العزلة وثقافة ما بعد الولادة ماوس مخيخي الخلايا الحبيبية السلف الخلية العصبية والخلايا العصبية

تبدأ هذه الإجراءات بإزالة المخيخ من الفئران في المرحلة العمرية P four إلى P five. يتم إزالة السحايا والضفيرة المشيمية من كل مخيخ على حدة من الفئران حديثة الولادة، ثم تُجمع في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. يتم تفكيك المخيخ باستخدام papain وتحويله إلى معلق من الخلايا المفردة عن طريق الترجيب اللطيف.

يتم ترشيح هذا المعلق بالجاذبية عبر شبكة نايلون بمسام بحجم 70 micron. ثم تُوضع المادة المرتشحة بلطف فوق تدرج perca غير متصل وتُفصل بجهاز الطرد المركزي لعزل الخلايا الحبيبية عن الخلايا الدبقية إلى عصبونات وعصبونات Perkin gene. يتم جمع الخلايا الموجودة في الواجهة البينية للتدرج وتُحضّر على أطباق مطلية بـ poly de lycine.

لمزيد من إزالة الخلايا الدبقية، يتم جمع الخلايا الحبيبية وعدّها وزراعتها بالكثافات المطلوبة على شرائح زجاجية مغطاة بـ poly de lycine أو أطباق زراعة بلاستيكية. مرحباً، أنا هي يونغ لي من مختبر الدكتور لويد جرين في قسم علم الأمراض بجامعة كولومبيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل وزراعة العصبونات الحبيبية المخيخية من الفئران بعد الولادة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تكاثر وتمايز الخلايا العصبية السلفية الحبيبية. لذا، دعونا نبدأ. يبدأ هذا الإجراء باستخدام 70% ethanol في منطقة التشريح لفصل الخلايا الحبيبية في المخيخ، حيث نستخدم نظام Papin dissociation.

عند البدء في استخدام طقم جديد، قم بتحضير محلول مثبط albumin OVO equate MOID. وللقيام بذلك، خذ 32 milliliters من محلول Earl's balanced salt solution أو EBSS، المتوفر في الطقم، وأضفه إلى خليط albumin OVO moid. واتركه جانباً أثناء تحضير المكونات الأخرى للسماح للمحتويات بالذوبان.

بعد ذلك، أضف 5 mL من EBSS إلى إحدى عبوات الباباين من مجموعة الفصل. وتكفي كل عبوة لفصل 4 إلى 15 مخيخة من فئران P5. ثم ضع عبوة الباباين في حضانة تحتوي على 5% CO2 عند درجة حرارة 37 °C لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يذوب الباباين تماماً ويصبح المحلول رائقاً.

يجب الحفاظ على المحلول في درجة حرارة الغرفة أثناء عملية التشريح. بعد ذلك، أضف 500 µL من EBSS إلى قارورة 1D NAS الموجودة في الطقم. اخلط المزيج برفق عن طريق النقر على القارورة.

نظراً لأن الـ DNAS حساس للمسخ الناتج عن قوى القص، أضف 250 µL من هذا المحلول إلى قارورة الـ pepane للحصول على تركيز نهائي قدره 20 units/mL و 0.005% DNA، واحفظ ما تبقى من ملف الـ DNA لاستخدامه في الخطوات اللاحقة. بمجرد تجهيز الأدوات والكواشف، ابدأ بتشريح المخيخ وإزالة السحايا لهذا الإجراء. تُستخدم فئران من سلالة C 57 black six في الفترة ما بين اليوم الرابع والسادس بعد الولادة.

يعتبر هذا النطاق العمري مثالياً لاستزراع الخلايا الحبيبية لأن عدد أسلاف الخلايا الحبيبية في الطبقة الحبيبية الخارجية (EGL) يكون في حده الأقصى؛ للبدء، يتم سحب 15 milliliters من محلول HBSS glucose باستخدام الماصة ووضعها في طبق زراعة أنسجة بلاستيكي بقطر 60 millimeter، و10 milliliters في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 milliliter. يوضع الأنبوب على الثلج، ويُمسح رأس الجرو بـ 70% ethanol، ثم تُستخدم مقصات دقيقة لإزالة الرأس.

انقل الرأس إلى غطاء السحب وثبته باستخدام الملقط بحيث يكون الجزء الخلفي من الجمجمة مرئياً بوضوح. أدخل مقص التشريح الدقيق في الثقبة العظمى للوصول إلى الدماغ، ثم قص مباشرة باتجاه العينين. استخدم ملقط dumont دقيق.

