fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

New England BioLabs

&#x6297;&#x539F;&#x80BD;&#x8026;&#x5408;&#x5230;&#x7A33;&#x56FA;&#x7684;&#x652F;&#x6301;&#x662F;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x591A;&#x80BD;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5173;&#x952E;&#x6B65;&#x9AA4;&#x3002;&#x751F;&#x6210;&#x65E0;&#x529F;&#x743C;&#x8102;&#x7CD6;&#x3001; &#x7EA4;&#x7EF4;&#x7D20;&#x6216;&#x5176;&#x4ED6;&#x7684;&#x80BD;&#x5171;&#x8F6D;&#x77E9;&#x9635;&#x7684;&#x5E38;&#x89C4;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x8D39;&#x529B;&#xFF0C;&#x5E76;&#x53EF;&#x80FD;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x5316;&#x5B66;&#x5E9F;&#x7269;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x4EA4;&#x7684;&#x80BD;&#x4EB2;&#x548C;&#x67F1;&#x7B80;&#x6613;&#x751F;&#x4EA7;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7531;&#x96C7;&#x7528;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E; (IPL) &#x4E00;&#x8D77;&#x4E0E;&#x7532;&#x58F3;&#x7D20;&#x4EB2;&#x548C;&#x5C42;&#x6790;&#x3002;&#x6D3B;&#x6027;&#x786B;&#x916F;&#x7684;&#x7532;&#x58F3;&#x7D20;&#x7ED3;&#x5408;&#x57DF; &#xFF08;CBD&#xFF09; &#x4ECE;&#x51E0;&#x4E01;&#x8D28;&#x9176;&#x82BD;&#x5B62;&#x6746;&#x83CC; A1 &#x7684;&#x73AF;&#x72B6; WL 2 C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x7531;&#x5DEF;&#x57FA;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x88C2;&#x89E3;&#x751F;&#x7269;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x516C;&#x7EA6; &#x300B; &#x4E0E;&#x4FEE;&#x6539;&#x540E;&#x7684;&#x5185;&#x542B;&#x80BD;&#x952E;&#x7684;&#x751F;&#x6210;&#x3002;N-&#x672B;&#x7AEF;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x88AB;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x7532;&#x58F3;&#x7D20;&#x591A;&#x80BD;&#x6297;&#x539F;&#x51B3;&#x5B9A;&#x7C07;&#x85CF;&#x6709;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6807;&#x8BB0;&#x751F;&#x7269;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x516C;&#x7EA6; &#x300B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x80BD;&#x5217;&#x5141;&#x8BB8;&#x4ECE;&#x52A8;&#x7269;&#x8840;&#x6E05;&#x7684;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x5F3A;&#x3001; &#x6548;&#x7387;&#x9AD8;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x6297;&#x4F53;&#x3002;

&#x4EB2;&#x548C;&#x67F1;&#x7684;&#x7ED3;&#x624E;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x6297;&#x4F53;&#x7EAF;&#x5316;&#x7684;&#x4E00;&#x4EE3;&#x3002;

Coupling an antigenic peptide to a solid support is a crucial step in the affinity purification of a peptide-specific antibody. Conventional methods for generating reactive agarose, cellulose or other matrices for peptide conjugation are laborious and can result in a significant amount of chemical waste. In this report, we present a novel method for the facile production of a peptide affinity column by employing intein-mediated protein ligation (IPL) in conjunction with chitin affinity chromatography. A reactive thioester was generated at the C-terminal of the chitin binding domain (CBD) from the chitinase A1 of Bacillus circulans WL-2 by thiol-induced cleavage of the peptide bond between the CBD and a modified intein. Peptide epitopes possessing an N-terminal cysteine were ligated to the chitin bound CBD tag. We demonstrate that the resulting peptide columns permit the highly specific and efficient affinity purification of antibodies from animal sera.

Generation of an affinity column for antibody purification by intein-mediated protein ligation.

Le couplage d&#x26;#39;un peptide antig&#xE9;nique &#xE0; un support solide est une &#xE9;tape cruciale dans la purification par affinit&#xE9; d&#x26;#39;un anticorps sp&#xE9;cifiques du peptide. Les m&#xE9;thodes conventionnelles pour la production r&#xE9;active agarose, de cellulose ou d&#x26;#39;autres matrices pour la conjugaison peptide sont laborieuses et peut entra&#xEE;ner une quantit&#xE9; importante de d&#xE9;chets chimiques. Dans ce rapport, nous pr&#xE9;sentons une nouvelle m&#xE9;thode pour la production facile de une colonne d&#x26;#39;affinit&#xE9; de peptide en employant la ligature des prot&#xE9;ines int&#xE9;ine m&#xE9;diation (IPL) en conjonction avec la chitine chromatographie d&#x26;#39;affinit&#xE9;. Un thioester r&#xE9;active a &#xE9;t&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; C-terminale du domaine de liaison chitine (CDB) de l&#x26;#39;A1 chitinase de Bacillus circulans WL-2 par un groupe thiol induite clivage de la liaison peptidique entre le CDB et une int&#xE9;ine modification. &#xC9;pitopes peptidiques poss&#xE9;dant une cyst&#xE9;ine N-terminale ont &#xE9;t&#xE9; ligatur&#xE9;s &#xE0; la chitine li&#xE9; tag CDB. Nous d&#xE9;montrons que les colonnes peptidiques r&#xE9;sultant de permettre la purification par affinit&#xE9; tr&#xE8;s sp&#xE9;cifique et efficace d&#x26;#39;anticorps &#xE0; partir de s&#xE9;rums animaux.

G&#xE9;n&#xE9;ration d&#x26;#39;une colonne d&#x26;#39;affinit&#xE9; pour la purification des anticorps par la ligature des prot&#xE9;ines int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation

Erzeugung einer Affinit&#xE4;tss&#xE4;ule f&#xFC;r Antik&#xF6;rper Reinigung durch Intein-vermittelten Protein-Verkn&#xFC;pfung.

