Name: بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: تعلم عزل وزراعة الخلايا العصبية التعاطفية الأولية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG) لدراسة علم الأعصاب والبيولوجيا الخلوية. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء مزارع خلوية قابلة للتكرار.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونيوزيلندي أود أن أشكر أعضاء مختبر سوبهاس بيسواس ، سبرول أندرو ، ويليت ريان على تدريبها في تشريح وحصاد الخلايا العصبية المتعاطفة. بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، NINDS.

1. التحضير للتشريح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد طبق الثقافة المناسبة (10 سم أو 6 لوحات جيدا أو جيدا 24 ، الخ.) تبعا لطبيعة من التجارب الخاصة بك ، ومعطف لهم ذيل فأر 24 ساعة قبل تشريح الكولاجين. وقد وصفت وسائل لاعداد الجرذان ذيل الكولاجين واستخدامها لأطباق معطف الثقافة في مكان آخر (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل التربسين 0.25 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (بدون EDTA) وفلتر تعقيم. 1 مل aliquots إعداد وتخزين -20 درجة مئوية في C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول يحتوي على 2.5 ملي كل من يوريدين و 5 في FDU المقطر / منزوع الأيونات H 2 O. فلتر تعقيم وتجهيز 50 aliquots ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متوسطة أكمل : RPMI مستنبت 1640 مع المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل الحصان (الحرارة التي يحتضنها تعطيل في بالحمام المائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متوسطة النهائي : RPMI مستنبت 1640 مع الحرارة المعطل 1 ٪ الحصان المصل + NGF (100ηg/ml التركيز النهائي) + البنسلين / الستربتوميسين (1 / 250) + حل uridine/5-FDU 1 / 250 (10 ميكرومتر تركيز النهائي) . ملاحظة : ينبغي بذل هذه الوسيلة الجديدة حتى قبل استخدامها في كل مرة. عن تجربة في شكل لوحة 24 جيدا ، وسوف يحتاج المرء لإعداد 12 مل من هذا المتوسط. فمن المستحسن أن تقوم بإعداد قليلا اضافية. يمكن شراؤها NGF من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية (انظر الجدول في نهاية هذا البروتوكول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعدات : واحد سوف تحتاج إلى مجهر تشريح ومصدر الضوء. ويفضل من الألياف البصرية معقوفة منار المزدوجة مع نصائح التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يحتاج المرء لتنظيف وتعقيم (عن طريق التعقيم أو تمرغ في الايثانول 70 ٪ على الأقل 20 دقيقة) وأدوات تشريح التالية : زوجين من الدقيقة تشريح ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ ، وزوج من مقص تشريح (أيضا الفولاذ المقاوم للصدأ وكلاهما من Roboz). وسيتم أيضا اثنين من إبر المحاقن المعقمة (26 × 1 gague ½ بوصة أو ما شابه) تكون هناك حاجة. فمن الضروري لاقامة مجلس تشريح ، وهو 3 &quot;X3&quot; قطعة من الستايروفوم ملفوفة بورق الألمنيوم ومغطاة Kimwipe. رذاذ متنها الإيثانول 70 ٪ لتطهير. أخيرا ، تعد لإطلاق النار الزجاج المصقول المراعي ماصة. من أجل تلميع إطلاق النار ، واتخاذ ماصة الزجاج وعقد قمة في لهب لبضع ثوان ، في حين تناوب. عند التفتيش ، وسوف تبدو أكثر سلاسة غيض وفتح ستكون أضيق. هذه هي خطوة ضرورية لخلايا حيث سيتم فصلها. أداء النار تلميع في خلية غطاء الثقافة بحيث يبقى ماصة معقمة. </li></ol> 2. تشريح العقد العنقية العليا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الجراء الفئران حديثي الولادة التي هي في سن أو P0 P1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح بسرعة الجرو لتشريح الايثانول مع 70 ٪ لتقليل فرص التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجرو بسرعة مع زوج من مقص حاد (لن تكون هذه الخطوة تظهر في شريط الفيديو). عقد رئيس باستخدام ملقط معقم ضد شاش معقم لاستنزاف الدم لفترة وجيزة الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رأسه على الوسادة تشريح مع الجانب البطني مواجهة ونهاية الذيل موجهة نحوك. يجب قطع القصبة الهوائية تكون مرئية بسهولة. استخدام إبر المحاقن المعقمة لتأمين رأس مقطوع لوحة تشريح على النحو التالي : دفع one دبوس على الرغم من أن سقف الفم في لوحة ودفع دبوس الثاني رغم قطع القصبة الهوائية في لوحة. وضع وسادة تحت المجهر تشريح والبدء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل ملقط (واحدة في كل يد) الجلد واضحة بعيدا والدهون حول القصبة الهوائية ، مع الحرص على عدم ذهاب عميقا جدا. وسوف نفعل ذلك يعرض زوج من العضلات مواز تقريبا لبعضها البعض على جانبي القصبة الهوائية. ملاحظة : أثناء تشريح ، سوف تحتاج إلى ري مع برنامج تلفزيوني العقيمة الباردة أو باردة ، 1640 مصل مجانا RPMI المتوسطة تسليمها مع ماصة معقمة باستور ، ليغسل الدم الزائد وإبقاء المنطقة نظيفة ورطبة. ويمكن القيام بذلك إلا مرة واحدة أو أكثر من مرة تبعا لمدى سرعة واحد يعمل. لمشرح الخبرة ، فإنه يأخذ فقط حوالي 2-3 دقائق لتشريح من زوج من العقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقطع وإزالة العضلات على جانب واحد أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد إزالة العضلات ، والشريان السباتي تصبح مرئية. غالبا ما يكون وردي خفيف ويحتوي على الدم. قد يبدو أفتح لونا من الأوعية الدموية الأخرى التي قد ترى في محيط ، ولهذا السبب الشريان السباتي قد لا يكون ملحوظا على الفور. هذا الشريان يعمل جنبا إلى جنب مع القصبة الهوائية وbifurcates الى ما يشبه &quot;Y&quot; على شكل شريط. هذا التشعب يشكل معلما هاما ويقع مرة واحدة ، فإنه سيكون من السهل نسبيا العثور على SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشريان في نهاية معظم الذيلية ورفعه ارتفاعا طفيفا مع ملقط (لا يزال مربوطا الطرف الآخر). بمجرد القيام بذلك ، سوف تشاهد لوزية الشكل ، لامعة كتلة صغيرة من الأنسجة التي تبحث هي فضفاضة يعلق على الشريان فقط في نقطة والتشعب الذي عبتيEAD مثل قبل و- / أو آخر ، connectives العقدية. هذه هي العقدة متفوقة عنق الرحم. استخدام ملقط من الزوج الثاني في اليد الأخرى لفصل برفق ومكان في صحن الثقافة الصغيرة (35 مم) التي تحتوي على والمصل الباردة مجانا RPMI 1640 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، استخراج عقدة على الجانب الآخر من القصبة الهوائية بعد بروتوكول نفسه. </li></ol> 3. تنظيف العقد : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تشريح كل من العقد ، ينبغي الافراج عنهم قدر المستطاع من الأنسجة دخيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، قد ترى أن العقد قد تعلق قطعة من الشريان السباتي ، والأنسجة الدهنية أو غيرها. العمل مع ملقط في كل يد لندف بعيدا هذه المواد غير المرغوب فيها. تنظيف مكان العقد الى المخروطية 15ml العقيمة ، أنبوب البولي بروبيلين ، وتحتوي على 1640 RPMI المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أيضا connectives قبل و / أو العقدية آخر ، يتم قطع بعيدا. كل عقدة لديها نحو 10000 الخلايا العصبية. حالما يتم مطلي الخلايا العصبية ، فإنها تنمو neurites بهم. </li></ol> 4. تأسيس ثقافة متعاطف الخلية العصبية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العقد في 200xg لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend على العقد في 0،5-1 مل من محلول التربسين 0.25 ٪. مكان بالحمام المائي في 37 ˚ C أو حاضنة لمدة 30 دقيقة. وهذا سيساعد على فصل الخلايا في العقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة ، وإضافة 10 مل من متوسطة إلى كاملة لتخفيف وتحييد التربسين والطرد المركزي في 200xg لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف resuspend في 2 مل من متوسطة النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا عن طريق زيادة الطحن في العقد صعودا وهبوطا مع اطلاق النار من الزجاج المصقول ماصة المراعي. يسحن في العقد 20 مرة ، ووضع أنبوب على الجليد لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، النار تلميع أكثر ماصة لجعل فتح أضيق (حوالي 2 / 3 إلى 1 / 2 مليمتر في القطر). انتظر بضع دقائق حتى يبرد ويسحن في العقد 20 مرة أكثر من ذلك. كما قمت بالمتابعة ، سوف تصبح تدريجيا المتوسطة مشيرا إلى أن الخلايا cloudier يتم فصلها. كرر هذه الخطوة مرة أو مرتين أكثر اعتمادا على مدى فصل الخلايا. بعد بعض الوقت ، ستلاحظ أن جميع العقد قد نأت الى الخلايا العصبية والعقد ليس سليما واضحة في الأنبوب. قد يكون هناك بعض المواد الأنسجة التي لن تنفصل. عند هذه النقطة ، والسماح للأنبوب الجلوس في الثلج لبضع دقائق حتى أن أي تسوية يمكن أن الحطام undissociated إلى أسفل. الآن بعناية جمع ما يقرب من جميع المتوسط ​​من أعلى مكان ، وآخر في الأنبوب. لضمان أن لا جمع الحطام undissociated ، وترك نحو 50 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة أكثر من المتوسط ​​النهائي للأنبوب التي تحتوي على الخلايا تنفصل : هذا الحجم يعتمد على نوع من ثقافة واحدة لوحة يستخدم للثقافة الخلايا العصبية. على سبيل المثال : إذا طبق بشكل جيد هو 24 لاستخدامها ، ثم لوحة العقد 0،5 لكل بئر (~ 10000 الخلايا العصبية لكل بئر) في 0.5 مل من المتوسط ​​النهائي لكل بئر. أ القمامه الفئران نموذجية تتكون من 12 الجراء ، والتي ستعطي العقد 24. هذا هو ما يكفي لوحة البذور 24 واحد وكذلك إجمالي حجم متوسط ​​النهائي هو 12 مل. ملاحظة : في العقد تحتوي أيضا على عدد صغير من السكان من أنواع الخلايا الدبقية ، والأخرى التي ستكون حاضرة في الثقافة. وسوف تستخدم في المتوسط ​​Uridine/5-FDU النهائي منع انتشارها وتعزيز وفاتهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا كل 48 ساعة عن طريق استبدال 2 / 3 من وسيلة جديدة مع RPMI +1 ٪ الحصان NGF + المصل وuridine/5-FDU. ملاحظة : في البداية ، وثقافة يحتوي على الخلايا العصبية التي تبدو متعاطفة مع عدم وجود جولة neurites. neurites قصيرة تصبح مرئية بعد 24 ساعة من تشريح وتصبح تدريجيا أكثر كثافة وأكثر بمرور الوقت تشعبت. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.

