA.أولاً، يجب تجميع صينية صب الهلام. سيعتمد حجم الجهاز على عدد العينات المتوفرة لديك. فبالنسبة للأعداد الكبيرة من العينات، نستخدم لوحاً بمقاس 20 × 24 centimeter، وما يصل إلى أربعة أمشاط سعة 50 well.لتحضير الهلام، ستحتاج إلى agarose منخفض الكهرومغناطيسية بصلابة متوسطة أو عالية، ومحلول منظم 1X TAE، ومحلول مخزون بتركيز 10% من SDS. قم بتحضير محلول agarose بتركيز 1.5% مع محلول 1X TAE. يُفضل جعل الهلام بسمك أكبر قدر ممكن لتمكين تحميل أكبر كمية من العينة ورفع كفاءة الكشف إلى الحد الأقصى. قم بتسخين الخليط في الميكروويف حتى يذوب agarose تماماً.أضف سريعاً مخزون XSDS بتركيز 100X إلى 0.1% وحرّك المزيج بحركة دائرية. إذا تجمعت بعض الأجار خلال هذه الخطوة، قم بإذابتها على لوح تسخين، مع الحرص على عدم وصول المحلول إلى درجة الغليان.بعد إضافة SDS، وبما أن المحلول سيفور بسهولة، صب هذا المحلول في صينية الصب بينما لا يزال ساخناً. ثم استخدم مشطاً للتخلص من أي فقاعات قد تتداخل لاحقاً أثناء عملية نقل الهلام. بعد أن يبرد الهلام تماماً ويتصلب، قم بإزالة الأمشاط بعناية وضع الهلام في الحوض.اغمر الهلام تماماً في محلول XTAE بتركيز 0.1% SDS. أنت الآن مستعد لتحميل العينات. يتم تحضير عينات البروتين المستخدمة في SDDH تماماً كما في SDS page مع وجود استثناءين هامين.أولاً، يجب تجنب تسخين العينات لأن ذلك قد يؤدي إلى تغيير طبيعة التجمعات البروتينية وتحويلها إلى مونومرات بروتينية. ثانياً، يجب الحرص على تجنب تحلل البروتين. ونظراً لأن ظروف تغيير الطبيعة المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل جميع البروتيازات، فإننا نوصي باستخدام ضعف التركيز الموصى به على الأقل من مزيج مثبطات البروتياز الكامل.في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم مستخلصات من خلايا خميرة تفرز بروتيناً معيناً مستهدفاً بشكل مفرط. نستخدم عادةً مزارع سعة 2 mL يتم تحضيرها طوال الليل في ألواح ذات 96 بئراً متوفرة من VWR، ولكن عند تحليل البروتينات ذات الوفرة المنخفضة، يجب استخدام أحجام مزارع أكبر.قم بحصد الخلايا عن طريق طرد مركزي للمزرعة عند 2000 RCF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي واغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في الماء وطردها مركزياً مرة أخرى. بعد الدورة الثانية، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في محلول التغطية المناسب. يقوم الإنزيم الموجود في المحلول بهضم جدران الخلايا، مما يسمح لك بتحليل الخلايا بكفاءة باستخدام حجم صغير من محلول التحلل. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.قم بترسيب الخلايا البلاستيكية الاحتياطية هذه المرة عند 800 RCF لمدة خمس دقائق. أزل السائل تماماً وأعد تعليق كل راسب في 100 µL من محلول التحلل. بعد ذلك، غطِّ الكتلة بشريط لاصق واستخدم جهاز الرجي (vortex) على سرعة عالية لمدة دقيقتين.يساعد ذلك في ترسيب جميع المواد البلاستيكية الكروية مع الحطام الخلوي عند 4,000 RCF لمدة دقيقتين. انقل السائل العلوي بعناية إلى لوحة PCR ذات 96 بئراً.عادةً ما نقوم بتحليل مئات العينات في وقت واحد في مختبرنا، لذا نستخدم نظاماً لمناولة السوائل لمساعدتنا في ذلك. إذا لزم الأمر، يتم تحديد تركيز البروتين في المحللات. بعد ذلك، أضف محلول عازل للعينات بتركيز 4x إلى العينات للحصول على محللات تحتوي على محلول عازل بتركيز 1x، ثم يتم التحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.قم الآن بتحميل العينات في الهلام. إذا كنت ترغب في ذلك، احتفظ بنصف العينات لتحليل SDS page. قم أيضاً بتحميل علامات الوزن الجزيئي، بما في ذلك العلامات المصبوغة مسبقاً وعلامة ذات وزن جزيئي مرتفع جداً مثل مستخلص chicken flector s.إذا رغبت في ذلك، فمن المهم الحفاظ على برودة الهلام لمنع انتشار البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، لذا قد تود تشغيله في الغرفة الباردة. قم بتشغيل الهلام بجهد منخفض أقل من ثلاثة فولت لكل سنتيمتر من طول الهلام. قم بتشغيل الهلام لعدة ساعات حتى تصل جبهة الفصل إلى مسافة سنتيمتر واحد تقريبًا من نهاية الهلام.