Un peptide antigenico di accoppiamento ad un supporto solido &egrave; un passo fondamentale per la purificazione di affinit&agrave; di un anticorpo specifico peptide. I metodi convenzionali per la generazione dell&#39;agarosi reattiva, cellulosa o altre matrici per coniugazione del peptide sono laboriosi e possono comportare una notevole quantit&agrave; di rifiuti chimici. In questa relazione, vi presentiamo un nuovo metodo per la produzione di una colonna di affinit&agrave; del peptide facile impiegando legatura proteina intein-mediata (IPL) in concomitanza con la cromatografia di affinit&agrave; chitina. Un tioestere reattiva &egrave; stata generata al C-terminale del dominio di legame di chitina (CBD) dalla chitinasi A1 di Bacillus circulans WL-2 da tiolo-indotta di scissione del legame peptidico tra CBD e un intein modificato. Peptide epitopi che possiedono una cisteina del N-terminale sono stati legati alla chitina associato tag CBD. Dimostriamo che le colonne del peptide risultante permettono la purificazione di affinit&agrave; altamente specifico ed efficiente degli anticorpi da sieri animali.

Generazione di una colonna di affinit&agrave; per la purificazione dell&#39;anticorpo da legatura proteina intein-mediata.

&#x56FA;&#x4F53;&#x652F;&#x6301;&#x4F53;&#x306B;&#x6297;&#x539F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3001;&#x30A2;&#x30AC;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B9;&#x3001;&#x30BB;&#x30EB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B9;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x884C;&#x5217;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x306F;&#x9762;&#x5012;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x5316;&#x5B66;&#x5EC3;&#x68C4;&#x7269;&#x306E;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x91CF;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7A3F;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x3068;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3066;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30E0;&#x306E;&#x5BB9;&#x6613;&#x306A;&#x88FD;&#x9020;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x53CD;&#x5FDC;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;CBD&#x3068;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x30C1;&#x30AA;&#x30FC;&#x30EB;&#x8A98;&#x8D77;&#x958B;&#x88C2;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30D0;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B9;&#xB7;&#x30B5;&#x30FC;&#x30AD;&#x30E5;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;WL-2&#x306E;&#x30AD;&#x30C1;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;A1&#x304B;&#x3089;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF08;CBD&#xFF09;&#x306E;C&#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; N&#x672B;&#x7AEF;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;CBD&#x30BF;&#x30B0;&#x3092;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x200B;&#x200B;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x306B;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5217;&#x306F;&#x3001;&#x52D5;&#x7269;&#x306E;&#x8840;&#x6E05;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x3001;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x7CBE;&#x88FD;&#x7528;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30E0;&#x306E;&#x751F;&#x6210;

&#xACE0;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xC751;&#xC131; agarose, &#xC140; &#xB8F0; &#xB85C;&#xC2A4; &#xB610;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD65C;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95; &#xD798; &#xB4DC;&#xB294; &#xC774;&#xBA70; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xD654;&#xD559; &#xD3D0;&#xAE30;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xBB3C;&#xC774; &#xC190;&#xC26C;&#xC6B4; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC5F4; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xACB0; &#xCC30; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (IPL)&#xC744; &#xCC44;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD568;&#xAED8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD2F4; &#xCE5C;&#xD654;&#xC131; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C;&#xC640;. &#xBC18;&#xC751; thioester chitinase &#xADE0; A1 circulans WL-2&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD2F4; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (CBD)&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3C4;&#xC2EC; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; intein &#xC0AC;&#xC774; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569;&#xC758; thiol &#xC720;&#xB3C4; &#xBD84;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3C4;&#xC2EC; &#xD0DC;&#xADF8;&#xAC00; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; epitopes &#xC18C;&#xC9C0;&#xB294; &#xD2F4;&#xC5D0; N &#xB9E8;&#xB05D; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xCD9C;&#xD608; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC2DC;&#xC5F0; &#xACB0;&#xACFC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC5F4; &#xB3D9;&#xBB3C; &#xC138;&#xB77C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xB97C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; &#xD558; &#xC5EC; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC815;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC5F4; &#xC0DD;&#xC131;.

Acoplamiento un p&#xE9;ptido antig&#xE9;nico a un soporte s&#xF3;lido es un paso esencial en la purificaci&#xF3;n por afinidad de un anticuerpo p&#xE9;ptido espec&#xED;fico. Los m&#xE9;todos convencionales para la generaci&#xF3;n de reactiva agarosa, celulosa u otras matrices para la conjugaci&#xF3;n del p&#xE9;ptido son laboriosos y puede resultar en una cantidad significativa de residuos qu&#xED;micos. En este informe, presentamos un nuevo m&#xE9;todo para la producci&#xF3;n f&#xE1;cil de una columna de afinidad p&#xE9;ptido mediante el empleo de intein mediada por la ligadura de las prote&#xED;nas (IPL) en conjunto con la quitina cromatograf&#xED;a de afinidad. Un tio&#xE9;ster reactiva se ha generado en el C-terminal del dominio de uni&#xF3;n quitina (CDB) de la A1 quitinasa de Bacillus circulans WL-2 por tiol inducida por la escisi&#xF3;n del enlace pept&#xED;dico entre el CBD y un intein modificado. Ep&#xED;topos pept&#xED;dicos que poseen una ciste&#xED;na N-terminal se ligaron a la quitina obligado etiqueta CDB. Se demuestra que las columnas de p&#xE9;ptidos resultantes permiten la purificaci&#xF3;n de afinidad altamente espec&#xED;fica y eficaz de anticuerpos a partir de sueros de los animales.

