Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

مرحباً، أنا أندريا وايت من مختبر غراهام أندرسون وإريك جينكينسون في مركز MRC للتنظيم المناعي بجامعة برمنغهام. أقدم اليوم بروتوكولاً لاستخلاص مزارع عضوية تيموسية مُعاد تجميعها، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات الخلوية المعقدة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا التائية. وقبل البدء بهذا الإجراء، تم عزل الفصوص التيموسية الجنينية ومعالجتها لإزالة جميع الخلايا اللمفاوية.

يمكن رؤية ذلك في فيديو منفصل. ثم يتم تفكيك الفصوص الغريبة لإنتاج تحضير للخلايا السدوية. وأخيراً، يتم تجميع الخلايا لتكوين مزرعة عضوية من تجمعات fmic المعاد تجميعها.

فلنبدأ. بعد مرور خمسة إلى سبعة أيام في المزرعة، يجب أن تكون العضيات (LO) جاهزة للتفكيك لتحضير خلايا السرب؛ اغمر المرشحات ذات المسام 0.8 micrometer في طبق بتري يحتوي على RPMI 1640 مضافاً إليه 10% FCS. وباستخدام الملاقط، ادفع برفق أي كتل ليفية لا تطفو من تلقاء نفسها. استخدم ماصة سعة 1 mil لنقل العضيات إلى أنبوب centrifuge سعة 1.5 mil.

نوصي بعدم وضع أكثر من 50 فصاً في كل أنبوب سنترفيوج. اترك الفصوص لتستقر في قاع الأنبوب تحت تأثير الجاذبية ثم قم بإزالة الوسط. اغسل الفصوص باستخدام 1 mL من PBS ثم اترك الفصوص تغوص إلى القاع مرة أخرى.

كرر هذه العملية لإجراء ثلاث غسلات بمحلول PBS إجمالاً، ثم تخلص من الغسلة الأخيرة من محلول PBS وأضف 600 µL من محلول trips in بتركيز 0.25%. ضع أنبوب einor في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 25 دقيقة. قم بتفتيت الفصوص بلطف باستخدام طرف ماصة أزرق سعة 1 mL على جهاز perpet لمدة 10 ثوانٍ، ثم أعدها إلى الحاضنة، وبعد 20 دقيقة، اسحب الفصوص للأعلى والأسفل باستخدام الماصة لتفكيكها تماماً.

يستغرق الأمر حوالي 30 ثانية. وللحصول على معلق من الخلايا المفردة، أضف 400 µL من وسط RPMI 1640 المبرد بالثلج والمضاف إليه 10% FCS لمعادلة عمل التربسين، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، وأزل السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من وسط RPMI 1640 المضاف إليه 10% FCS إذا رغبت في ذلك. ثم قم بعدها بعدّ الخلايا.

عادةً ما نتوقع وجود حوالي 50,000 خلية لكل فص ديوكسازين، بدءاً من ليف في اليوم الجنيني 15 (E 15). نحن الآن جاهزون لتكوين التجمع من مزارع fmic Corgan في أنبوب إبندورف سعة 1.5 مل. اخلط الخلايا السدوية الدقيقة المحضرة حديثاً.

مع الخلايا الليفية الموجبة لـ CD4 والموجبة لـ CD8 المختارة مسبقاً. نوصي بنسبة تقريبية تبلغ واحد إلى واحد من الخلايا السدوية إلى الخلايا الليفية. سيعتمد عدد الخلايا التي ستستخدمها على عدد الخلايا المتاحة والتجارب التي سيتم إجراؤها.

نوصي باستخدام مائة ألف خلية على الأقل في المجموع، وبما لا يتجاوز 1.5 مليون خلية. يجب أن تكون تجمعات V كبيرة بما يكفي لضمان تكرار النتائج، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى موت الخلايا في المركز. يتم تجميع خلايا الراسب عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق. عند درجة حرارة 4 °C، قم بتجميع مرشح المزرعة العضوية بعناية.

أزل جميع السوائل العلوية في هذه المرحلة باستخدام ماصة P 200. قم برجّ كريات الخلايا باستخدام جهاز مزج vortex لمدة 10 ثوانٍ لتكوين معلق. يجب أن يكون الحجم حوالي 1 إلى 2 µL.

اسحب المعلق إلى ماصة مسحوبة بدقة، مع الحفاظ على تعليق الخلايا عند طرف الماصة. وتحت مجهر التشريح، قم بنقل معلق الخلايا بعناية إلى مركز مرشح بمسامية 0.8 ميكرومتر. ومن المثالي وضع الخلايا على شكل قطرة قائمة في دائرة يتراوح قطرها من واحد إلى اثنين مليمتر.

إذا بدأت الملاط في الانتشار، فاترك السائل الموجود في الملاط يتصرف عبر المسام قبل ترسيب الخلايا المتبقية. ضع الطبق في صندوق بلاستيكي محكم الإغلاق. أما بالنسبة لمزارع أعضاء التيموس، فضع الصندوق في الحاضنة، حيث تشكل مزارع التجميع تراكيب سليمة في غضون 18 ساعة من الزراعة.

بعد أربعة إلى خمسة أيام من الزرع، ستنتج هذه الخلايا مجموعات فرعية ناضجة من الخلايا التائية من نوع CD4+ CD8- وCD4- CD8+. ومن المفترض أن يوفر البدء بـ 50 فصاً معالجاً بالديوكسازين عدداً كافياً من الخلايا السدوية لتحضير ثلاث إلى خمس مستنبتات إعادة تجميع. وتظهر هذه المستنبتات عادةً على شكل كتل خلوية متماسكة يمكن دفعها بعيداً عن المرشحات باستخدام الملقط دون تمزيقها.

لقد وصفنا للتو الطريقة التي يتم من خلالها دراسة الانتقاء الإيجابي بواسطة الخلايا الظهارية F. ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لدراسة الانتقاء السلبي الذي تتوسطه الخلايا الشجرية. وأخيراً، من خلال استخدام خلايا FIBROCYTES حاملة لجينات TCR مستنسخة أو خلايا سدوية تفتقر إلى MHC Class one أو تفتقر إلى MHC Class two.

يتيح هذا النظام إجراء استقصاءات منفصلة حول اختيار الخلايا التائية CD4 الموجبة أو CD8 الموجبة. شكراً للمتابعة.