خامساً، استخدم الملقط لتقشير الجلد ورفع الجمجمة لكشف الدماغ. ثم قم بنزع المخيخ والدماغ المتوسط المحيط به. انقلها إلى الطبق الذي يحتوي على HBSS glucose.

لاحظ أنه من الأسهل التعامل مع المخيخ وإزالة السحايا إذا كان المخيخ لا يزال متصلاً بالأنسجة المحيطة. بعد ذلك، ضع النسيج تحت مجهر تشريحي. ثم استخدم مجموعة واحدة من الملاقط لتثبيت المخيخ على اللوحة.

استخدم ملقط Dumont دقيق، رقم خمسة، لإزالة السحايا بلطف عن المخيخ وكذلك من بين الفصوص. ستلاحظ وجود أوعية دموية على سطح المخيخ.

تُعد هذه الأوعية الدموية وسيلة جيدة لتحديد السحايا. استمر في إزالة السحايا حتى يكتسب المخيخ مظهراً أبيضاً متلبداً. بعد ذلك، افصل المخيخ عن بقية الدماغ المتوسط.

اقلب الدماغ على جانبه البطني، وقم بإزالة الضفيرة المشيمية، والتي تبدو كشريط محمر بين المخيخ البطني والدماغ المتوسط المجاور. وبمجرد تشريح المخيخ، ضعه في محلول HBSS glucose بارد في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter على الثلج. بعد تشريح ثلاثة أدمغة، استبدل محلول التشريح بمحلول HBSS glucose جديد.

مع زيادة خبرتك في تشريح المخيخ، حاول تقليل وقت التشريح بحيث لا يتجاوز ست دقائق لكل جرو. عند الانتهاء من عمليات التشريح، انتقل إلى تحضير المعلق الخلوي. خطوة توليد معلق خلوي من عينات تشريح المخيخ.

أولاً، قم بإزالة HBSS glucose من الأنبوب واستبداله بمحلول papain. ورغم أن المجموعة توصي بتقطيع النسيج إلى قطع صغيرة، إلا أننا وجدنا أن ذلك ليس ضرورياً في هذا العمر. ضع النسيج ومحلول papain في حاضنة بتركيز 5%CO 2 ودرجة حرارة 37 degree لمدة تتراوح بين 15 إلى 20 دقيقة.

بالنسبة من أربعة إلى ثمانية مخيخات، يتم التحضين لمدة 15 دقيقة. أما بالنسبة لعدد أكبر، فيتم التحضين لمدة تصل إلى نصف ساعة. قم برج الأنبوب بلطف كل ثلاث إلى أربع دقائق.

بمجرد اكتمال فترة التحضين، ابدأ خطوة التثبيت بطلاء طرف ماصة هباء جوي P 1000 معقمة بـ FBS عن طريق السحب والدفع مرتين. الآن قم بترطيب الخليط. تأكد من استخدام الماصة برفق لمنع تكون أي فقاعات هوائية.

تعتبر حوالي 10 حركات سحب ودفع باستخدام الماصة كافية لتفكيك النسيج. يجب أن يصبح المحلول عكراً. اترك المعلق لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية حتى تترسب أي قطع كبيرة من النسيج غير المفكك في قاع الأنبوب.

على الرغم من إمكانية استخدام الماصات الزجاجية المصقولة بالنار في هذه العملية، إلا أننا وجدنا أن رؤوس الماصات P 1000 المعقمة والمطلية بالمصل تعمل بنفس الكفاءة. بعد ذلك، انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mil جديد باستخدام رأس ماصة مطلي بالمصل، مع الحرص على عدم نقل قطع الأنسجة غير المرتبطة الموجودة في القاع. ثم قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 200 G تقريبًا لمدة خمس دقائق.

قم بتحضير وسط تعليق resus في درجة حرارة الغرفة أثناء عملية الطرد المركزي. وللقيام بذلك، أضف 2.7 milliliters من EBSS في أنبوب معقم. ثم أضف 300 microliters من محلول albumin OVO MOID inhibitor المعاد تشكيله.

أخيراً، أضف 150 µL من محلول DNA. وبمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا فوراً في محلول مثبط ألبومين DNA المخفف. واستخدم مرة أخرى طرف ماصة مغلفاً بالمصل لإعادة تعليق الكتلة.

