Name: Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: تعلم إعداد ثقافات الغدة الصعترية المعاد تجمعها لدراسة تمايز الخلايا التائية باستخدام أجنة الفئران. تُشكّل هذه الثقافات هياكل متكاملة خلال 18 ساعة وتُنتج خلايا CD4+ وCD8+ لأبحاث المناعة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

لمزيد من المعلومات حول إعداد reggregate الثقافات التوتة يرجى زيارة <a href="http://www.springerprotocols.com/">البروتوكولات سبرينغر</a> .

ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

Reaggregate Thymus Cultures

في CD4 ، الغدة الصعترية غير ناضجة +8 + thymocytes معربا عن ترتيبها عشوائيا مستقبلات الخلايا T - α وب سلسلة الجينات يخضع اختيار الأحداث الإيجابية والسلبية على أساس قدرتهم على الاعتراف self-peptide/major معقدة التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات التي أعربت عنها التوتة انسجة الخلايا. في تحليل لدور الجسم الحي من خلايا انسجة الغدة الصعترية خلال اختيار intrathymic يرصد صعبة بسبب تعقيد الخلوية من المكروية التوتة التوتة الكبار في حالة استقرار ، وبسبب عدم وجود استراتيجيات مناسبة لمعالجة استهداف الجينات في مقصورات خاصة انسجة الغدة الصعترية. لقد أظهرنا أنه لا يمكن التلاعب بها بسهولة المكروية التوتة في المختبر من خلال استخدام جهاز التوتة reaggregate الثقافات ، والتي تتيح إعداد ثلاثي الأبعاد فصوص من الغدة الصعترية تعريف الخلايا اللحمية واللمفاوية. على الرغم من أن الأنظمة الأخرى في المختبر دعم بعض جوانب تي خلية التنمية ، reaggregate التوتة الثقافة الجهاز يبقى فقط في نظام المختبر قادرا على دعم الطبقة MHC فعالة يمكن استخدامها الأول والثاني بوساطة الأحداث اختيار خلية توتية ، وذلك باعتبارها أداة فعالة لدراسة تنظيم الخلوية والجزيئية لاختيار الإيجابية والسلبية في الغدة الصعترية.

في هذا الفيديو إعداد 2 - dGuo المعاملة reaggregate الثقافات التوتة يتجلى.

Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

تنتظم الخلايا السدوية داخل الأنسجة اللمفاوية في هياكل ثلاثية الأبعاد توفر سِقالة يُعتقد أنها تتحكم في هجرة و...