Generaci&#xF3;n de una columna de afinidad para la purificaci&#xF3;n de anticuerpos mediante ligadura de prote&#xED;nas mediada por intein

&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5BF9;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x7528;&#x4E8E;&#x6FC0;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x53CA;&#x968F;&#x540E;&#x7684;&#x5370;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x5E94;&#x7528;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x5185;&#x542B;&#x80BD;&#x7ED3;&#x624E; (IPL)&#x3002;IPL &#x5141;&#x8BB8;&#x9AD8;&#x6548;&#x5408;&#x6210;&#x80BD;&#x4E0E; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x542B;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x65E0;&#x529F; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x786B;&#x916F;&#x901A;&#x8FC7;&#x672C;&#x673A;&#x7684;&#x80BD;&#x952E;&#x751F;&#x6210;&#x5185;&#x542B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x5BF9;&#x7ED3;&#x624E;&#x3002;&#x6B64;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x660E;&#x663E;&#x4F18;&#x52BF;&#x662F;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x627F;&#x8FD0;&#x4EBA;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5206;&#x5B50; ligates &#x53EA;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x80BD;&#xFF0C;&#x786E;&#x4FDD;&#x7ED3;&#x624E;&#x4EA7;&#x54C1;&#x4E0A;&#x94A0;&#x5341;&#x4E8C;&#x70F7;&#x57FA;&#x786B;&#x9178;&#x76D0;&#x805A;&#x4E19;&#x70EF;&#x9170;&#x80FA;&#x51DD;&#x80F6;&#x7535;&#x6CF3; (SDS) &#x5F62;&#x6210;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9C9C;&#x660E;&#x7684;&#x4E50;&#x961F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x7531;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x6E90;&#x81EA;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5468;&#x671F;&#x86CB;&#x767D;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x6FC0;&#x9176;&#x3001; Cdc2&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x542B;&#x4EBA;&#x7C7B; c Src &#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7F51;&#x7AD9;&#x7A81;&#x53D8;&#x5206;&#x6790;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#x6027;&#x3002;

&#x5370;&#x8FF9;&#x4F7F;&#x7528;&#x7ED3;&#x624E;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x7684; Src &#x6FC0;&#x9176;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

We have applied intein-mediated peptide ligation (IPL) to the use of peptide substrates for kinase assays and subsequent Western blot analysis. IPL allows for the efficient ligation of a synthetic peptide with an N-terminal cysteine residue to an intein-generated carrier protein containing a cysteine reactive C-terminal thioester through a native peptide bond. A distinct advantage of this procedure is that each carrier protein molecule ligates only one peptide, ensuring that the ligation product forms a sharp band on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). We demonstrate the effectiveness of this approach by mutational analysis of peptide substrates derived from human cyclin-dependent kinase, Cdc2, which contains a phosphorylation site of human c-Src protein tyrosine kinase.

Western blot analysis of Src kinase assays using peptide substrates ligated to a carrier protein.

Nous avons appliqu&#xE9; une ligature peptide int&#xE9;ine m&#xE9;diation (IPL) &#xE0; l&#x26;#39;utilisation de substrats peptidiques pour des essais de kinase et apr&#xE8;s analyse par Western blot. IPL permet la ligature efficace d&#x26;#39;un peptide synth&#xE9;tique ayant un r&#xE9;sidu cyst&#xE9;ine N-terminale &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;e par int&#xE9;ine contenant une cyst&#xE9;ine C-terminale r&#xE9;active thioester par une liaison peptidique natif. Un net avantage de cette proc&#xE9;dure est que chaque mol&#xE9;cule de prot&#xE9;ine porteuse ligature un seul peptide, veiller &#xE0; ce que le produit de ligation forme une bande nette sur sulfate de sodium &#xE9;lectrophor&#xE8;se sur gel polyacrylamide avec dod&#xE9;cyl (SDS-PAGE). Nous d&#xE9;montrons l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de cette approche par l&#x26;#39;analyse mutationnelle de substrats peptidiques d&#xE9;riv&#xE9;es de l&#x26;#39;homme kinases cycline-d&#xE9;pendantes, Cdc2, qui contient un site de phosphorylation de la prot&#xE9;ine kinase c-Src humaine tyrosine.

Analyse par Western Blot des essais de kinase Src en utilisant des substrats peptidiques ligatur&#xE9; &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse

Western-Blot-Analyse der Src-Kinase-Assays unter Verwendung von Peptid Substrate gebunden an ein Tr&#xE4;gerprotein.

Abbiamo applicato legatura del peptide intein-mediata (IPL) per l&#39;utilizzo di substrati peptidici per dosaggi chinasi e analisi Western blot successivi. IPL consente la legatura efficiente di un peptide sintetico con un residuo di cisteina del N-terminale di una proteina dell&#39;elemento portante intein generato contenente un tioestere C-terminale reattivo cisteina attraverso un legame peptidico nativo. Un ulteriore vantaggio di questa procedura &egrave; che ogni molecola di proteina carrier ligates solo un peptide, assicurando che il prodotto di legatura forma una band forte su sodio dodecil solfato poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE). Noi di dimostrare l&#39;efficacia di questo approccio di analisi mutazionale di substrati peptidici derivati da umana chinasi ciclina-dipendenti, Cdc2, che contiene un sito di fosforilazione della chinasi della tirosina di proteine umane c-Src.

