طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

يوضح هذا الفيديو الخطوات المختلفة لعملية الكيمياء النسيجية المناعية للجنين كاملاً في جنين الدجاج باستخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بإنزيم HRP. أولاً، يتم تثبيت الجنين في البارافورمالدهيد، ثم يتم تثبيط نشاط بيروكسيداز الداخلي.

يتم بعد ذلك تحضين الجنين في الجسم المضاد الأولي. وبعد عدة عمليات غسيل، يُحضن الجنين في الجسم المضاد الثانوي المرتبط بـ HRP، ويتم إظهار تفاعل اللون باستخدام ركيزة DAB، حيث يظهر صبغ الجسم المضاد باللون البرتقالي. وتكمن ميزة هذه الطريقة مقارنة باستخدام الأجسام المضادة الفلورية في إمكانية معالجة الأجنة لعمل مقاطع شمعية، مما يسمح بدراسة مواقع المستضد في المقطع العرضي.

مرحباً، أنا دلفين من مختبر FIN في مركز الطب البيئي والجينومي بجامعة تكساس إيه آند إم في هيوستن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ صبغات الأجسام المضادة للشكل الظاهري للهرمونات في أجنة الدجاج باستخدام أجسام مضادة مقترنة بإنزيم HRP. نحن نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة مورفولوجيا الأجنة بعد العلاج بالأدوية المضادة للصرع.

لنبدأ الآن في تنفيذ تقنية الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة على أجنة الدجاج. أولاً، افتح البيضة عن طريق النقر على القشرة باستخدام الملقط وإزالة قطع من القشرة. قم بإزالة الألبومين السميك باستخدام الملقط وأمل كيس المحّ باستخدام ملقط خشن بحيث يكون الجنين موجهاً للأعلى.

بعد ذلك، استخدم مقصاً دقيقاً لقص مربع من كيس المحّ حول الجنين. قم بإزالة الجنين من المحّ باستخدام ملعقة وضعه في طبق يحتوي على PBS تحت مجهر تشريحي. قم بإزالة الأغشية الموجودة في المحّ بعناية وانقل الجنين إلى طبق جديد يحتوي على PBS.

بعد نقل الجنين، قم بتثبيته باستخدام الملاقط ودبابيس الحشرات، ثم اسحب محلول PBS. استبدله بمحلول PFA بتركيز 4% في PBS واترك الجنين ليُثبت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتقليل احتمالية التلوث الميكروبي. استخدم H2O منزوع الأيونات في جميع الخطوات التالية بعد تثبيت الجنين؛ اسحب محلول التثبيت وتخلص منه بشكل صحيح كنفايات كيميائية.

املأ الطبق بمحلول BS. بعد ذلك، وباستخدام سكين التشريح المجهري، قم بقص مربع حول الجنين لإزالة الأغشية الجنينية الزائدة. قم بإزالة دبابيس الحشرات باستخدام الملقط بعد سحب الدبابيس. استخدم ماصة بستيور ذات طرف غير مدبب لنقل الجنين إلى قارورة وميض تحتوي على PBT.

اغسل الجنين باستخدام PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. أزل PBT من وعاء الومضان واستبدله بـ PBTX الذي يحتوي على 0.3%H 2 0 2 لإبطال مفعول بيروكسيداز الداخلي المحتمل. حضّن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.

اغسل الجنين بمحلول PBT أولاً ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة، ثم ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة. ولصبغ الجنين بالأجسام المضادة، ابدأ بغسل الجنين لمدة ساعة واحدة في محلول الحجب (blocking buffer) أو 1%BSA 1%NGS.

نستخدم NGS لأن الجسم المضاد الثانوي قد تم إنتاجه في الماعز. يتم التحضين على جهاز mutator لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، يتم تخفيف الجسم المضاد الأولي بنسبة واحد إلى واحد في محلول الحجب (blocking buffer) وتحضين الجنين في هذا المحلول لمدة يومين عند درجة حرارة 4 °C على جهاز mutator.

