الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

مرحبا ، أنا راندال هوفمان ، طالب دراسات عليا في مختبر سوزان لينوس في قسم الأحياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. سأقدم لكم اليوم المنظفات شبه المتغيرة الورد الزراعي ، الرحلان الكهربائي للهلام ، أو عمر SDD. يستخدم مختبرنا هذه التقنية للكشف عن البريونات والبروتينات الجلسية الأخرى.

نسختنا من عمر SDD بسيطة وموثوقة ويمكن قياسها لاستيعاب أي عدد من العينات. الأميلويد مقاومة بشكل استثنائي للتمسخ بواسطة SDS ، مما يسمح بفصلها عن البروتينات الأخرى باستخدام SDDH. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام البيانات من SDDH في حد ذاتها لتأكيد أن شيئا ما هو الأميلويد.

للقيام بذلك ، تحتاج إلى استخدام تقنيات أخرى. مع وضع ذلك في الاعتبار ، اسمحوا لي أن أريكم يمكن إجراء S-D-D-H-S-D-D-H باستخدام المعدات القياسية للرحلان الكهربائي الأفقي للحمض النووي.

أولا ، تحتاج إلى تجميع صينية صب الجل. يعتمد حجم الجهاز على عدد العينات التي لديك. بالنسبة لعدد كبير من العينات ، نستخدم لوحا 20 × 24 سم ، وما يصل إلى أربعة أمشاط 50 جيدا.

لتحضير الجل ، ستحتاج إلى قوة هلام متوسطة أو عالية ، وقوة EEO agros ، ومخزن مؤقت XTAE واحد ، وحل مخزون 10٪ من SDS اصنع محلول AROS بنسبة 1.5٪ و XTAE واحد. سترغب في جعل الجل سميكا قدر الإمكان حتى تتمكن من تحميل أكبر قدر من العينة وزيادة الكشف. سخني الخليط في الميكروويف حتى يذوب الحروس تماما.

أضف مخزون 100 XSDS بسرعة إلى 0.1٪ وقم بالتدوير للخلط. إذا تصلب بعض الزراعة خلال هذه الخطوة ، أحمر ، قم بإذابته على طبق ساخن. احرص على عدم تركها تغلي.

بعد إضافة SDS حيث أن المحلول سوف ينفجر بسهولة ، اسكب هذا المحلول في صينية الصب وهو لا يزال ساخنا. ثم استخدم مشطا للتخلص من أي فقاعات قد تتداخل لاحقا أثناء نقل الجل. بعد أن يتم تبريد الجل وتجميده تماما ، قم بإزالة الأمشاط بعناية وضع الجل في الخزان.

اغمر الجل بالكامل في XTAE واحد مع 0.1٪ SDS. أنت الآن جاهز لتحميل عيناتك. يتم تحضير عينات البروتين المستخدمة في SDDH تماما كما هو الحال في صفحة SDS مع استثناءين مهمين.

أولا ، يجب تجنب تسخين العينات التي يمكن أن تفسد المجاميع إلى مونومرات بروتينية ثانيا ، احرص على تجنب تدهور البروتين. نظرا لأن ظروف تغيير الطبيعة المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل جميع البروتياز ، فإننا نوصي باستخدام ما لا يقل عن ضعف التركيز الموصى به لكوكتيل مثبط البروتياز الكامل.

في هذا العرض التوضيحي ، سنستخدم المحللات من خلايا الخميرة التي تعبر عن بروتين معين ذي أهمية. نستخدم عموما ملين بين عشية وضحاها. نمت الثقافات في 96 ، وتتوفر كتل جيدة من VWR ، ولكن عند تحليل البروتينات منخفضة الوفرة ، يجب استخدام أحجام ثقافة أكبر.

حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي للثقافة عند 2000 RCF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، وإزالة supra natant وغسل الخلايا عن طريق تعليق Resus في الماء والطرد المركزي مرة أخرى بعد الدوران الثاني ، وإزالة المادة الطافية والراتنج للخلايا في محلول الطلاء الاحتياطي. يقوم zy الموجود في المحلول بهضم جدران الخلايا ، مما سيسمح لك بتجميع الخلايا بكفاءة وحجم صغير من المخزن المؤقت للتحلل. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.

قم بتكسير الخلايا البلاستيكية الاحتياطية هذه المرة عند 800 RCF لمدة خمس دقائق. قم بإزالة العلبة تماما وأعد تعليق كل حبيبات و 100 ميكرولتر من محلول التحلل. بعد ذلك ، قم بتغطية الكتلة بشريط لاصق ودوامة بسرعة عالية لمدة دقيقتين.

يساعد هذا جميع المواد البلاستيكية الكروية على إخراج الحطام الخلوي عند 4 ، 000 RCF. لمدة دقيقتين. انقل S natin بعناية إلى لوحة PCR سعة 96 جيدا.

عادة ، نقوم بتحليل مئات العينات في وقت واحد في مختبرنا ، لذا فإن مساعدتنا في هذا هو نظام مناولة السوائل. إذا رغبت في ذلك ، حدد تركيز البروتين في المحلل. بعد ذلك ، أضف أربعة x عينة مؤقتة إلى العينات لتوليد المحللات التي تحتوي على حضانة عازلة لعينة x واحدة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

الآن قم بتحميل العينات في الجل. إذا رغبت في ذلك، احفظ نصف العينات لتحليل صفحة SDS. أيضا ، قم بتحميل علامات الوزن الجزيئي ، بما في ذلك العلامات المصبغة مسبقا وعلامة الوزن الجزيئي العالية جدا مثل مستخلص فليكتور الدجاج.