Western blot analisi dei dosaggi di chinasi Src utilizzando substrati del peptide legati ad una proteina carrier.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;&#x30A6;&#x30A8;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x5A92;&#x4ECB;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; IPL&#x306F;&#x3001;&#x5929;&#x7136;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;C&#x672B;&#x7AEF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; - &#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;N&#x672B;&#x7AEF;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x306E;&#x660E;&#x78BA;&#x306A;&#x5229;&#x70B9;&#x306F;&#x3001;&#x5404;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7523;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30C7;&#x30B7;&#x30EB;&#x786B;&#x9178;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30DD;&#x30EA;&#x30A2;&#x30AF;&#x30EA;&#x30EB;&#x30A2;&#x30DF;&#x30C9;&#x30B2;&#x30EB;&#x96FB;&#x6C17;&#x6CF3;&#x52D5;&#xFF08;SDS-PAGE&#xFF09;&#x306E;&#x92ED;&#x3044;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x78BA;&#x5B9F;&#x306B;&#x3001;1&#x3064;&#x3060;&#x3051;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x9023;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;c-Src&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;CDC2&#x7531;&#x6765;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x89E3;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x6709;&#x52B9;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3002;

&#x62C5;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x9023;&#x7D50;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;Src&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2C8; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBC0F; &#xD6C4;&#xC18D; &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xACB0; &#xCC30; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; (IPL)&#xC744; &#xC801;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. IPL &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xBC18;&#xC751; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; thioester intein &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; N-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xACFC; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xACB0; &#xCC30; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC808;&#xCC28;&#xC758; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; &#xC7A5;&#xC810;&#xC740; &#xAC01; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBD84;&#xC790; &#xACB0; &#xCC30; &#xC81C;&#xD488; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968; &#xB77C;&#xC6B0;&#xB9B4; &#xD669;&#xC0B0; polyacrylamide &#xC824; &#xC804;&#xAE30; &#xC774;&#xB3D9; &#xBC95; (SDS &#xD398;&#xC774;&#xC9C0;)&#xC5D0; &#xC608; &#xB9AC; &#xBC34;&#xB4DC;&#xB97C; &#xD615;&#xC131; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; ligates. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xF06C; &#xC885;&#xC18D; &#xD0A4;, &#xC778;&#xAC04;&#xC758; c Src &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD3EC;&#xD568; cdc2&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; mutational &#xBD84;&#xC11D; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC11C;&#xC591; &#xC5BC;&#xB8E9; &#xCD9C;&#xD608; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; Src &#xB2C8; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;.

Hemos aplicado intein mediada por ligaci&#xF3;n p&#xE9;ptido (IPL) para el uso de sustratos pept&#xED;dicos para los ensayos de quinasa y su posterior an&#xE1;lisis Western blot. IPL permite la ligadura eficaz de un p&#xE9;ptido sint&#xE9;tico con un residuo de ciste&#xED;na N-terminal de una prote&#xED;na portadora intein generado contiene una ciste&#xED;na reactivo C-terminal de tio&#xE9;ster trav&#xE9;s de un enlace p&#xE9;ptido nativo. Una ventaja de este procedimiento es que cada mol&#xE9;cula de prote&#xED;na portadora productos ligados s&#xF3;lo un p&#xE9;ptido, asegurando que el producto de ligaci&#xF3;n se forma una banda fuerte en la electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE). Se demuestra la eficacia de este enfoque mediante el an&#xE1;lisis mutacional de los sustratos de p&#xE9;ptidos derivados de humanos quinasas dependientes de ciclina, Cdc2, que contiene un sitio de fosforilaci&#xF3;n de la prote&#xED;na humana c-Src tirosina.

An&#xE1;lisis de Western Blot de los ensayos de quinasa Src utilizando sustratos pept&#xED;dicos ligado a una prote&#xED;na transportadora

&#x591A;&#x80BD;&#x9635;&#x5217;&#x8D8A;&#x6765;&#x8D8A;&#x591A;&#x5730;&#x7528;&#x4E8E;&#x5B9A;&#x4E49;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176;&#x6297;&#x4F53;&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x548C;&#x57FA;&#x677F;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x88AB;&#x53D7;&#x5230;&#x65E0;&#x6548;&#x548C;&#x53D8;&#x91CF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#xFF0C;&#x5F80;&#x5F80;&#x9020;&#x6210;&#x4F4E;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x514B;&#x670D;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9650;&#x5236;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x8BA2;&#x4E86;&#x7ED3;&#x624E;&#x5185;&#x542B;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x540E;&#x5404;&#x79CD;&#x819C;&#x4F7F;&#x9635;&#x5217;&#x5408;&#x6210;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FDB;&#x884C;&#x7B5B;&#x67E5;&#x6700;&#x4F73;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5E94;&#x6027;&#x548C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4F7F;&#x7528;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x70C3;&#x57FA;&#x6C27;&#x5316;&#x8367;&#x5149;&#x7D20;&#xFF0C;CDPEK (&#x8367;&#x5149;&#x7D20;) DS &#x5728;&#x624B;&#x6027;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x8BC4;&#x4F30;&#x3002;&#x5408;&#x6210;&#x80BD;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;&#x5BF9;&#x7532;&#x57FA;&#x7ED3;&#x624E;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6539;&#x8FDB;&#x7684;&#x4FDD;&#x7559;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x548C;&#x8FBE; 10 4 &#x6298;&#x514D;&#x75AB;&#x548C;&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x626B;&#x63CF;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#x53D8;&#x5F97;&#x66F4;&#x52A0;&#x7684;&#x654F;&#x611F;&#x3002;&#x53D8;&#x6027;&#x524D;&#x6392;&#x5217;&#x6709;&#x673A;&#x6EB6;&#x5242; (20%&#x7532;&#x9187;&#xFF09; &#x6216; 2%&#x5341;&#x4E8C;&#x70F7;&#x57FA;&#x786B;&#x9178;&#x94A0; (SDS) &#x7ED3;&#x624E;&#x4EA7;&#x54C1;&#x5E76;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x660E;&#x663E;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;&#x5BF9;&#x7532;&#x57FA;&#x591A;&#x80BD;&#x4EA7;&#x54C1;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x5360;&#x4E3B;&#x5BFC;&#x5730;&#x4F4D;&#x7684;&#x7ED3;&#x624E;&#x4EA7;&#x54C1;&#x7ED1;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x5305;&#x542B;&#x4E00;&#x4E2A;&#x80BD;&#x65E0;&#x529F;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x9635;&#x5217;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x4E0A;&#x7684;&#x80BD;&#x7684;&#x91CF;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x8FDB;&#x884C;&#x89C4;&#x8303;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6280;&#x672F;&#x88AB;&#x5229;&#x7528;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x626B;&#x63CF;&#x7684;&#x8840;&#x51DD;&#x7D20; (HA) &#x6297;&#x539F;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E24;&#x79CD;&#x5355;&#x514B;&#x9686;&#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x533A;&#x5206;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x4E2D;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x8BC6;&#x522B;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5141;&#x8BB8;&#x5408;&#x6210;&#x591A;&#x80BD;&#x5747;&#x5300;&#x6392;&#x5217;&#x4E0A;&#x819C;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5404;&#x79CD;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x517C;&#x5BB9;&#x3002;