نستخدم سبراغ داولي الفئران لثقافاتنا. يستغرق وقتا طويلا والحذر عند تنظيف العقد. إزالة جميع السفن الحطام في الدم ، والدهون. هذه الخطوة هامة في ضمان وجود الثقافة التي هي أكثر أو أقل متجانسة وخالية من أنواع الخلايا الدخيلة. وإضافة إلى حد كبير uridine/5-FDU القضاء على أية خلايا العصبية المتبقية غير (الإنقسامية) تلويث الثقافة أو على الأقل منع انتشارها. بالإضافة إلى ذلك ، خلال الخطوة تفارق ، التحلي بالصبر وتأخذ م...

<table><tbody><tr><td>ملقط، فولاذ مقاوم للصدأ #5</td><td>أداة</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>مقص DEAVER مستقيم، حاد-غير حاد - شفرات 43mm - 5.5</td><td>أداة</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 مع L-Glutamin</td><td>كاشف</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل جنين البقر</td><td>كاشف</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>مصل خيول متبرع</td><td>كاشف</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>يتم إبطال مفعول الحرارة عن طريق التحضين في حمام مائي بدرجة حرارة 56&amp;#x00B0;C لمدة 30 دقيقة.</td></tr><tr><td>بنسلين/ستريبتومايسين</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>تريبسين بدون EDTA</td><td>كاشف</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>يوريدين</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxyuridine</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>كاشف</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تشريح ومصدر ضوئي</td><td>مجهر</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنابيب بولي بروبيلين سعة 15 ml</td><td>أداة</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة الخلايا</td><td>أداة</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

