بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG)

تبدأ هذه العملية بعزل العقد العصبية الودية الرقبية العلوية من صغار الجرذان حديثة الولادة في اليوم صفر (P zero). يحتوي كل دماغ على عقدتين ودويتين رقبويتين علويين. ويمكن جمع ما يقرب من 24 عقدة عصبية من بطن واحد من صغار الجرذان.

يبدأ تفكيك العقد العصبية من خلال التقطيع والمعالجة لمدة 30 دقيقة. ويتم استكمال عملية التفكيك عبر التكرار في التفاعل باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار، مما ينتج عنه معلق من الخلايا المفردة. بعد ذلك، يتم زرع العصبونات الودية في أطباق مطلية بـ collagen ENC.

مرحباً، أنا نيلا زورين من مختبر الدكتور لويد غرين في قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية بجامعة كولومبيا في المدينة. سنقوم اليوم بتوضيح كيفية عزل وزراعة العصبونات الودية الأولية من العقدون الرقبوي العلوي لجراء الفئران الحمراء حديثة الولادة. نستخدم هذه الخلايا عادةً في مختبرنا لدراسة الموت الخلوي المبرمج استجابةً لسحب عامل نمو الأعصاب.

لنبدأ الآن. نبدأ الإجراء بطلاء طبق زراعة بكولاجين ذيل الجرذ قبل 24 ساعة من إجراء عملية التشريح. وبناءً على طبيعة التجربة، يتم استخدام طبق زراعة يحتوي على 24 أو 48 بئراً.

بعد ذلك، سيتم تحضير الأوساط والمحاليل والمعدات. يمكن العثور على هذه المواد والكواشف في البروتوكول النصي المصاحب لهذا الفيديو. ومن المهم ملاحظة وجوب تحضير محلول uridine و 5-FDU قبل الاستخدام مباشرة.

واصل التحضير باستخدام اللهب. يتم صقل ماصات الزجاج الرعوية لخطوات التثبيت. تُثبت طرف الماصة الزجاجية في اللهب لبضع ثوانٍ مع التدوير لتضييق الطرف وتنعيمه.

يجب إجراء عملية الصقل الناري الأولية داخل غطاء خلية استنبات معقمة. لبدء عملية التشريح، يتم جمع صغار الجرذان حديثي الولادة من العمر P zero إلى P one. يتم مسح صغير الجرذ حديث الولادة بسرعة باستخدام 70%ethanol لتقليل التلوث.

بعد عملية قطع الرأس، يتم وضع الرأس على وسادة التشريح بحيث يكون الجانب البطني متجهًا للأعلى والطرف الذيلي موجهًا نحوك. يجب أن تكون القصبة الهوائية المقطوعة مرئية بوضوح. تُستخدم إبر محاقن معقمة لتثبيت الرأس المقطوع على وسادة التشريح بالطريقة التالية.

قم بدفع دبوس واحد عبر سقف الفم وصولاً إلى لوحة التشريح، ثم ادفع الدبوس الثاني عبر الحبل الشوكي المقطوع وصولاً إلى اللوحة. بعد نقل لوحة التشريح تحت المجهر والنظر عبر العدسات العينية، استخدم زوجين من الملاقط لإزالة الجلد والدهون المحيطة بالقصبة الهوائية. ومع توخي الحذر لعدم التعمق كثيراً، ستظهر عضلتان تمتدان بشكل متوازٍ تقريباً على كلا جانبي القصبة الهوائية.

خلال عملية التشريح، ستحتاج إلى الري باستخدام PBS معقم وبارد أو وسط RPMI 1640 بارد وخالٍ من المصل، يتم تقديمه بواسطة ماصة باستور معقمة لغسل الدم الزائد. يمكن القيام بذلك مرة واحدة أو أكثر من مرة، اعتماداً على سرعة العمل. تُستخدم الملاقط بعد ذلك لقطع وإزالة العضلة من أحد الجانبين أولاً.

بمجرد إزالة العضلة، سيصبح الشريان السباتي مرئياً. يمتد هذا الشريان على طول الرغامي ويتفرع إلى ما يشبه شريطاً على شكل حرف Y. يُعد هذا التفرع علامة تشريحية هامة، وبمجرد تحديده، سيكون من السهل نسبياً العثور على العقد العصبية الرقبية العلوية.

يتم قطع الشريان عند الطرف الأكثر الطرفي ورفعه قليلاً باستخدام الملقط. ويُبقى الطرف الآخر من الشريان متصلاً. وبمجرد القيام بذلك، سيصبح العقدون الرقبوي العلوي مرئياً.

يجب ملاحظة أنها كتلة نسيجية صغيرة لامعة، لوزية الشكل، متصلة بشكل فضفاض بالشريان عند نقطة التفرع، وأنها تحتوي على روابط قبل أو بعد عقدية تشبه الخيوط. يُستخدم زوج ثانٍ من الملاقط لفصل العقدة الرقبية العلوية بلطف ووضعها في طبق زراعة صغير بقطر 35 مليمتر يحتوي على وسط RPMI 1640 بارد وخالٍ من المصل. بعد ذلك، تُستخرج العقدة من الجانب الآخر للقصبة الهوائية باتباع البروتوكول ذاته.

بمجرد الانتهاء من تشريح جميع العقد العصبية، يتم تحريرها قدر الإمكان من الأنسجة الزائدة. عند النظر عبر المجهر، يمكن ملاحظة وجود قطع ملتصقة بالعقد العصبية من دهون الشريان السباتي أو أنسجة أخرى، لذا تُستخدم ملقط التشريح لإزالة هذه المواد غير المرغوب فيها. كما يتم قص الروابط العصبية قبل أو بعد العقدية.