&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E;&#x6CD5;&#x751F;&#x4EA7;&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x9635;&#x5217;&#x3002;

Peptide arrays are increasingly used to define antibody epitopes and substrate specificities of protein kinases. Their use is hampered, however, by ineffective and variable binding efficiency of peptides, which often results in low sensitivity and inconsistent results. To overcome these limitations, we have developed a novel method for making arrays of synthetic peptides on various membranes after ligating the peptide substrates to an intein-generated carrier protein. We have conducted screening for optimal carrier proteins by immunoreactivity and direct assessment of binding using a peptide derivatized at a lysine sidechain with fluorescein, CDPEK(fluorescein)DS. Ligation of a synthetic peptide antigen to a carrier protein, HhaI methylase, resulted in an improved retention of peptides and an increased sensitivity of up to 10(4)-fold in immunoassay- and epitope-scanning experiments. Denaturing the ligation products with 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) or an organic solvent (20% methanol) prior to arraying did not significantly affect the immunoreactivity of the HhaI methylase-peptide product. Because the carrier protein dominates the binding of ligation products and contains one peptide reactive site, the amount of peptide arrayed onto the membranes can be effectively normalized. This technique was utilized in the alanine scanning of hemagglutinin (HA) antigen using two monoclonal antibodies, resulting in distinguishing the different antigen epitope profiles. Furthermore, we show that this method can be used to characterize the antibodies that recognize phosphorylated peptides. This novel approach allows for synthetic peptides to be uniformly arrayed onto membranes, compatible with a variety of applications.

Producing peptide arrays for epitope mapping by intein-mediated protein ligation.

Tableaux peptidiques sont de plus en plus utilis&#xE9; pour d&#xE9;finir des &#xE9;pitopes d&#x26;#39;anticorps et des sp&#xE9;cificit&#xE9;s de substrat de prot&#xE9;ines kinases. Leur utilisation est entrav&#xE9;e, cependant, par l&#x26;#39;efficacit&#xE9; contraignante inefficace et variable de peptides, qui se traduit souvent par une faible sensibilit&#xE9; et des r&#xE9;sultats incoh&#xE9;rents. Pour surmonter ces limitations, nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une nouvelle m&#xE9;thode pour la fabrication de tableaux de peptides synth&#xE9;tiques sur les diff&#xE9;rentes membranes apr&#xE8;s la ligature des substrats peptidiques &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse int&#xE9;ine g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;. Nous avons effectu&#xE9; un d&#xE9;pistage pour les prot&#xE9;ines porteuses optimales par immunor&#xE9;activit&#xE9; et &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;valuation directe de la liaison en utilisant un peptide d&#xE9;riv&#xE9; de la lysine &#xE0; une cha&#xEE;ne lat&#xE9;rale &#xE0; la fluoresc&#xE9;ine, CDPEK (fluoresc&#xE9;ine) DS. Ligature d&#x26;#39;un antig&#xE8;ne peptidique synth&#xE9;tique &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse, HhaI m&#xE9;thylase, entra&#xEE;n&#xE9; dans une r&#xE9;tention am&#xE9;lior&#xE9;e de peptides et une sensibilit&#xE9; accrue allant jusqu&#x26;#39;&#xE0; 10 (4) fois dans immunodosage-et-&#xE9;pitope de balayage exp&#xE9;riences. La d&#xE9;naturation des produits de ligature avec du sulfate de sodium et de dod&#xE9;cyle 2% (SDS) ou un solvant organique (20% de m&#xE9;thanol) avant arraying n&#x26;#39;a pas affect&#xE9; significativement l&#x26;#39;immunor&#xE9;activit&#xE9; de la Hhal m&#xE9;thylase-peptide produit. Car la prot&#xE9;ine porteuse domine la liaison de produits de ligature et contient un seul site r&#xE9;actif peptidique, la quantit&#xE9; de peptide dispos&#xE9;s sur les membranes peuvent &#xEA;tre efficace normalis&#xE9;e. Cette technique a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;e dans le balayage d&#x26;#39;alanine de l&#x26;#39;h&#xE9;magglutinine (HA) d&#x26;#39;antig&#xE8;ne en utilisant deux anticorps monoclonaux, r&#xE9;sultant en distinguant les diff&#xE9;rents profils &#xE9;pitope de l&#x26;#39;antig&#xE8;ne. En outre, nous montrons que cette m&#xE9;thode peut &#xEA;tre utilis&#xE9;e pour caract&#xE9;riser les anticorps qui reconnaissent des peptides phosphoryl&#xE9;s. Cette nouvelle approche permet de peptides synth&#xE9;tiques pour &#xEA;tre uniform&#xE9;ment dispos&#xE9;s sur des membranes, compatibles avec une vari&#xE9;t&#xE9; d&#x26;#39;applications.

Produire les tableaux de peptides pour la cartographie des &#xE9;pitopes des prot&#xE9;ines par ligature int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation

Peptid-Arrays f&#xFC;r Epitop-Mapping durch inteinvermittelte Protein Ligation.