في العقد متفوقة عنق الرحم (SCG) في الفئران ، لامعة صغيرة ، لوزية الشكل الهياكل التي تحتوي على الخلايا العصبية المتعاطفة. هذه الخلايا العصبية توفير innervations متعاطفة عن الرأس والعنق والمناطق التي يشكل عدد سكانها جيدا ، وتتميز متجانسة نسبيا (4). الخلايا العصبية المتعاطفة تعتمد على عامل نمو الاعصاب (نيسان الخليج) لتحقيق النمو والبقاء التمايز والمحاور وانتشرت على نطاق وتوافر NGF يسهل ثقافتهم والتلاعب التجريبية (2 ، 3 ، 6). لهذه الأسباب ، فقد تم استخدام الخلايا العصبية المتعاطفة مثقف في طائفة واسعة من الدراسات بما في ذلك تطوير الخلايا العصبية والتفرقة ، وآليات للموت الخلايا المبرمج والمرضية ، ونقل الإشارة (1 ، 2 ، 5 ، و 6). تشريح خارج SCG من الفئران حديثي الولادة وزراعة الخلايا العصبية المتعاطفة ليست معقدة للغاية ويمكن أن تتقن بسرعة إلى حد ما. في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تشريح خارج SCG من الفئران الوليدة الوليد واستخدامها لإنشاء الثقافات من الخلايا العصبية المتعاطفة. وتصف المقالة أيضا الخطوات التحضيرية والكواشف والمعدات المختلفة التي يحتاجها لتحقيق ذلك.

هذا هو بروتوكول تصف كيفية عزل الخلايا العصبية والثقافة متعاطفة الأساسي من العقد العنقية العليا (SCG) من الفئران الوليدة الوليد.

بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG)

تُعد العقد الرقبية العلوية (SCG) في الجرذان تراكيب صغيرة لامعة بيضاوية الشكل تحتوي على عصبونات سمبثاوية. وتوفر هذه العصبونات...