نظراً لأن الأميلويد لا يتم مسخه باستخدام 2%SDS في درجة حرارة الغرفة، فإنه سيبقى سليماً بينما تتفكك المعقدات الأخرى، بما في ذلك معظم التجمعات غير الأميلويدية، في وجود 2%SDS. وبالتالي، ستكون معظم البروتينات في شكل مونومرات وتتحرك بسرعة عبر الهلام، بينما ستهاجر الأميلويدات ذات الوزن الجزيئي العالي والمقاومة لـ SDS بشكل أبطأ.بعد ذلك، سيكون الهلام جاهزاً للنقل. وعلى الرغم من إمكانية استخدام طرق نقل متعددة، فإننا نحصل على أفضل النتائج باستخدام النقل الشعيري. وبما أن النقل الشعيري يمكن أن يستوعب أي حجم من الهلام، فمن العملي تحليل مئات العينات باستخدام هذه الطريقة.تعمل مجموعة من أوراق الترشيح الجافة على سحب المحلول المنظم عبر الهلام، مما يؤدي إلى ترسيب البروتينات على غشاء نيتروسليلوز يوضع بين الأوراق والهلام. ستحتاج إلى قص قطعة من النيتروسليلوز، مثل high bond C، extra، بنفس أبعاد الهلام. ستحتاج أيضاً إلى قص 20 قطعة من ورق الترشيح GBO oh four وثماني قطع من ورق الترشيح GBO oh two بنفس حجم الهلام.إن GBO 4 سميك جداً وامتصاصه عالٍ. بينما GBO 2 أرق بكثير وذو قوام أنعم، مما يضمن تلامساً أكثر تجانساً مع الغشاء. قص قطعة إضافية من GBO 4 لاستخدامها كفتيلة، واجعلها أعرض بنحو 20 سنتيمتراً من الهلام المغمور.ضع غشاء UL WIC النيتروزي وأربع قطع من GBO oh two وقطعة واحدة من XTBS في حاوية بلاستيكية، ثم قم بتجميع مجموعة من الأوراق على النحو التالي: 20 قطعة من GBO oh four الجاف، ثم أربع قطع من GBO oh two الجاف، ثم قطعة واحدة من GBO oh two المبللة مسبقاً.ضع غشاء النيتروسليلوز فوق هذه المجموعة. اشطف الهلام الموجود على صينية الصب لفترة وجيزة بالماء لإزالة فائض محلول التشغيل المنظم. ثم ابدأ بحذر في سحب الهلام من الصينية إلى المجموعة، مع ترطيب الغشاء بمحلول TBS حسب الضرورة أثناء سحب الهلام من الصينية.يساعد المحلول المنظم الإضافي في منع انحباس الفقاعات داخل الهلام. وتعمل ماصة النقل بشكل جيد لهذا الغرض بعد نقل الهلام بالكامل إلى وحدة التجميع. افحص بدقة للتأكد من عدم وجود فقاعات.ارفع حافة الهلام وأضف المنظم مرة أخرى حتى يتم التخلص من الفقاعات. ضع قطع GBO الثلاث المتبقية والمبللة مسبقاً فوق الهلام. تأكد من التلامس التام بين جميع الطبقات عن طريق تمرير الماصة بقوة فوق مجموعة الطبقات.أحِط مجموعة النقل بصينيتين مرتفعتين تحتويان على TBS، ثم ضع الفتيلة المبللة مسبقاً فوق المجموعة، بحيث يكون طرفا الفتيلة مغمورين. قم بتغطية مجموعة النقل المجمعة بصينية بلاستيكية إضافية في TBS، مع وضع ثقل إضافي فوقها مثل زجاجة ماء سعة 500 مل. ستقوم الفتيلة بسحب المنظم من الصواني، وستعمل أوراق الترشيح الجافة على سحب المنظم عبر الهلام على مدار عدة ساعات.سيؤدي ذلك إلى ترسيب البروتينات على الغشاء، اترك عملية النقل تستمر لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو طوال الليل. بعد اكتمال النقل الشعيري، يمكن معالجة الغشاء عن طريق لطخة ويسترن القياسية. تظهر هنا لطخة نموذجية لبروتينات تم التعبير عنها بشكل مفرط في سلالة من الخميرة تهيئ بروتينات معينة لتكوين الأميلويد.يمكنكم أن تروا بوضوح أن بعض المرشحين لدينا يشكلون أميلويد أو أنواعاً مقاومة لـ SDS ذات وزن جزيئي عالٍ بشكل جيد جداً، مثل تلك الموضحة هنا وهنا. ومع ذلك، فإن البعض الآخر لا يشكل تجمعات ويكون أحادياً تماماً مثل هذه وهذه. بالإضافة إلى ذلك، يمكنكم ملاحظة أن حجم بوليمرات الأميلويد يختلف باختلاف البروتين، وهو ما يمكنكم رؤيته في هذين المسارين.لقد عرضنا لكم للتو طريقة بسيطة لتحليل التجمعات غير القابلة للذوبان ذات الوزن الجزيئي العالي، مثل الأميلويدات الخاصة بالبريونات المرشحة. نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بمشاهدة عرضنا التوضيحي وأن تجدوا هذه التقنية مفيدة في دراسات البروتينات المناعية Amy. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في أبحاثكم.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وصفنا تقنية لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، وفصل البروتين SDS - PAGE ، واسترجاع مستضد immunoblotting مع الضد إلى الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف Aβ موحودي multimeric في الأنسجة والقشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.