Matrici del peptide sono sempre pi&ugrave; utilizzati per definire la specificit&agrave; di epitopi e substrato anticorpo della chinasi di proteina. Loro uso &egrave; ostacolata, tuttavia, di efficienza inefficace e variabile associazione di peptidi, che spesso si traduce in risultati incoerenti e bassa sensibilit&agrave;. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per fare matrici di peptidi sintetici su varie membrane dopo legare i substrati peptidici di una proteina carrier intein generato. Abbiamo effettuato lo screening per le proteine carrier ottimale di immunoreattivit&agrave; e valutazione diretta dell&#39;associazione utilizzando un peptide derivatizzato a una lisina sidechain con fluoresceina, CDPEK (fluoresceina) DS. Legatura di un antigene peptidico sintetico di una proteina carrier, HhaI metilasi, ha provocato una migliore ritenzione di peptidi e una maggiore sensibilit&agrave; di fino a 4-piegare in esperimenti di scansione immunoassay ed epitopo. Denaturazione dei prodotti di legatura con 2% sodio dodecil solfato (SDS) o un solvente organico (20% metanolo) prima di arraying non ha influito l&#39;immunoreattivit&agrave; del prodotto metilasi-peptide HhaI significativamente. Perch&eacute; la proteina carrier domina l&#39;associazione dei prodotti di legatura e contiene un sito reattivo del peptide, la quantit&agrave; di peptide schierato su membrane pu&ograve; essere efficacemente normalizzata. Questa tecnica &egrave; stata utilizzata l&#39;alanina scansione dell&#39;antigene emoagglutinina (HA) utilizza due anticorpi monoclonali, risultanti nel distinguere i profili di epitopo dell&#39;antigene diverso. Inoltre, ci mostrano che questo metodo pu&ograve; essere utilizzato per caratterizzare gli anticorpi che riconoscono peptidi fosforilati. Questo nuovo approccio permette di peptidi sintetici a essere uniformemente disposti sulle membrane, compatibile con una variet&agrave; di applicazioni.

Producendo matrici del peptide per epitope mapping di legatura di proteina intein-mediata.

&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;&#x306F;&#x307E;&#x3059;&#x307E;&#x3059;&#x6297;&#x4F53;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x3068;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306F;&#x3057;&#x3070;&#x3057;&#x3070;&#x4F4E;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x77DB;&#x76FE;&#x3059;&#x308B;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3059;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3068;&#x5909;&#x6570;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x52B9;&#x7387;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x59A8;&#x3052;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; - &#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x62C5;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x5F8C;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x819C;&#x4E0A;&#x306B;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x4F5C;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30EC;&#x30BB;&#x30A4;&#x30F3;&#x3001;CDPEK&#xFF08;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30EC;&#x30BB;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF09;DS&#x3068;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x5074;&#x9396;&#x3067;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4F53;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x76F4;&#x63A5;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;HhaI&#x30E1;&#x30C1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3078;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x4FDD;&#x6301;&#x3001;10&#xFF08;4&#xFF09;&#x500D;&#x514D;&#x75AB;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x6CD5;&#x3068;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x6700;&#x5927;&#x306E;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x5411;&#x4E0A;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x524D;&#x306B;&#x914D;&#x5217;&#x3057;&#x3001;2&#xFF05;&#x30C9;&#x30C7;&#x30B7;&#x30EB;&#x786B;&#x9178;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#xFF08;SDS&#xFF09;&#x3084;&#x6709;&#x6A5F;&#x6EB6;&#x5A92;&#xFF08;20&#xFF05;&#x30E1;&#x30BF;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF09;&#x3067;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7523;&#x7269;&#x3092;&#x5909;&#x6027;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;HhaI&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x751F;&#x6210;&#x7269;&#x306E;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3055;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x62C5;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x652F;&#x914D;&#x3059;&#x308B;&#x3068;1&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x53CD;&#x5FDC;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3001;&#x819C;&#x4E0A;&#x306B;&#x914D;&#x5217;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x91CF;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6297;&#x539F;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;2&#x30E2;&#x30CE;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CA;&#x30EB;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x8D64;&#x8840;&#x7403;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#xFF08;HA&#xFF09;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x5229;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3068;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x306E;&#x5747;&#x4E00;&#x819C;&#x4E0A;&#x306B;&#x914D;&#x5217;&#x3059;&#x308B;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3001;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;

&#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC740; &#xC810;&#xC810; &#xD56D; &#xCCB4; epitopes &#xBC0F; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; kinases&#xC758; &#xC815;&#xC758;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC885;&#xC885; &#xB0AE;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC77C;&#xAD00; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xACB0;&#xACFC;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;, &#xBE44; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBC0F; &#xAC00;&#xBCC0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD6A8;&#xC728;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC29;&#xD574;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD55C;&#xACC4;&#xB97C; &#xADF9;&#xBCF5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; ligating intein &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD6C4; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xBC30;&#xC5F4; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; immunoreactivity &#xBC0F; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; fluorescein, CDPEK (fluorescein) DS&#xC640; lysine sidechain&#xC5D0;&#xC11C; derivatized&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC9C1;&#xC811; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xC5EC; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC2E4;&#xC2DC; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACB0; &#xCC30; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xC6D0; HhaI methylase &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBCF4;&#xC874; &#xBC0F; &#xCD5C;&#xB300; 10 &#xAC1C; (4) &#xBC30; immunoassay epitope &#xAC80;&#xC0C9; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xB41C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xACB0;&#xACFC;. 2% &#xB77C;&#xC6B0;&#xB9B4; &#xD669;&#xC0B0; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968; (SDS)&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xACB0; &#xCC30; &#xC81C;&#xD488; &#xB610;&#xB294; &#xAC1C; &#xC804;&#xC5D0; &#xC720;&#xAE30; &#xC6A9; &#xB9E4; (20% &#xBA54;&#xD0C4;&#xC62C;) &#xBCC0;&#xC131; &#xD574;&#xB3C4; immunoreactivity HhaI methylase-&#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xD070; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC9C0;&#xBC30; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC0AC;&#xD6C4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC;&#xC758; &#xC591;&#xC740; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC815;&#xADDC;&#xD654; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xC2A4;&#xCE90;&#xB2DD; &#xAD6C;&#xBCC4; &#xB418;&#xB294; &#xB2E4;&#xB978; &#xD56D; &#xC6D0; epitope &#xD504;&#xB85C;&#xD544;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB860; &#xD56D; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xB958; (HA) &#xD56D; &#xC6D0;&#xC5D0; &#xC774;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294;&#xC774; &#xC774;&#xB807;&#xAC8C; phosphorylated &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC740; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xADE0;&#xC77C; &#xD558; &#xAC8C; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;, &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC758; &#xD638;&#xD658;&#xC5D0; &#xBC30;&#xC5F4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; epitope &#xB9E4;&#xD551; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC0DD;&#xC0B0;.