مرحباً، أنا أندريا وايت من مختبر غراهام أندرسون وإريك جينكينسون في مركز MRC للتنظيم المناعي بجامعة برمنغهام. أقدم اليوم بروتوكولاً لاستخلاص مزارع عضوية تيموسية مُعاد تجميعها، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات الخلوية المعقدة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا التائية. وقبل البدء بهذا الإجراء، تم عزل الفصوص التيموسية الجنينية ومعالجتها لإزالة جميع الخلايا اللمفاوية.يمكن رؤية ذلك في فيديو منفصل. ثم يتم تفكيك الفصوص الغريبة لإنتاج تحضير للخلايا السدوية. وأخيراً، يتم تجميع الخلايا لتكوين مزرعة عضوية من تجمعات fmic المعاد تجميعها.فلنبدأ. بعد مرور خمسة إلى سبعة أيام في المزرعة، يجب أن تكون العضيات (LO) جاهزة للتفكيك لتحضير خلايا السرب؛ اغمر المرشحات ذات المسام 0.8 micrometer في طبق بتري يحتوي على RPMI 1640 مضافاً إليه 10% FCS. وباستخدام الملاقط، ادفع برفق أي كتل ليفية لا تطفو من تلقاء نفسها. استخدم ماصة سعة 1 mil لنقل العضيات إلى أنبوب centrifuge سعة 1.5 mil.نوصي بعدم وضع أكثر من 50 فصاً في كل أنبوب سنترفيوج. اترك الفصوص لتستقر في قاع الأنبوب تحت تأثير الجاذبية ثم قم بإزالة الوسط. اغسل الفصوص باستخدام 1 mL من PBS ثم اترك الفصوص تغوص إلى القاع مرة أخرى.كرر هذه العملية لإجراء ثلاث غسلات بمحلول PBS إجمالاً، ثم تخلص من الغسلة الأخيرة من محلول PBS وأضف 600 µL من محلول trips in بتركيز 0.25%. ضع أنبوب einor في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 25 دقيقة. قم بتفتيت الفصوص بلطف باستخدام طرف ماصة أزرق سعة 1 mL على جهاز perpet لمدة 10 ثوانٍ، ثم أعدها إلى الحاضنة، وبعد 20 دقيقة، اسحب الفصوص للأعلى والأسفل باستخدام الماصة لتفكيكها تماماً.يستغرق الأمر حوالي 30 ثانية. وللحصول على معلق من الخلايا المفردة، أضف 400 µL من وسط RPMI 1640 المبرد بالثلج والمضاف إليه 10% FCS لمعادلة عمل التربسين، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، وأزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من وسط RPMI 1640 المضاف إليه 10% FCS إذا رغبت في ذلك. ثم قم بعدها بعدّ الخلايا.عادةً ما نتوقع وجود حوالي 50,000 خلية لكل فص ديوكسازين، بدءاً من ليف في اليوم الجنيني 15 (E 15). نحن الآن جاهزون لتكوين التجمع من مزارع fmic Corgan في أنبوب إبندورف سعة 1.5 مل. اخلط الخلايا السدوية الدقيقة المحضرة حديثاً.مع الخلايا الليفية الموجبة لـ CD4 والموجبة لـ CD8 المختارة مسبقاً. نوصي بنسبة تقريبية تبلغ واحد إلى واحد من الخلايا السدوية إلى الخلايا الليفية. سيعتمد عدد الخلايا التي ستستخدمها على عدد الخلايا المتاحة والتجارب التي سيتم إجراؤها.نوصي باستخدام مائة ألف خلية على الأقل في المجموع، وبما لا يتجاوز 1.5 مليون خلية. يجب أن تكون تجمعات V كبيرة بما يكفي لضمان تكرار النتائج، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى موت الخلايا في المركز. يتم تجميع خلايا الراسب عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق. عند درجة حرارة 4 °C، قم بتجميع مرشح المزرعة العضوية بعناية.أزل جميع السوائل العلوية في هذه المرحلة باستخدام ماصة P 200. قم برجّ كريات الخلايا باستخدام جهاز مزج vortex لمدة 10 ثوانٍ لتكوين معلق. يجب أن يكون الحجم حوالي 1 إلى 2 µL.اسحب المعلق إلى ماصة مسحوبة بدقة، مع الحفاظ على تعليق الخلايا عند طرف الماصة. وتحت مجهر التشريح، قم بنقل معلق الخلايا بعناية إلى مركز مرشح بمسامية 0.8 ميكرومتر. ومن المثالي وضع الخلايا على شكل قطرة قائمة في دائرة يتراوح قطرها من واحد إلى اثنين مليمتر.إذا بدأت الملاط في الانتشار، فاترك السائل الموجود في الملاط يتصرف عبر المسام قبل ترسيب الخلايا المتبقية. ضع الطبق في صندوق بلاستيكي محكم الإغلاق. أما بالنسبة لمزارع أعضاء التيموس، فضع الصندوق في الحاضنة، حيث تشكل مزارع التجميع تراكيب سليمة في غضون 18 ساعة من الزراعة.بعد أربعة إلى خمسة أيام من الزرع، ستنتج هذه الخلايا مجموعات فرعية ناضجة من الخلايا التائية من نوع CD4+ CD8- وCD4- CD8+. ومن المفترض أن يوفر البدء بـ 50 فصاً معالجاً بالديوكسازين عدداً كافياً من الخلايا السدوية لتحضير ثلاث إلى خمس مستنبتات إعادة تجميع. وتظهر هذه المستنبتات عادةً على شكل كتل خلوية متماسكة يمكن دفعها بعيداً عن المرشحات باستخدام الملقط دون تمزيقها.لقد وصفنا للتو الطريقة التي يتم من خلالها دراسة الانتقاء الإيجابي بواسطة الخلايا الظهارية F. ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لدراسة الانتقاء السلبي الذي تتوسطه الخلايا الشجرية. وأخيراً، من خلال استخدام خلايا FIBROCYTES حاملة لجينات TCR مستنسخة أو خلايا سدوية تفتقر إلى MHC Class one أو تفتقر إلى MHC Class two.يتيح هذا النظام إجراء استقصاءات منفصلة حول اختيار الخلايا التائية CD4 الموجبة أو CD8 الموجبة. شكراً للمتابعة.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يوضح تشريح وازالة الغدة الصعترية الجنين وكذلك التحضير للثقافات فيفو السابقين من 2 dGuo المعالجة الغدة الصعترية.