تبدأ هذه العملية بعزل العقد العصبية الودية الرقبية العلوية من صغار الجرذان حديثة الولادة في اليوم صفر (P zero). يحتوي كل دماغ على عقدتين ودويتين رقبويتين علويين. ويمكن جمع ما يقرب من 24 عقدة عصبية من بطن واحد من صغار الجرذان.يبدأ تفكيك العقد العصبية من خلال التقطيع والمعالجة لمدة 30 دقيقة. ويتم استكمال عملية التفكيك عبر التكرار في التفاعل باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار، مما ينتج عنه معلق من الخلايا المفردة. بعد ذلك، يتم زرع العصبونات الودية في أطباق مطلية بـ collagen ENC.مرحباً، أنا نيلا زورين من مختبر الدكتور لويد غرين في قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية بجامعة كولومبيا في المدينة. سنقوم اليوم بتوضيح كيفية عزل وزراعة العصبونات الودية الأولية من العقدون الرقبوي العلوي لجراء الفئران الحمراء حديثة الولادة. نستخدم هذه الخلايا عادةً في مختبرنا لدراسة الموت الخلوي المبرمج استجابةً لسحب عامل نمو الأعصاب.لنبدأ الآن. نبدأ الإجراء بطلاء طبق زراعة بكولاجين ذيل الجرذ قبل 24 ساعة من إجراء عملية التشريح. وبناءً على طبيعة التجربة، يتم استخدام طبق زراعة يحتوي على 24 أو 48 بئراً.بعد ذلك، سيتم تحضير الأوساط والمحاليل والمعدات. يمكن العثور على هذه المواد والكواشف في البروتوكول النصي المصاحب لهذا الفيديو. ومن المهم ملاحظة وجوب تحضير محلول uridine و 5-FDU قبل الاستخدام مباشرة.واصل التحضير باستخدام اللهب. يتم صقل ماصات الزجاج الرعوية لخطوات التثبيت. تُثبت طرف الماصة الزجاجية في اللهب لبضع ثوانٍ مع التدوير لتضييق الطرف وتنعيمه.يجب إجراء عملية الصقل الناري الأولية داخل غطاء خلية استنبات معقمة. لبدء عملية التشريح، يتم جمع صغار الجرذان حديثي الولادة من العمر P zero إلى P one. يتم مسح صغير الجرذ حديث الولادة بسرعة باستخدام 70%ethanol لتقليل التلوث.بعد عملية قطع الرأس، يتم وضع الرأس على وسادة التشريح بحيث يكون الجانب البطني متجهًا للأعلى والطرف الذيلي موجهًا نحوك. يجب أن تكون القصبة الهوائية المقطوعة مرئية بوضوح. تُستخدم إبر محاقن معقمة لتثبيت الرأس المقطوع على وسادة التشريح بالطريقة التالية.قم بدفع دبوس واحد عبر سقف الفم وصولاً إلى لوحة التشريح، ثم ادفع الدبوس الثاني عبر الحبل الشوكي المقطوع وصولاً إلى اللوحة. بعد نقل لوحة التشريح تحت المجهر والنظر عبر العدسات العينية، استخدم زوجين من الملاقط لإزالة الجلد والدهون المحيطة بالقصبة الهوائية. ومع توخي الحذر لعدم التعمق كثيراً، ستظهر عضلتان تمتدان بشكل متوازٍ تقريباً على كلا جانبي القصبة الهوائية.خلال عملية التشريح، ستحتاج إلى الري باستخدام PBS معقم وبارد أو وسط RPMI 1640 بارد وخالٍ من المصل، يتم تقديمه بواسطة ماصة باستور معقمة لغسل الدم الزائد. يمكن القيام بذلك مرة واحدة أو أكثر من مرة، اعتماداً على سرعة العمل. تُستخدم الملاقط بعد ذلك لقطع وإزالة العضلة من أحد الجانبين أولاً.بمجرد إزالة العضلة، سيصبح الشريان السباتي مرئياً. يمتد هذا الشريان على طول الرغامي ويتفرع إلى ما يشبه شريطاً على شكل حرف Y. يُعد هذا التفرع علامة تشريحية هامة، وبمجرد تحديده، سيكون من السهل نسبياً العثور على العقد العصبية الرقبية العلوية.يتم قطع الشريان عند الطرف الأكثر الطرفي ورفعه قليلاً باستخدام الملقط. ويُبقى الطرف الآخر من الشريان متصلاً. وبمجرد القيام بذلك، سيصبح العقدون الرقبوي العلوي مرئياً.يجب ملاحظة أنها كتلة نسيجية صغيرة لامعة، لوزية الشكل، متصلة بشكل فضفاض بالشريان عند نقطة التفرع، وأنها تحتوي على روابط قبل أو بعد عقدية تشبه الخيوط. يُستخدم زوج ثانٍ من الملاقط لفصل العقدة الرقبية العلوية بلطف ووضعها في طبق زراعة صغير بقطر 35 مليمتر يحتوي على وسط RPMI 1640 بارد وخالٍ من المصل. بعد ذلك، تُستخرج العقدة من الجانب الآخر للقصبة الهوائية باتباع البروتوكول ذاته.بمجرد الانتهاء من تشريح جميع العقد العصبية، يتم تحريرها قدر الإمكان من الأنسجة الزائدة. عند النظر عبر المجهر، يمكن ملاحظة وجود قطع ملتصقة بالعقد العصبية من دهون الشريان السباتي أو أنسجة أخرى، لذا تُستخدم ملقط التشريح لإزالة هذه المواد غير المرغوب فيها. كما يتم قص الروابط العصبية قبل أو بعد العقدية.