Matrices de p&#xE9;ptidos est&#xE1;n cada vez m&#xE1;s utilizada para definir los ep&#xED;topos de anticuerpos y especificidades de sustrato de las prote&#xED;nas quinasas. Su uso se ve obstaculizada, sin embargo, por la eficiencia de uni&#xF3;n inefectiva y variables de p&#xE9;ptidos, que a menudo da lugar a una baja sensibilidad y resultados inconsistentes. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un nuevo m&#xE9;todo para la fabricaci&#xF3;n de matrices de p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos en varias membranas despu&#xE9;s de la ligadura de los sustratos pept&#xED;dicos a una prote&#xED;na portadora intein generado. Hemos llevado a cabo la detecci&#xF3;n de prote&#xED;nas portadoras &#xF3;ptimas por inmunorreactividad y evaluaci&#xF3;n directa de la uni&#xF3;n utilizando un p&#xE9;ptido derivatizado en una cadena lateral de lisina con fluoresce&#xED;na, CDPEK (fluoresce&#xED;na) DS. La ligaci&#xF3;n de un ant&#xED;geno p&#xE9;ptido sint&#xE9;tico a una prote&#xED;na portadora, HhaI metilasa, result&#xF3; en una retenci&#xF3;n mejorada de p&#xE9;ptidos y un aumento de la sensibilidad de hasta 10 (4) veces en inmunoensayo y ep&#xED;topo de barrido experimentos. La desnaturalizaci&#xF3;n de los productos de ligaci&#xF3;n con sulfato de sodio 2% de dodecil (SDS) o un disolvente org&#xE1;nico (20% de metanol) antes de arraying no afect&#xF3; significativamente la inmunorreactividad del p&#xE9;ptido-HhaI metilasa producto. Debido a que la prote&#xED;na transportadora domina la uni&#xF3;n de productos de ligaci&#xF3;n y contiene un sitio reactivo p&#xE9;ptido, la cantidad de p&#xE9;ptido dispuestos sobre las membranas pueden ser efectivamente normalizado. Esta t&#xE9;cnica se utiliz&#xF3; en el barrido de alanina de hemaglutinina (HA) ant&#xED;geno utilizando dos anticuerpos monoclonales, resultando en distinguir los perfiles de ant&#xED;genos diferentes ep&#xED;topo. Adem&#xE1;s, se muestra que este m&#xE9;todo puede ser utilizado para caracterizar los anticuerpos que reconocen los p&#xE9;ptidos fosforilados. Este enfoque novedoso permite p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos para ser uniformemente dispuestas en las membranas, compatibles con una variedad de aplicaciones.

La producci&#xF3;n de matrices de p&#xE9;ptidos para la asignaci&#xF3;n de ep&#xED;topo mediante ligadura de prote&#xED;nas mediada por intein

&#x5408;&#x6210;&#x80BD;&#x5DF2;&#x6210;&#x4E3A;&#x6297;&#x4F53;&#x751F;&#x4EA7;&#x548C;&#x9176;&#x8868;&#x5F81;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x80BD;&#x3001; &#x89C4;&#x6A21;&#x8F83;&#x5C0F;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x5728;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5982;&#x897F;&#x65B9;&#x7684;&#x6C61;&#x70B9;&#xFF0C;&#x548C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6297;&#x539F;&#x963B;&#x788D;&#x4E86;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B80;&#x4FBF;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x7ED3;&#x624E;&#x5185;&#x542B;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x80BD;&#x6539;&#x5584;&#x6027;&#x80FD;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x3002;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x548C;&#x627F;&#x8FD0;&#x4EBA;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E; (IPL) &#x5728;&#x53D6;&#x5F97;&#x6210;&#x679C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5355;&#x6CE2;&#x6BB5;&#x4E0A;&#x7535;&#x6CF3;&#x51DD;&#x80F6;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7684;&#x7ED3;&#x624E;&#x4EA7;&#x54C1;&#x3002;&#x5206;&#x522B;&#x5BF9;&#x7532;&#x57FA; &#xFF08;M.HhaI&#xFF09; &#x548C;&#x9EA6;&#x82BD;&#x7CD6;&#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D; (MBP) &#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x88AB;&#x7ED3;&#x624E;&#x5404;&#x79CD;&#x80BD; &#xFF1B;&#x7ED3;&#x624E;&#x627F;&#x8FD0;&#x4EBA;&#x80BD;&#x4EA7;&#x54C1;&#x7ED9;&#x4E86;&#x950B;&#x5229;&#x3001; &#x91CD;&#x73B0;&#x4E50;&#x961F;&#x65F6;&#x7528;&#x4F5C;&#x79EF;&#x6781;&#x63A7;&#x5236;&#x671F;&#x95F4;&#x897F;&#x65B9;&#x63D0;&#x51FA;&#x9488;&#x5BF9;&#x540C;&#x4E00;&#x591A;&#x80BD;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x663E;&#x793A;&#x4E86;&#x8BE5;&#x7ED3;&#x624E;&#x672F;&#x4E0D;&#x540C;&#x786B;&#x916F;&#x6807;&#x8BB0;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x526F;&#x808C;&#x7403;&#x86CB;&#x767D;&#x3001; &#x591A;&#x80BD;&#x6297;&#x539F;&#x4EA7;&#x751F;&#x6297;&#x539F;&#x5728;&#x5154;&#x6216;&#x5C0F;&#x9F20;&#x8840;&#x6E05;&#x7684;&#x751F;&#x4EA7;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x4E3A;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x4EE3;&#x7ED3;&#x624E;&#x80BD;&#x542B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D; Abl &#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x8F7D;&#x4F53;&#x80BD;&#x86CB;&#x767D;&#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x5370;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E00;&#x79CD;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x6FC0;&#x9176;&#x886C;&#x5E95;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8F7B;&#x677E;&#x5730;&#x8FDB;&#x884C;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6280;&#x672F;&#x4E0D;&#x9700;&#x8981;&#x5148;&#x8FDB;&#x7684;&#x8BBE;&#x5907;&#x3001; &#x8BD5;&#x5242;&#x3001; &#x6216;&#x6280;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4E3A;&#x7814;&#x7A76;&#x548C;&#x53D1;&#x5C55;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B80;&#x5355;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

