طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

يوضح هذا الفيديو الخطوات المختلفة لعملية الكيمياء النسيجية المناعية للتثبيت الكامل في جنين الدجاج باستخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بإنزيم HRP. أولاً، يتم تثبيت الجنين في مادة para formaldehyde، ثم يتم إخماد نشاط البيروكسيداز الداخلي.

يتم بعد ذلك تحضين الجنين في الجسم المضاد الأولي. وبعد عدة عمليات غسيل، يُحضن الجنين في الجسم المضاد الثانوي المقترن بـ HRP، ثم يتم إظهار تفاعل اللون باستخدام ركيزة DAB، حيث يظهر تلوين الأجسام المضادة باللون البرتقالي. وتكمن ميزة هذه الطريقة مقارنة باستخدام الأجسام المضادة الفلورية في إمكانية معالجة الأجنة لعمل مقاطع شمعية، مما يتيح دراسة مواقع المستضدات في المقطع العرضي.

مرحباً، أنا دلفين من مختبر FIN في مركز الطب البيئي والجيني في جامعة Texas A&M في هيوستن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ صبغ الأجسام المضادة المثبتة للهرمونات في أجنة الدجاج باستخدام أجسام مضادة مقترنة بإنزيم HRP. نحن نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة مورفولوجيا الأجنة بعد العلاج بالأدوية المضادة للصرع.

فلنبدأ الآن في إجراء الكيمياء النسيجية المناعية للتركيب الكامل على أجنّة الدجاج. أولاً، افتح البيضة عن طريق النقر على القشرة باستخدام الملقط وإزالة قطع القشرة. قم بإزالة الألبومين السميك بالملقط وأمِل كيس المحّ باستخدام ملقط خشن بحيث يكون الجنين موجهاً للأعلى.

بعد ذلك، استخدم مقصاً دقيقاً لقص مربع من كيس المحّ حول الجنين. قم بإزالة الجنين من المحّ باستخدام ملعقة وضعه في طبق يحتوي على PBS تحت مجهر تشريحي. أزل الأغشية الموجودة في المحّ بعناية وانقل الجنين إلى طبق جديد يحتوي على PBS.

بعد نقل الجنين، قم بتثبيته باستخدام الملاقط ودبابيس الحشرات وقم بشفط محلول PBS. استبدله بـ 4%PFA في PBS واترك الجنين ليثبت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتقليل التلوث الميكروبي المحتمل. استخدم D deionized H2O في جميع الخطوات التالية بعد تثبيت الجنين، ثم قم بشفط محلول التثبيت والتخلص منه بشكل صحيح كنفايات كيميائية.

املأ الطبق بمحلول BS. بعد ذلك، وباستخدام سكين التشريح الدقيق، قم بقص مربع حول الجنين لإزالة الأغشية خارج الجنينية. قم بإزالة دبابيس الحشرات باستخدام الملقط بعد سحب الدبابيس. استخدم ماصة رعوية ذات طرف غير مدبب لنقل الجنين إلى قارورة وميض تحتوي على PBT.

اغسل الجنين باستخدام PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. قم بإزالة PBT من قارورة الوميض واستبداله بـ PBTX الذي يحتوي على 0.3%H 2 0 2 وذلك لتعطيل بيروكسيداز الداخلي المحتمل. يتم التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.

اغسل الجنين بمحلول PBT أولاً ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة، ثم ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل مرة. ولصبغ الجنين بالأجسام المضادة، ابدأ بغسل الجنين لمدة ساعة واحدة في محلول الحجب أو 1%BSA 1%NGS.

نستخدم NGS لأن الجسم المضاد الثانوي تم إنتاجه في الماعز. يتم التحضين على جهاز mutator لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، يتم تخفيف الجسم المضاد الأولي بنسبة واحد إلى واحد في محلول الحجب (blocking buffer) وتحضين الجنين في هذا المحلول لمدة يومين عند درجة حرارة 4 °C على جهاز mutator.

يعتمد عامل تخفيف الجسم المضاد الأولي على نوع الجسم المضاد الأولي المختار. نستخدم هنا جسماً مضاداً من بنك الهجن DOMA للدراسات النمائية، والذي يتم توفيره على شكل سائل طافٍ. نقوم بتخفيفه بنسبة واحد إلى واحد في محلول الحجز.