تحتوي كل عقدة عصبية على حوالي 10,000 عصبون. وبمجرد زراعة العصبونات، ستبدأ استطالاتها العصبية في النمو مجدداً. ثم توضع العقد العصبية في أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين معقم سعة 15 milliliter يحتوي على وسط RPMI 1640.بعد ذلك، يتم إنشاء مستنبت عصبونات الجهاز السمبثاوي. تُطرد العقد مركزياً عند 200 G لمدة دقيقتين ويتم التخلص من الرائق. ثم تُعاد تعليق العقد في 0.5 إلى 1 مل من محلول trypsin بتركيز 0.25%، ثم تُوضع في حمام مائي أو حاضنة عند 37 °C لمدة 30 دقيقة للمساعدة في تفكيك الخلايا الموجودة في العقد.بعد مرور 30 دقيقة، يتم إضافة 10 milliliters من الوسط الغذائي الكامل لغرض تخفيف وتحييد trypsin. ثم تُطرد المحاليل مركزياً عند 200 G لمدة دقيقتين. بعد ذلك، يتم التخلص من الراشح وإعادة تعليق العقد في 2 milliliters من الوسط النهائي.باستخدام إحدى رؤوس الماصات المصقولة بالنار مسبقاً ذات الفتحة الواسعة، يتم تفكيك الخلايا بشكل أكبر عن طريق سحب العقد العصبية صعوداً وهبوطاً 20 مرة. ثم يوضع الأنبوب على الثلج لبضع دقائق. بعد ذلك، يتم صقل الماصة بالنار مرة أخرى لجعل الفتحة أكثر ضيقاً.بعد أن تبرد الماصة، يتم سحق العقد العصبية 20 مرة إضافية. سيزداد تعكر الوسط تدريجياً، مما يشير إلى تفكك الخلايا. تُكرر هذه الخطوة مرة أو مرتين إضافيتين بناءً على مدى كفاءة تفكك الخلايا.بعد مرور بعض الوقت، ستنفصل العقد العصبية إلى عصبونات ولن تظهر أي عقد سليمة في الأنبوب. قد تتبقى بعض المواد النسيجية التي لن تنفصل في هذه المرحلة. يُترك الأنبوب على الثلج لبضع دقائق حتى تترسب أي حطام غير منفصل في القاع.يتم تجميع كل السائل الطافي بعناية باستثناء حوالي 50 µL تقريبًا ووضعه في أنبوب آخر. يُترك 50 µL في قاع الأنبوب لمنع انتقال الحطام غير المرتبط. بعد ذلك، يتم إضافة المزيد من الوسط النهائي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المفككة.يعتمد حجم الوسط النهائي المضاف على نوع طبق الزرع المستخدم لاستنبات العصبونات. على سبيل المثال، في حال استخدام طبق يحتوي على 24 بئراً، يتم وضع عقدة عصبية واحدة في كل بئر في 0.5 milliliters من الوسط النهائي لكل بئر.يتكون بطن الجرذ النموذجي من 12 جرواً، مما يوفر 24 عقدة عصبية. وهذا العدد كافٍ لملء لوحة واحدة تحتوي على 24 بئراً، ويبلغ الحجم الإجمالي للوسط النهائي 12 milliliters. سيؤدي استخدام uridine five FDU في الوسط النهائي إلى منع تكاثر مجموعة صغيرة من الخلايا الدبقية وأنواع الخلايا الأخرى وتحفيز موتها.يتم تغذية الخلايا الموجودة في المزرعة كل 48 ساعة عن طريق استبدال ثلثي الوسط الغذائي بوسط RPMI طازج مضاف إليه 1% horse serum وNGF وuridine وخمس FDU. في البداية، تحتوي المزرعة على عصبونات ودية تظهر بشكل مستدير دون وجود عصبونات.تصبح العصبونات القصيرة مرئية بعد 24 ساعة من عملية التشريح، وتزداد كثافة وتفرعاً تدريجياً بمرور الوقت. لقد شرحنا لكم للتو كيفية عزل وزراعة العصبونات الودية الأولية من العقدون الرقبويتين العلويين لصغار الجرذان. عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر ما يلي: أولاً، تخصيص الوقت والعناية الكافيين لتنظيف العقد العصبية، وإزالة جميع الحطام والأوعية الدموية والدهون.تعتبر هذه الخطوة مهمة لضمان الحصول على مستنبت متجانس إلى حد ما وخالٍ من أنواع الخلايا الغريبة. ثانياً، كن صبوراً أثناء خطوة الفصل وخذ الوقت الكافي لفصل العصبونات بحيث لا تتواجد في تكتلات كبيرة؛ فبمجرد وضعها على الأطباق، ستجعل التكتلات الكبيرة العملية صعبة.في التطبيقات اللاحقة مثل قطع العصبونات أو إصابتها، قد يتم إعاقة الصبغ المناعي أيضاً، كما ستصعب إجراء أي تجارب تتطلب عد العصبونات. وأخيراً، ليس من الضروري تزويد الوسط بـ penicillin streptomycin؛ فإضافة penicillin streptomycin في المرة الأولى التي يتم فيها استزراع الخلايا تكون كافية.أضف uridine five FDU الطازج إلى الوسط في كل مرة يتم فيها استبدال الوسط. لقد استخدم مختبرنا المزارع العصبية الودية لدراسة موت الخلايا المبرمج استجابةً لسحب عامل نمو الأعصاب. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وصفنا على بروتوكول لاستخدام البروتين مخلق العظام-7 (BMP-7) أو Matrigel للحث على انتقائية نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف الابتدائية فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من الفئران قبل الولادة.

