تقنية لجمع المسلسل من السائل النخاعي من ماجنا في صهريج للماوس

تبدأ العملية بتخدير الفأر وتجهيز الموقع الجراحي. ثم يُوضع الفأر في وضعية الانبطاح على الجهاز التجسيمي (stereotaxic instrument). يتم إجراء شق جلدي سهمي أسفل القذال، ثم تُفصل الأنسجة تحت الجلد وعضلات الرقبة بشكل غير حاد عبر الخط الناصف.

بعد ذلك، يتم وضع الجزء الخلفي من الجسم بحيث يشكل الجسم زاوية 135 درجة مع الرأس المثبت، ويتم اختراق الأم الجافية عند sternum magna في الفقرة CI باستخدام الشعيرة الزجاجية لجمع السائل الدماغي النخاعي (CSF). بعد أخذ عينة من السائل الدماغي النخاعي، يتم إعادة ترتيب العضلات وخياطة الجلد، ثم يُحقن حوالي 1 مل من محلول 0.9%NACL الملح تحت الجلد لمنع الجفاف، ويتم الحفاظ على دفء الفأر حتى يتعافى. مرحبًا، اسمي Liu من مختبر الدكتورة Karen Duff في The Top Institute بجامعة Columbia.

سأوضح لكم اليوم كيفية جمع السائل الدماغي الشوكي من الصهريج الكبير للفأر. باستخدام هذه التقنية، يمكننا جمع عينات متسلسلة من السائل الدماغي الشوكي حتى ثلاث مرات من الفأر نفسه بفاصل زمني يتراوح من شهرين إلى ثلاثة أشهر. ونستخدم في مختبرنا هذه التقنية لتحديد مستويات A beta أو tau في السائل الدماغي الشوكي في أعمار مختلفة من نماذج الفئران المعدلة وراثياً والمصابة بمرض الزهايمر، ونقوم بربط هذه القيم بتلك الموجودة في الدماغ.

في النهاية، نحن مهتمون بإمكانية استخدام مستويات beta أو tau في السائل الدماغي الشوكي (CSFA) كعلامات بيولوجية محتملة لتطور المرض وكذلك للتجارب العلاجية في الفئران. لذا، دعونا نبدأ. لهذا الإجراء، من الضروري صنع شعيرات دموية باستخدام ماصة دقيقة قطبية.

الشعيرات المستخدمة هنا هي من زجاج السيليكات BOA B 175 10 من شركة Sutter Instruments؛ يتم سحب الشعيرات باستخدام جهاز Sutter P 87 لسحب الماصات الدقيقة باللهب، مع ضبط مؤشر الحرارة عند 300 ومؤشر الضغط عند 30. يبلغ طول الشعيرة الزجاجية 5 cm ولها طرف مستدق. يتم قص طرف الشعيرة باستخدام مقص بحيث يكون قطرها الداخلي حوالي 0.5 mm.

تبدأ العملية الجراحية بتخدير الفأر باستخدام الكيتامين بجرعة 100 milligrams per kilogram والزيلازين بجرعة 10 milligrams per kilogram عن طريق الحقن داخل الصفاق، وأثناء التخدير، يجب الحفاظ على دفء الفأر في حضانة بدرجة حرارة 37 degree Celsius. بعد التأكد من تخدير الحيوان بشكل كامل عن طريق اختبار رد فعل سحب الإصبع عند القرص، يتم حلاقة منطقة الرقبة، ثم يوضع الفأر على جهاز التوجيه المجسم (stereotaxic instrument) مثل هذا الجهاز من David kink. وبالتلامس المباشر مع وسادة التدفئة، يتم إدخال مسبار درجة حرارة شرجي بحيث يمكن ضبط الحرارة المنبعثة من الوسادة وفقاً لدرجة حرارة جسم الفأر.