قم الآن بتحضير تدرج كثافة غير متصل. وللقيام بذلك، أضف 5 mL من محلول albumin oval MOID inhibitor إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. قم بإضافة معلق الخلايا كطبقة فوق المحلول عن طريق إضافة الخلايا برفق على طول جانب الأنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 70 G تقريباً لمدة ست دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، ستترسب الخلايا المفككة في قاع الأنبوب بينما تظل شظايا الغشاء عند السطح الفاصل. إذا كنت ترغب في الحصول على مستنبتات غنية بالخلايا الحبيبية، فلا داعي لمزيد من التنقية. تخلص من الطافي SUP وأعد تعليق الراسب فوراً في أربعة ملليلتر من وسط 10%FBS مع 50 microliters من DNAs.

قم بترشيح هذا المعلق بالجاذبية عبر شبكة نايلون بمسام يبلغ حجمها 70 microns. تهدف هذه الخطوة إلى إزالة الخلايا غير العصبية الكبيرة وتوفير معلق أفضل من الخلايا المفردة. بعد ذلك، تخطَّ خطوة الفصل بالتدرج في الكثافة (percoll gradient separation) وانتقل مباشرة إلى خطوة زراعة الخلايا.

أو إذا كنت ترغب في زيادة تنقية الخلايا الحبيبية من الخلايا الدبقية والعصبونات البينية الكبيرة، فانتقل إلى خطوة التدرج في Percoll. تخلص من supernatant وقم فوراً بإعادة تعليق الراسب في 2 mL من محلول HBSS glucose مع 50 µL من DNAs.

مرة أخرى، قم بترشيح المعلق عبر شبكة نايلون. قبل البدء في عملية الفصل بتدرج perca، قم بتجهيز ماصتين من نوع pasture مصقولتين باللهب. مرر لهبًا برفق على طرف الماصة حتى تصبح الحافة ملساء ويتقلص قطر فتحة الماصة إلى حوالي نصف حجمها الأصلي. كن حذرًا لكي لا تصبح الفتحة صغيرة جدًا.

قم الآن بتحضير تدرج الـ per call. ضع 10 mils من محلول per call بتركيز 35% في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 mil. بعد ذلك، املأ حقنة معقمة سعة 10 mil بـ 10 mils من per call بتركيز 60%، مع تثبيت إبرة نخاع شوكي معقمة بها.

قم بإضافة محلول الـ 60%per call بلطف كطبقة أسفل محلول الـ 35% عن طريق جعل طرف المحقنة يلامس قاع الأنبوب. احرص على الحفاظ على فاصل حاد بين الطبقتين. بعد ذلك، أضف الخلايا إلى الجزء العلوي من التدرج.

باستخدام ماصة مصقولة بالنار، أضف الخلايا برفق على طول جانب الأنبوب دون تعكير الواجهة البينية. بعد ترسيب الخلايا في طبقة، ضع الأنبوب بعناية في جهاز الطرد المركزي. ابدأ عملية الطرد المركزي عند 18 G تقريبًا. قم بزيادة السرعة درجة واحدة كل 20 ثانية بحيث يستغرق الوصول إلى 1800 G حوالي دقيقتين. بعد مرور 10 دقائق عند 1800 G، قلل السرعة تدريجيًا درجة واحدة كل 20 ثانية.

عند اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الواجهة العلوية للتدرج والتخلص منها. تحتوي هذه الواجهة على خلايا ggl bikini كبيرة وعصبونات بينية. بعد ذلك، استخدم ماصة مصقولة بالنار لإزالة الخلايا الموجودة عند الواجهة بعناية.

انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 mil. إذا كان الحجم أكبر من 15 mils، فقم بتقسيمها إلى أنبوبين سعة 50 mil وأعد تعليقها في ثلاثة أحجام من HB S'S glucose واخلطها عن طريق القلب عدة مرات. ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1100 G. الآن قم بإزالة الطافي وأضف أربعة mils من الوسط الذي يحتوي على 10%FBS و 50 microliters من D ns reus.

قم بتعليق الراسب برفق باستخدام ماصة مصقولة بالنار لتكوين معلق خلوي أحادي. بمجرد إعادة تعليق الخلايا، انتقل إلى مرحلة التثبيت المسبق. يتم تثبيت الخلايا المجمعة على طبق مغطى بـ poly de lysine لمدة 20 دقيقة.