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

بروتوكول يصف نظام فعال وقابلة للتكرار نموذج لدراسة فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) الكمون وتنشيط. الفحص توظف متجانسة الثقافات الخلايا العصبية متعاطف، ويسمح للتشريح الجزيئية للفيروس الخلايا العصبية التفاعلات باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات بما في ذلك تدخل الجيش الملكي النيبالي والتعبير من البروتينات المؤتلف.

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

يوضح هذا الفيديو إجراء لعزل الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) من أجنة الفئران ومشاركتها مع سلائف خلايا شوان لتوليد خلايا شوان الناضجة. تتم معالجة DRGs المعزولة لعزل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. يتم زراعة الخلايا المعزولة لتنقية الخلايا العصبية ، والتي يتم استزراعها بعد ذلك مع الخلايا الشبيهة بخلايا شوان (SCLCs) في وسط زراعة مشتركة. يؤدي التفاعل مع الخلايا العصبية DRG إلى نضوج الخلايا العصبية SCLCs في خلايا شوان.

عزل الخلايا العصبية DRG والزراعة المشتركة مع سلائف خلايا شوان لتوليد خلايا شوان

يوضح هذا الفيديو عزل واستزراع خلايا شوان من جذور العمود الفقري للفأر. ثم يتم زراعة الخلايا المعزولة في وسائط معينة. يتم عزل خلايا شوان عن طريق الهضم التفاضلي والالتصاق. يتم نقلها لاحقا إلى أغطية مغلفة بمصفوفة خارج الخلية للربط والانتشار.

عزل خلايا شوان عن جذور العمود الفقري للفأر

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع خلايا العقد الجذرية الظهرية (DRG) من العمود الفقري للفئران. يتم التعامل مع DRGs المستخرجة من العمود الفقري بالإنزيمات وفصلها ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم زراعة الخلايا في وسط يحتوي على مثبطات وعوامل نمو تحد من تكاثر الخلايا الدبقية وتعزز نمو الخلايا العصبية ، على التوالي.

إنشاء ثقافة خلايا العقد الجذرية الجذرية الأولية من العمود الفقري للفئران

نحن هنا وصف خلية شوان (SC) مقايسة الهجرة التي الطوائف المنبوذة هي قادرة على تطوير محاور عصبية على طول تمديد.

تحليل الفئران خلايا شوان التنمية جنبا إلى جنب المحوار النامي

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) المعزولة من الفئران وثقافة الخلايا العصبية DRG على نظام زراعة الخلايا الممتدة مسبقا لتعزيز محاذاة المحاور العصبية ، مع الزراعة المشتركة اللاحقة لخلايا شوان (SCs) لتعزيز تكوين النخاع.

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

كثيرا ما تستخدم الجذر الظهرية ganglia (DRG) الثقافات الأولية لدراسة الوظائف الفسيولوجية أو الأحداث المتعلقة بعلم الأمراض في الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن شرح استخدام الثقافات DRG القطني للكشف عن الإفراج عن العصبية بعد مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي اكتب التحفيز 2 مع مؤثر انتقائية.

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

تصف هذه الورقة عزلة واستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة مع الفئران الجنينية من العقدة العنقية المتفوقة. كما يوفر بروتوكولات مفصلة للتلوين المناعي الكيميائي وإعداد مقتطفات الخلايا العصبية لتحليل الطيف الشامل.

زراعة الجرذ المتعاطفة العصبية من الجنينية الجنينية الجنينية عنق الرحم العصبية لتحليل مورفولوجية وبروتيومية

الـ(غانغليا) الفرخ (CG) هي جزء من الجهاز العصبي اللالامبالي. وقد تبين الثقافات العصبية من الخلايا العصبية CG فرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلية العصبية. نحن نصف بروتوكول مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية CG من الأجنة فرخ.

العزلة والثقافة من الفرخ Ciliary الخلايا العصبية جانجليون

يصف البروتوكول الحالي نموذجا للفأر لاستئصال التعصيب الأدرينالي من خلال تحديد واستئصال العقدة العنقية العلوية.

تقنية جراحية لاستئصال العقدة العنقية الفائقة في نموذج الفئران

تعلم عزل وزراعة الخلايا العصبية التعاطفية الأولية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG) لدراسة علم الأعصاب والبيولوجيا الخلوية. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء مزارع خلوية قابلة للتكرار.

بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG)

استكشف المزيد من الفيديوهات