Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

مرحبا ، أنا أندريا وايت وأنا من مختبر جراهام أندرسون وإريك جينكينسون في مركز MRC لتنظيم المناعة في جامعة برمنغهام. أقدم اليوم بروتوكولا لاشتقاق إعادة تجميع مزارع الأعضاء الصعترية ، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات الخلوية المعقدة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا التائية. قبل بدء هذا الإجراء ، تم عزل الفصوص الصعترية الجنينية ومعالجتها لإزالة جميع الخلايا الليمفاوية.

يمكن رؤية هذا في مقطع فيديو منفصل. ثم يتم تفكيك الفصوص الغريبة لإنتاج مستحضر الخلايا اللحمة. وأخيرا ، يتم تجميع الخلايا لتشكيل إعادة تجميع ثقافة الأعضاء الفيمية.

هيا نبدأ. بعد خمسة إلى سبعة أيام في الثقافة ، يجب أن يكون LO جاهزا للتفكيك لمستحضرات الخلايا الضحلة ، واغمر مرشحات 0.8 ميكرومتر في طبق بتري يحتوي على RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FCS باستخدام الملقط ، ادفع برفق أي منحدرات ألياف لا تطفو. استخدم مل واحد لكل أليف لنقل الفصوص إلى أنبوب أورف 1.5 مل.

نوصي بما لا يزيد عن 50 فصا لكل أنبوب أورف. اسمح للفصوص بالاستقرار في قاع الأنبوب تحت وحدة الجاذبية وإزالة الوسط. اغسل الفصوص ب 1 مل PBS ثم اترك الفصوص تغرق في القاع مرة أخرى.

كرر هذا لما مجموعه ثلاث غسلات PBS ، وقم بإزالة آخر غسول PBS وأضف 600 ميكرولتر من 0.25٪ في المحلول. ضع أنبوب einor في حاضنة 37 درجة لمدة 25 دقيقة. قم بخزف الفصوص برفق باستخدام طرف أزرق بطول ميل واحد على بربيت لمدة 10 ثوان ، ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة بعد 20 دقيقة ، ثم قم بتقطيع الفصوص لأعلى ولأسفل لتفكيكها تماما.

يجب أن يستغرق الأمر حوالي 30 ثانية لتحقيق تعليق خلية واحدة ، أضف 400 ميكرولتر من الجليد البارد ، RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FCS لتحييد التربسين عفريت الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند ألف دورة في الدقيقة ، 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة sup natant وإعادة تعليق الحبيبات في مل واحد. RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FCS إذا رغبت في ذلك. عد الخلايا.

عادة ما نتوقع حوالي 50،000 خلية لكل فص ديوكسازين ، بدءا من ليفية E 15. نحن الآن على استعداد لتشكيل ثقافات كورغان الكلية في أنبوب أورف بطول ميل ونصف. خلايا لحمية دقيقة مختلطة وطازجة.

جنبا إلى جنب مع القرص المضغوط المختار مسبقا أربعة CD إيجابي ثماني خلايا ليفية إيجابية. نوصي بنسبة واحد إلى واحد من الخلايا اللحمية إلى الخلايا الليفية. يعتمد عدد الخلايا التي ستستخدمها على عدد الخلايا المتاحة والتجارب التي سيتم إجراؤها.

نوصي بما لا يقل عن مائة ألف خلية في المجموع ولا يزيد عن 1.5 مليون خلية. تريد أن تكون مجاميع V كبيرة بما يكفي لتكون قابلة للتكرار ، ولكن ليست كبيرة جدا بحيث يموت المركز خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند ألف دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية ، قم بتجميع مرشح ثقافة الأعضاء بعناية.

قم بإزالة كل SUP natin في المرحلة ب 200 بو لكل أليف. بيليه الخلية الدوامية لمدة 10 ثوان لتشكيل ملاط. يجب أن يكون الحجم حوالي لتر إلى اثنين من ميكرولتر الفم.

قم بتربية الملاط في أليف مسحوب بدقة ، مع الحفاظ على تعليق الخلايا عند طرف الأليف. تحت مجهر التشريح الخاص بنا ، قم بفم ملاط الخلية بعناية في مركز مرشح 0.8 ميكرومتر. من الناحية المثالية ، يجب وضع الخلايا كقطرة دائمة في دائرة قطرها من واحد إلى ملليمترين.

إذا بدأ الملاط في الانتشار ، اترك السائل الموجود في الملاط يتصريف من خلال نقاط البيع قبل ترسيب الخلايا المتبقية. ضع الطبق في صندوق شطيرة بلاستيكي وأغلقه. أما بالنسبة لثقافات أعضاء الغدة الصعترية ، ووضع صندوق في حاضنة ، فإننا نجمع الثقافات في هياكل سليمة في غضون 18 ساعة من الزراعة.

بعد أربعة إلى خمسة أيام من الثقافة ، سيولدون كلا من القرص المضغوط أربعة موجبين ثمانية سلبيين و CD أربعة سالب ثمانية مجموعات فرعية إيجابية ناضجة. بدءا من 50 فصة معالجة بالديوكسازين يجب أن تعطي خلايا لحمية كافية لإعداد ثلاث إلى خمس مزارع تجميع. تظهر هذه الثقافات عادة على شكل أكوام متماسكة من الخلايا التي يمكن دفعها بعيدا عن المرشحات باستخدام ملقط دون تعطيلها.

لقد وصفنا للتو الطريقة التي يمكن بها دراسة الانتقاء الإيجابي بواسطة الخلايا الظهارية F. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة الانتقاء السلبي بوساطة الخلايا المتغصنة. أخيرا ، باستخدام الخلايا الليفية المعدلة وراثيا TCR أو معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى أو الخلايا اللحمية الناقصة من الفئة الثانية معقد التوافق النسيجي النسيجي الكبير.

يسمح هذا النظام بإجراء تحقيقات منفصلة في اختيار الخلايا التائية الإيجابية الأربعة أو القرص المضغوط الثامنة الإيجابية. شكرا لضبطك.