في حاضنة عند 37 درجة Celsius و5%CO2. خلال فترة الحضن، ستترسب الخلايا الدبقية النجمية والخلايا الأكبر حجماً وتلتصق بالأطباق، بينما تظل الخلايا العصبية الحبيبية الصغيرة والخلايا السلفية العصبية عائمة أو مرتبطة بشكل فضفاض. بعد مرور 20 دقيقة، انقر برفق على الطبق لإزاحة الخلايا الحبيبية الملتصقة بشكل فضفاض.

ثم يتم نقل معلق الخلايا إلى طبق جديد مطلي بالـ poly de lycine وتكرار عملية التحضين. بعد ذلك، تُجمع العصبونات الحبيبية والخلايا السلفية العصبية في أنبوب مخروطي سعة 15 mil ويتم الطرد المركزي عند 200 G لمدة خمس دقائق. ثم يُعاد تعليق الراسب في 1 mil من الوسط الخالي من C ويتم العد باستخدام hemo cytometer.

أخيراً، أضف وسطاً خالياً من المصل للوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة لزراعتها بكثافة متوسطة. وبالنسبة للأطباق ذات الستة آبار، استخدم ما يقرب من 3.5 إلى 4 مليون خلية للأطباق ذات الأربعة آبار.

استخدم 650,000 خلية. يتم الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مع 5%CO2. يتم تغيير الوسط الغذائي بالكامل بعد 24 ساعة من الزرع الأولي، ثم كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك.

إليك بعض الصور لمزارع خلايا عصبية حبيبية وخلايا سلفية سليمة. بعد 24 ساعة من الاستزراع وبعد ستة أيام من الاستزراع. يمكن الحفاظ على هذه الخلايا في المزرعة لمدة تصل إلى أسبوعين.

لاحظ أنه في غضون 24 ساعة بعد الزرع، ستنتشر الخلايا السليمة بشكل متساوٍ حول الشرائح الغطائية أو البئر البلاستيكي وستقوم بمد استطالات. ويشير تكتل الخلايا ووجود توسعات في الاستطالات الخلوية إلى أن الخلايا غير سليمة أو أن ركيزة poly de lycine سامة. وكما هو موضح في المخطط، تبدأ الخلايا السلفية للعصبونات الحبيبية في التمايز عند الزرع وتعبر عن الواسمات.

تمثيل لتمايزها. تجدر الإشارة إلى أن تكاثر سلائف العصبونات الحبيبية يمكن إطالته بشكل كبير عن طريق إضافة sonic hedgehog إلى الوسط. كما يمكن إضافة Laminin كركيزة بالإضافة إلى polylysine لتعزيز نمو الاستطالات العصبية.

توفر هذه الميزات لاستزراع الخلايا الحبيبية نظاماً لدراسة إما بيولوجيا العصبونات الحبيبية أو تنظيم تمايز الخلايا السلفية إلى عصبونات. لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل واستزراع الخلايا السلفية والعصبونات الحبيبية في مخيخ MAO. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الحصيلة التقريبية هي 4 2 5 times 10th.

يمكن أن يتراوح عدد الخلايا لكل جرو وكثافات الزرع بين خمسة أضعاف من خمس خلايا لكل سنتيمتر مربع. لذا، إذا تم تجاوز خطوة تدرج Percoll، فإن ثمانية جراء فئران في اليوم الخامس بعد الولادة يمكن أن توفر خلايا كافية لستة أطباق زراعة من نوع four-well في تجربتي، إلا أن استخدام خطوة تدرج Percoll سيقلل من محصول الخلايا بنسبة 22-30%. ومع ذلك، تزداد نسبة العصبونات الحبيبية في المزارع من 90% إلى 95% ثم إلى 99%. وقد استُخدمت الخلايا الحبيبية المخصبة التي تم الحصول عليها بدون خطوة فصل تدرج Percoll لدراسة تنظيم تكاثر وتمايز الخلايا السلفية للعصبونات الحبيبية. ومع ذلك، إذا كان سيتم استخدام المزارع لأكثر من عدة أيام في المختبر (in vitro)، فإن تضمين خطوة تدرج Percoll يُعد موصى به من أجل تقليل تلوث العصبونات الحبيبية بالخلايا غير العصبية المتكاثرة.

علاوة على ذلك، تأكد من أن المحاليل المستخدمة لإعداد تدرج per cot حديثة، حيث أن التخزين المؤقت غير السليم يؤدي إلى زيادة موت الخلايا. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.