يعتمد عامل تخفيف الجسم المضاد الأولي على نوع الجسم المضاد الأولي المختار. نستخدم هنا جسماً مضاداً من بنك هجين الدراسات التطورية DOMA، والذي يتم توفيره في شكل سائل طافٍ (supernatant). نقوم بتخفيفه بنسبة واحد إلى واحد في محلول الحجب.

بعد ذلك، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في PBT، تليها ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في PBT. بعد الغسل، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 1 إلى 2,500 في محلول الحجب. في هذه الحالة، استخدم goat anti-US IgG المقترن بإنزيم peroxidase، ثم قم بحضن الجنين في هذا المحلول طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية على جهاز الهزاز.

قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في PBT، تليها ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في PBT لإظهار تفاعل اللون للجنين المصبوغ. ثم قم بإجراء أول غسلتين لمدة 20 دقيقة في محلول tris المنظم بتركيز 100 millimolar tris، HCL pH 7.4. بعد ذلك، قم بإزالة محلول TS المنظم الأخير من القارورة التي تحتوي على الجنين واستبدله بخمسة milliliters من محلول DAB.

احتفظ بها في الظلام على جهاز التحريك لمدة 20 دقيقة. تخلص من طرف الماصة في الدلو الذي يحتوي على محلول مبيض بتركيز 10%. ومن أجل تطهير DAB، أضف 16 µL.

أضف H 2 0 2 المخزنة إلى القارورة التي تحتوي على الأجنة في محلول DAB. احفظها في الظلام. بعد مرور 10 دقائق، راقب التفاعل تحت المجهر حتى يكتمل التفاعل اللوني. تخلص من DAB في دلو المبيض، واستبدله بخمسة milliliters.

ماء صنبور. بعد ذلك، يتم إجراء غسلتين في PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما للتحضير للتصوير والتقطيع بالشمع. يتم تجفيف الجنين المصبوغ في سلسلة من الإيثانول بتركيزات 25% و50% و75% و100% لمدة 10 دقائق لكل تركيز.

بعد عملية التجفيف، استبدل الإيثانول بـ 0.5 إلى 1 مل من زيت خشب الأرز. سيؤدي ذلك إلى جعل الجنين شفافاً لعملية التصوير في زيت خشب الأرز. بعد التصوير، أعد الجنين إلى القارورة واستبدل زيت خشب الأرز بإيثانول بتركيز 100%.

أخيراً، استبدل الإيثانول بـ 5% fast green FCF في 100% ethanol واحضن العينات لمدة ثلاث دقائق. ستجعل هذه الخطوة الأجنة مرئية للفحص النسيجي. استبدل محلول fast green FCF بـ 100% ethanol وقم بالمعالجة من أجل الفحص النسيجي.

إليك ثلاثة أمثلة لأجنة مصبوغة. هذه الأجنة في المرحلة 11 تم وسمها باستخدام 15.3 B سواء كانت موجودة أم لا. 1 هو جسم مضاد نوعي للحبل العقدي تم تطويره في مختبر جين دود وتوم جيسيل.

بعد مرور دقيقتين في DAB، يظل الجنين شفافاً. وبعد 20 دقيقة في DAB، يظهر وسم طفيف في الحبل العقدي. وأخيراً، بعد 40 دقيقة، يكتمل وسم الحبل العقدي.

في هذا المثال، نوضح كيف يتعرف PAC seven، وهو جسم مضاد تم تطويره في مختبر Tom Jessel، على المراحل المبكرة من إغلاق الأنبوب العصبي، بالإضافة إلى خلايا العرف العصبي القحفية الناشئة من الدماغ المتوسط. هنا، تم وسم الجنين باستخدام مسبار Croc 20 من مختبر David Wilkinson، يليه استخدام جسم مضاد واحد. لقد شرحنا لكم للتو كيفية إجراء الكيمياء النسيجية المناعية للحمل الكامل في الأجنة.

يمكن استخدام هذا الإجراء أيضًا على الأجنة التي تمت معالجتها مسبقًا لعملية التهجين الموضعي على العينة الكاملة (whole mount in situ hybridization). وفي هذه الحالة، يتم تثبيت الجنين لفترة وجيزة لمدة ساعة واحدة بعد التهجين الموضعي، ثم يتم المتابعة بصبغ الأجسام المضادة. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.