إذا رغبت في ذلك ، من المهم الحفاظ على برودة الجل لمنع انتشار البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض ، لذلك قد ترغب في تشغيله في الغرفة الباردة. قم بتشغيل الجل بجهد منخفض أقل من ثلاثة فولت لكل سنتيمتر من طول الجل. قم بتشغيل الجل لعدة ساعات حتى يصل السجل إلى حوالي سنتيمتر واحد من نهاية الجل.

نظرا لأن الأميلويد لا يتم تغييره بنسبة 2٪ SDS في درجة حرارة الغرفة ، فإنه سيبقى سليما بينما تنفصل المجمعات الأخرى ، بما في ذلك معظم المجاميع غير النشوانية ، في وجود 2٪ SDS. وبالتالي ، فإن معظم البروتينات ستكون أحادية اللون وتعمل بسرعة عبر الجل. في حين أن الأميلويد عالية الوزن الجزيئي المقاومة ل SDS سوف تهاجر بشكل أبطأ.

بعد ذلك ، سيكون الجل جاهزا للنقل. على الرغم من أنه يمكن استخدام طرق نقل متعددة ، إلا أننا نحصل على أفضل النتائج باستخدام النقل الشعري. نظرا لأن نقل الشعيرات الدموية يمكن أن يستوعب أي حجم من الهلام ، فمن العملي تحليل مئات العينات في نقل الشعيرات الدموية.

كومة من أوراق النشاف الجافة على سحب المخزن المؤقت من خلال بروتينات ترسيب الهلام على غشاء النيتروسليلوز الموجود بين الأوراق والهلام. ستحتاج إلى قطع قطعة من النيتروسليلوز ، مثل High Bond C ، بالإضافة إلى نفس أبعاد الجل. ستحتاج أيضا إلى قص 20 قطعة من GBO أوه أربع وثماني قطع من GBO oh ورقتان نشاف بنفس حجم الجل.

GB oh four سميكة جدا وماصة. في حين أن GBO oh two أرق بكثير وله ملمس أدق ، مما يضمن ملامسة أكثر توازنا مع الغشاء. قم بقص قطعة إضافية من GBO oh four لاستخدامها كفتيل واجعلها أعرض بحوالي 20 سم من الجل المغمور.

يقوم UL WIC النيتروز وأربع قطع من GBO oh two و one XTBS في حاوية بلاستيكية بتجميع كومة من الأوراق على النحو التالي ، 20 قطعة من GBO الجافة أوه أربعة. ثم أربع قطع من GBO الجافة أوه اثنان. ثم قطعة واحدة من GBO المبللة مسبقا أوه اثنان.

ضع النيتروسليلوز فوق هذا المكدس. اشطف الجل الموجود على صينية الصب لفترة وجيزة في الماء لإزالة المخزن المؤقت الزائد. ثم ابدأ بعناية في تحريك الجل من الدرج على المكدس أثناء تحريك الجل من الدرج ، مما يؤدي إلى وضع الغشاء مع TBS حسب الضرورة.

يساعد المخزن المؤقت الإضافي على منع الفقاعات من الوقوع في الجل. تعمل ماصة النقل بشكل جيد لهذا الغرض بعد نقل الجل بالكامل إلى المكدس. تحقق جيدا من وجود فقاعات ، إن وجدت.

ارفع حافة الجل وأعد وضع المخزن المؤقت حتى يمكن عمل الفقاعات. ضع الثلاثة المتبقية المبللة مسبقا من GBO أوه قطعتين فوق الجل. تأكد من التلامس الشامل بين جميع الطبقات عن طريق لف الماصة بإحكام عبر الجزء العلوي من المكدس.

بإحاطة كومة النقل بصينيتين مرتفعتين تحتويان على TBS ، قم بلف الفتيل المبلل مسبقا عبر المكدس ، بحيث يتم غمر طرفي الفتيل. في TBS ، قم بتغطية كومة النقل المجمعة بصينية بلاستيكية إضافية تحمل وزنا إضافيا مثل زجاجة ماء سعة 500 مل. سيسحب الفتيل حاجزا مؤقتا من الصواني وستسحب أوراق النشاف الجافة المخزن المؤقت من خلال الجل على مدار عدة ساعات.

سيؤدي ذلك إلى إيداع البروتينات على الغشاء ، مما يسمح بالنقل بالمضي قدما لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. بعد اكتمال النقل الشعري ، يمكن معالجة الغشاء عن طريق النشاف الغربي القياسي. هنا ترى بقعة نموذجية من البروتينات التي تم التعبير عنها بشكل مفرط في سلالة الخميرة التي تهيئ بروتينات معينة لتكوين الأميلويد.

يمكنك أن ترى بوضوح أن بعض المرشحين لدينا يشكلون أنواعا مقاومة للأميلويد أو الوزن الجزيئي العالي SDS جيدا مثل تلك الموضحة هنا وهنا. ومع ذلك ، فإن البعض الآخر لا يشكل مجاميع وهو أحادي تماما مثل هذه وهذه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنك أن ترى أن حجم بوليمرات الأميلويد يختلف اعتمادا على البروتين ، والذي يمكنك رؤيته في هذين المسارين.

لقد أظهرنا لك للتو طريقة بسيطة لتحليل الوزن الجزيئي العالي ، والمجاميع غير القابلة للذوبان ، مثل الأميلويد من البريونات المرشحة. نأمل أن تكون قد استمتعت بمشاهدة عرضنا التقديمي وتجد هذه التقنية مفيدة ودراسات لبروتينات إيمي المناعية. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في بحثك.