SDS-PAGE/Immunoblot الكشف عن Multimers Aβ في الأنسجة البشرية القشرية الخليط باستخدام مستضد استرجاع حاتمة

يوضح هذا الفيديو إجراء فصل كبريتات الهيباران المعزولة من أنسجة رئة الفأر باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.

الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد: تقنية تحليلية للكشف عن كبريتات الهيباران ذات أطوال السلسلة المتفاوتة المعزولة من أنسجة رئة الفأر

يوضح هذا الفيديو تقنية فصل قائمة على بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة البروتينات. تساعد هذه التقنية في التحديد الأولي للبروتينات بناء على أوزانها الجزيئية.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

يوضح هذا الفيديو الفصل القائم على الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد لألياف الأميلويد المنظفات شبه المتمسخة. تفصل هذه التقنية مجاميع الأميلويد متعددة الأشكال بناء على حجمها غير المتجانس.

الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه المتغير: تقنية لفصل ألياف الأميلويد متعددة الأشكال بناء على عدم تجانس الحجم

يمكن للبروتينات إما أن تتبنى بنية أصلية أو تتحول إلى أميلويد غير قابل للذوبان. تؤدي الظروف التي تفضل مسار الطي الخاطئ إلى تكوين أنواع مختلفة من ألياف الأميلويد. تسمح الطرق الموضحة هنا بالتحويل السريع للبروتينات الأصلية إلى أميلويد في المختبر.

التوليد السريع للأميلويد من البروتينات الأصلية في المختبر

هنا نستخدم الأبعاد شبه يشوه [اغروس] هلام التفريد لتأكيد وجود ألياف اميلويد مثل الحجم غير المتجانسة، واستبعاد إمكانية أن يعود إلى التباين في حجم الانفصال الألياف اميلويد خلال الجل العملية قيد التشغيل.

استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.

الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة

يصف هذا البروتوكول استخراج وتصور البروتينات المجمعة والذوبانة من الإشريكية القولونية بعد العلاج بمضادات الميكروبات البروتوتوكسية. بعد هذا الإجراء يسمح مقارنة نوعية من البروتين تشكيل الكلي في الجسم الحي في سلالات بكتيرية مختلفة و / أو بين العلاجات.

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

هنا ، نصف نظام الخميرة الذي يعيد تكوين γ السكريتيز البشري. يسمح هذا النظام بتحديد ودراسة الطفرات التي تؤثر على النشاط وفحص مثبطات γ-secretase (GSIs). باستخدام فقدان الخصائص الوظيفية للطفرات العائلية لمرض الزهايمر ، من الممكن فحص معدلات γ-secretase (GSMs).

خميرة الخميرة نماذج مرض الزهايمر لفحص الجينات والطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على إنتاج بيتا الأميلويد بواسطة γ-سيكريتاز

توضح هذه الدراسة طرقا تجريبية لتوصيف GFAP وطفراته المسببة للأمراض كيميائيا، مع التركيز على تجميع الخيوط، والتجميع، والتعديل بعد الترجمة. تم تحليل بروتينات GFAP عالية النقاء، مما كشف عن رؤى حول آليات مرض ألكسندر قد توفر إطارا لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة وفهم طفرات GFAP والاضطرابات المرتبطة بها.

الأساليب التجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي ومتغيرات المرض المرتبطة به

اكتشف تقنية SDD-AGE لكشف تجمّعات الأميلويد في العينات البيولوجية باستخدام هلام الأغاروز. توفر هذه الطريقة بروتوكولاً موثوقاً لتحليل البوليمرات البروتينية المقاومة للتغيّر.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

استكشف المزيد من الفيديوهات