بعد ذلك، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في PBT، تليها ثلاث غسلات لمدة ساعة واحدة في PBT. بعد الغسيل، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي بنسبة 1 إلى 2,500 في محلول الحجب. وفي هذه الحالة، استخدم goat anti-US IgG المقترن بإنزيم peroxidase وقم بحضن الجنين في هذا المحلول طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على جهاز هزاز.

أجرِ ثلاث عمليات غسل لمدة 10 دقائق في PBT، تليها ثلاث عمليات غسل لمدة ساعة واحدة في PBT لتطوير تفاعل اللون للجنين المصبوغ. ثم أجرِ أول عمليتي غسل لمدة 20 دقيقة في محلول tris المنظم (tris بتركيز 100 millimolar، HCL pH 7.4). بعد ذلك، أزل غسلة محلول TS المنظم الأخيرة من القارورة التي تحتوي على الجنين واستبدلها بخمسة milliliters من محلول DAB.

اتركه في الظلام على جهاز الرج (mutator) لمدة 20 دقيقة. تخلص من طرف الماصة في الدلو الذي يحتوي على محلول مبيض بتركيز 10%. ومن أجل تطهير DAB، أضف 16 µL.

أضف H 2 0 2 المخزن إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة في DAB. احفظه في الظلام. بعد 10 دقائق، راقب التفاعل تحت المجهر حتى يكتمل تفاعل اللون. تخلص من DAB في دلو المبيض، واستبدله بخمسة milliliters.

ماء صنبور. بعد ذلك، يتم إجراء غسلتين لمدة 10 دقائق في PBS للتجهيز للتصوير والتقطيع بالشمع. يتم تجفيف الجنين المصبوغ باستخدام سلسلة من الإيثانول بتركيزات 25% و50% و75% و100% لمدة 10 دقائق لكل تركيز.

بعد عملية التجفيف، استبدل الإيثانول بـ 0.5 إلى 1 ملليلتر من زيت خشب الأرز. سيؤدي ذلك إلى جعل الجنين شفافاً لتسهيل عملية التصوير الفوتوغرافي في زيت خشب الأرز. وبعد التصوير، أعد الجنين إلى القارورة واستبدل زيت خشب الأرز بإيثانول بتركيز 100%.

أخيراً، استبدل الإيثانول بمحلول fast green FCF بتركيز 5% في إيثانول 100% واتركه للتحضين لمدة ثلاث دقائق. ستجعل هذه الخطوة الأجنة مرئية للفحص النسيجي. استبدل محلول fast green FCF بإيثانول 100% ثم ابدأ عملية المعالجة للفحص النسيجي.

فيما يلي ثلاثة أمثلة لأجنة مصبوغة. هذه الأجنة في المرحلة 11، وهي مُعلّمة باستخدام 15.3 B سواء كانت موجبة أو سالبة، وهو جسم مضاد محدد للحبل العقدي تم تطويره في مختبر جين دود وتوم جيسل.

بعد مرور دقيقتين في محلول DAB، يظل الجنين شفافاً. وبعد 20 دقيقة في محلول DAB، يظهر وسم طفيف في الحبل العقدي. وأخيراً، بعد 40 دقيقة، يكتمل وسم الحبل العقدي.

في هذا المثال، نوضح كيف يتعرف الجسم المضاد PAC seven، الذي تم تطويره في مختبر Tom Jessel، على المراحل المبكرة من انغلاق الأنبوب العصبي بالإضافة إلى خلايا العرف العصبي القحفية الناشئة من الدماغ المتوسط. هنا، تم وسم الجنين باستخدام مسبار Croc 20 من مختبر David Wilkinson، متبوعاً بجسم مضاد واحد. لقد شرحنا لكم للتو كيفية إجراء الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة في الأجنة.

يمكن استخدام هذا الإجراء أيضاً مع الأجنة التي تمت معالجتها مسبقاً من أجل التهجين الموضعي للعينات الكاملة. في هذه الحالة، يتم تثبيت الجنين لفترة وجيزة لمدة ساعة واحدة بعد التهجين الموضعي، ثم البدء في صبغ الأجسام المضادة. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.