تحتوي كل عقدة عصبية على حوالي 10,000 عصبون. وبمجرد زراعة العصبونات، ستبدأ استطالاتها العصبية في النمو مجدداً. ثم توضع العقد العصبية في أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين معقم سعة 15 milliliter يحتوي على وسط RPMI 1640.

بعد ذلك، يتم إنشاء مستنبت عصبونات الجهاز السمبثاوي. تُطرد العقد مركزياً عند 200 G لمدة دقيقتين ويتم التخلص من الرائق. ثم تُعاد تعليق العقد في 0.5 إلى 1 مل من محلول trypsin بتركيز 0.25%، ثم تُوضع في حمام مائي أو حاضنة عند 37 °C لمدة 30 دقيقة للمساعدة في تفكيك الخلايا الموجودة في العقد.

بعد مرور 30 دقيقة، يتم إضافة 10 milliliters من الوسط الغذائي الكامل لغرض تخفيف وتحييد trypsin. ثم تُطرد المحاليل مركزياً عند 200 G لمدة دقيقتين. بعد ذلك، يتم التخلص من الراشح وإعادة تعليق العقد في 2 milliliters من الوسط النهائي.

باستخدام إحدى رؤوس الماصات المصقولة بالنار مسبقاً ذات الفتحة الواسعة، يتم تفكيك الخلايا بشكل أكبر عن طريق سحب العقد العصبية صعوداً وهبوطاً 20 مرة. ثم يوضع الأنبوب على الثلج لبضع دقائق. بعد ذلك، يتم صقل الماصة بالنار مرة أخرى لجعل الفتحة أكثر ضيقاً.

بعد أن تبرد الماصة، يتم سحق العقد العصبية 20 مرة إضافية. سيزداد تعكر الوسط تدريجياً، مما يشير إلى تفكك الخلايا. تُكرر هذه الخطوة مرة أو مرتين إضافيتين بناءً على مدى كفاءة تفكك الخلايا.

بعد مرور بعض الوقت، ستنفصل العقد العصبية إلى عصبونات ولن تظهر أي عقد سليمة في الأنبوب. قد تتبقى بعض المواد النسيجية التي لن تنفصل في هذه المرحلة. يُترك الأنبوب على الثلج لبضع دقائق حتى تترسب أي حطام غير منفصل في القاع.

يتم تجميع كل السائل الطافي بعناية باستثناء حوالي 50 µL تقريبًا ووضعه في أنبوب آخر. يُترك 50 µL في قاع الأنبوب لمنع انتقال الحطام غير المرتبط. بعد ذلك، يتم إضافة المزيد من الوسط النهائي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المفككة.

يعتمد حجم الوسط النهائي المضاف على نوع طبق الزرع المستخدم لاستنبات العصبونات. على سبيل المثال، في حال استخدام طبق يحتوي على 24 بئراً، يتم وضع عقدة عصبية واحدة في كل بئر في 0.5 milliliters من الوسط النهائي لكل بئر.

يتكون بطن الجرذ النموذجي من 12 جرواً، مما يوفر 24 عقدة عصبية. وهذا العدد كافٍ لملء لوحة واحدة تحتوي على 24 بئراً، ويبلغ الحجم الإجمالي للوسط النهائي 12 milliliters. سيؤدي استخدام uridine five FDU في الوسط النهائي إلى منع تكاثر مجموعة صغيرة من الخلايا الدبقية وأنواع الخلايا الأخرى وتحفيز موتها.

يتم تغذية الخلايا الموجودة في المزرعة كل 48 ساعة عن طريق استبدال ثلثي الوسط الغذائي بوسط RPMI طازج مضاف إليه 1% horse serum وNGF وuridine وخمس FDU. في البداية، تحتوي المزرعة على عصبونات ودية تظهر بشكل مستدير دون وجود عصبونات.

تصبح العصبونات القصيرة مرئية بعد 24 ساعة من عملية التشريح، وتزداد كثافة وتفرعاً تدريجياً بمرور الوقت. لقد شرحنا لكم للتو كيفية عزل وزراعة العصبونات الودية الأولية من العقدون الرقبويتين العلويين لصغار الجرذان. عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر ما يلي: أولاً، تخصيص الوقت والعناية الكافيين لتنظيف العقد العصبية، وإزالة جميع الحطام والأوعية الدموية والدهون.

تعتبر هذه الخطوة مهمة لضمان الحصول على مستنبت متجانس إلى حد ما وخالٍ من أنواع الخلايا الغريبة. ثانياً، كن صبوراً أثناء خطوة الفصل وخذ الوقت الكافي لفصل العصبونات بحيث لا تتواجد في تكتلات كبيرة؛ فبمجرد وضعها على الأطباق، ستجعل التكتلات الكبيرة العملية صعبة.

في التطبيقات اللاحقة مثل قطع العصبونات أو إصابتها، قد يتم إعاقة الصبغ المناعي أيضاً، كما ستصعب إجراء أي تجارب تتطلب عد العصبونات. وأخيراً، ليس من الضروري تزويد الوسط بـ penicillin streptomycin؛ فإضافة penicillin streptomycin في المرة الأولى التي يتم فيها استزراع الخلايا تكون كافية.

أضف uridine five FDU الطازج إلى الوسط في كل مرة يتم فيها استبدال الوسط. لقد استخدم مختبرنا المزارع العصبية الودية لدراسة موت الخلايا المبرمج استجابةً لسحب عامل نمو الأعصاب. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.