ثبّت الرأس باستخدام مهيئات الرأس، وامسح جلد الرقبة بـ 10% povidone iodine و 70% ethanol ثلاث مرات، ثم قم بإجراء شق سهمي أسفل الجزء الخلفي من الرأس أو القذال. يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت مجهر التشريح باستخدام ملقط غير مدبب. افصل الأنسجة تحت الجلد والعضلات M by ventor services و M rectus capita dorsalis major بحيث يتم كشف الأم الجافية للـ sternum magna. استخدم زوجاً من المباعدات الدقيقة بشكل صحيح لإبقاء العضلات متباعدة.

أخيرًا، ضع الفأر بحيث يكون الرأس بزاوية 135 درجة بالنسبة للجسم. وبذلك يصبح الفأر جاهزًا لجمع السائل الدماغي النخاعي (CSF). وقد نُشرت هذه التقنية لجمع السائل الدماغي النخاعي من الـ sternum Magno سابقًا.

الشكل 1-أ تحت مجهر التشريح. تظهر الأم الجافية كمثلث مقلوب لامع وشفاف، يمكن من خلاله رؤية النخاع المستطيل ووعاء دموي رئيسي. الشريان الجافي الشوكي (Arteria dural spinella)، الشكل 1-ب. يمكن رؤية النبض الدوري للنخاع والحيز المجاور للسائل الدماغي الشوكي (CSF).

جفف الأم الجافية باستخدام مسحة قطنية معقمة، ثم أدخل الشعيرة في الـ CI sternum magna عبر الأم الجافية جانبيًا بالنسبة للـ arteria dorsalis spinels. سيحدث تغير ملحوظ في المقاومة عند إدخال الشعيرة بشكل صحيح، وعندها سيتدفق الـ CSF إلى داخل الشعيرة. بعد جمع الـ CSF، قم بإزالة الشعيرة بعناية ووصلها بمحقنة سعة 3 mL باستخدام أنبوب بولي إيثيلين بقطر داخلي يبلغ 1 mm.

احقن السائل الدماغي الشوكي (CSF) في أنبوب سعة 0.5 milliliter. قم بتمييز الأنبوب وتجميده فوراً على الجليد الجاف. وبمجرد تجميده، انقل السائل الدماغي الشوكي (CSF) إلى مجمد بدرجة حرارة minus 80 °C.

تعد تقنية أخذ العينات التي تم توضيحها للتو لطيفة للغاية، وتسمح بأخذ عينات لاحقة من السائل الدماغي الشوكي (CSF) من الفأر نفسه على فترات تتراوح بين شهرين إلى ثلاثة أشهر. وبناءً على ذلك، بعد أخذ العينة من الرقبة، يجب إعادة محاذاة العضلات والجلد وإغلاقهما باستخدام الغرز الجراحية. وبعد خياطة الشق، يتم حقن حوالي 1 mL من محلول ملحي 0.9%NACL تحت الجلد لإعادة ترطيب الفأر.

حافظ على تدفئة الفأر عند درجة حرارة 37 °C تقريبًا حتى يتماثل للشفاء. وراقب وزنه في اليوم الأول واليوم السابع بعد الجراحة. لقد أوضحت لك للتو كيفية جمع السائل الدماغي النخاعي من الـ system mag الخاص بالفأر.

عند تنفيذ هذا الإجراء، هناك ثلاثة أمور مهمة يجب تذكرها. أولاً، قم بوضع رأس وجسم الفأر بشكل صحيح على الإطار التجسيمي لضمان كشف أكبر قدر ممكن من الـ ator الخاص بـ Cy Magna. ثانياً، تجنب الأوعية الدموية بعناية عند اختراق الـ durometer باستخدام الشعيرة.

وإلا، ستتعرض عينتكم للتلوث بالدم. وأخيراً وليس آخراً، يرجى تذكر الحفاظ على دفء الفئران طوال الإجراء لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم. إن انخفاض درجة حرارة الجسم ليس ضاراً بالفئران فحسب، بل يمكن أن يؤثر بشكل كبير على نتائجكم من خلال تحفيز إنتاج beta أو علاقة tall hypo phosphorylation.

حسناً، هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.