إعداد 2 - dGuo المعاملة الثقافات الجهاز الغدة الصعترية

&lt; p class = "jove_content"&gt;يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتوليد خلايا تائية وظيفية خاصة بالمستضد من الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC باستخدام نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد. أدى الزراعة المشتركة للخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC مع الفئران الداخلية المستنفدة من الخلايا الليمفاوية الفصوص الصعترية الجنينية إلى النضج الناجح للخلايا التائية لتشكيل CD8αβ + معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى + iPSC المهاجرين الصعتريين المشتقة من (iTEs).

نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد لتوليد مهاجرين الغدة الصعترية المشتقين من iPSC

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل مستضد تقديم الخلايا من الغدة الصعترية البشرية عبر مختلف مراحل الهضم الأنزيمي من الأنسجة تليها الكثافة الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة والفرز المغناطيسي و / أو نظام مراقبة الأصول الميدانية أخيرا من السكان خلية من الفائدة.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

لم تنجح دراسة الخلايا الظهارية الصعترية النخاعية في المختبر إلى حد كبير ، حيث لا تحاكي أنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد الحالية سيناريو in vivo. أثبت نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد الموصوف هنا - وهو نموذج ثقافة النمط العضوي المعدل للجلد - تفوقه في تلخيص انتشار mTEC وتمايزها والحفاظ على التعبير الجيني المختلط.

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

تصف هذه المقالة منهجية في الجسم الحي وفي المختبر لتوصيف أسلاف الاستقرار الصعترية من خلال تحليل حركية التوليد والنمط الظاهري وأعداد ذرية الخلايا التائية.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لإثراء الخلايا الظهارية الصعترية (TECs) بتدرج الكثافة لعزل FACS. كما يوضح استخدام ببتيدات EAK16-II / EAKIIH6 لتعزيز تكوين ركام TEC. توفر البيئات الدقيقة ل EAK16-II / EAKIIH6 hydrogel التكوين ثلاثي الأبعاد اللازم للحفاظ على بقاء ووظيفة TECs.

تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل

وصفنا إعداد شرائح الغدة الصعترية التي، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، ويمكن استخدامها لنموذج اختيار الإيجابية والسلبية لتطوير خلايا تي. ويمكن أيضا شرائح الغدة الصعترية يمكن تكييفها لفي الموقع تحليل الهجرة خلية توتية، التعريب، وإشارات عبر المناعي واثنين من الفوتون المجهري.

إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة

يصف هذا المقال طريقة جديدة لتوليد مستضد الورم محددة المستحثة المتعددة القوى الخلايا الجذعية المستمدة من المهاجرين الثيميك (iTE) من قبل نظام الثقافة الثهيميك ثلاثي الأبعاد (3D). iTE هي مجموعة فرعية متجانسة من الخلايا T ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا T السذاجة مع القدرة على الانتشار، وتشكيل الذاكرة، وقمع الورم.

نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة من الغدة الصعترية للفأر متبوعة بنقل الفيروسات القهقرية والمزرعة المشتركة على نظام الاستزراع المشترك لخط لحمية نخاع العظم الشبيه بدلتا (OP9-DL4) لمزيد من التحليل الوظيفي.

الزراعة المشتركة ونقل الخلايا الصعترية للفئران على الخلايا اللحمية الشبيهة بدلتا 4 لدراسة الجينات المسرطنة في سرطان الدم في الخلايا التائية

هنا ، نصف بروتوكولا لتشكيل عضويات الغدة الصعترية البشرية المشتقة من iPSC التي تزرع في الهلاميات المائية الفيبرين 3D بهدف دعم نضوج الخلايا الظهارية الصعترية (TEC) والصيانة المطولة ، وكذلك تكون الغدة الصعترية في المختبر.

تكوين عضويات الغدة الصعترية البشرية في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد للفيبرين

تعلم إعداد ثقافات الغدة الصعترية المعاد تجمعها لدراسة تمايز الخلايا التائية باستخدام أجنة الفئران. تُشكّل هذه الثقافات هياكل متكاملة خلال 18 ساعة وتُنتج خلايا CD4+ وCD8+ لأبحاث المناعة.

Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

استكشف المزيد من الفيديوهات