&#x5229;&#x7528;&#x6297;&#x4F53;&#x8868;&#x5F81;&#x548C;&#x9176;&#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x6539;&#x8FDB;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

Synthetic peptides have become an important tool in antibody production and enzyme characterization. The small size of peptides, however, has hindered their use in assays systems, such as Western blots, and as immunogens. Here, we present a facile method to improve the properties of peptides for multiple applications by ligating the peptides to intein-generated carrier proteins. The stoichiometric ligation of peptide and carrier achieved by intein-mediated protein ligation (IPL) results in the ligation product migrating as a single band on a SDS-PAGE gel. The carrier proteins, HhaI methylase (M.HhaI) and maltose-binding protein (MBP), were ligated to various peptides; the ligated carrier-peptide products gave sharp, reproducible bands when used as positive controls for antibodies raised against the same peptides during Western blot analysis. We further show that ligation of the peptide antigens to a different thioester-tagged carrier protein, paramyosin, produced immunogens for the production of antisera in rabbits or mice. Furthermore, we demonstrate the generation of a substrate for enzymatic assays by ligating a peptide containing the phosphorylation site for Abl protein tyrosine kinase to a carrier protein. This carrier-peptide protein was used as a kinase substrate that could easily be tested for phosphorylation using a phosphotyrosine antibody in Western blot analysis. These techniques do not require sophisticated equipment, reagents, or skills thereby providing a simple method for research and development.

An improved method for utilization of peptide substrates for antibody characterization and enzymatic assays.

Les peptides synth&#xE9;tiques sont devenus un outil important dans la production d&#x26;#39;anticorps et la caract&#xE9;risation enzymatique. La petite taille des peptides, cependant, a nui &#xE0; leur utilisation dans les syst&#xE8;mes de tests, tels que Western blot, et comme immunog&#xE8;nes. Ici, nous pr&#xE9;sentons une m&#xE9;thode facile pour am&#xE9;liorer les propri&#xE9;t&#xE9;s de peptides pour des applications multiples en ligaturant les peptides &#xE0; des prot&#xE9;ines porteuses int&#xE9;ine g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;s. La ligature stoechiom&#xE9;trique de peptide et de support r&#xE9;alis&#xE9;e par int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation prot&#xE9;ines de ligature (IPL) a pour r&#xE9;sultat le produit de ligation migration en une seule bande sur un gel SDS-PAGE. Les prot&#xE9;ines porteuses, Hhal m&#xE9;thylase (M.HhaI) et le maltose-binding protein (MBP), ont &#xE9;t&#xE9; ligatur&#xE9; &#xE0; diff&#xE9;rents peptides; les ligatur&#xE9;s transporteur de peptides produits ont pointus, des bandes reproductibles lorsqu&#x26;#39;ils sont utilis&#xE9;s comme t&#xE9;moins positifs pour les anticorps dirig&#xE9;s contre les peptides m&#xEA;mes au cours analyse par Western blot. Montrent en outre que la ligature des antig&#xE8;nes peptidiques &#xE0; un autre thioester prot&#xE9;ine marqu&#xE9;e support, paramyosine, produite immunog&#xE8;nes pour la production d&#x26;#39;antis&#xE9;rums chez des lapins ou des souris. En outre, on montre la g&#xE9;n&#xE9;ration d&#x26;#39;un substrat pour des essais enzymatiques par ligature d&#x26;#39;un peptide contenant le site de phosphorylation pour la prot&#xE9;ine tyrosine kinase Abl &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse. Cette prot&#xE9;ine porteuse-peptide a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9; comme substrat de kinase qui pourrait facilement &#xEA;tre test&#xE9; pour la phosphorylation en utilisant un anticorps phosphotyrosine dans l&#x26;#39;analyse par Western blot. Ces techniques ne n&#xE9;cessitent pas de mat&#xE9;riel sophistiqu&#xE9;, les r&#xE9;actifs, ou des comp&#xE9;tences fournissant ainsi une m&#xE9;thode simple pour la recherche et le d&#xE9;veloppement.

Une m&#xE9;thode am&#xE9;lior&#xE9;e pour l&#x26;#39;utilisation de substrats peptidiques pour la caract&#xE9;risation des anticorps et les dosages enzymatiques

Ein verbessertes Verfahren f&#xFC;r die Nutzung der Peptidsubstrate f&#xFC;r die Antik&#xF6;rper-Charakterisierung und Enzymassays.

Peptidi sintetici sono diventate uno strumento importante nella caratterizzazione di produzione e l&#39;enzima dell&#39;anticorpo. Le piccole dimensioni dei peptidi, tuttavia, ha ostacolato il loro utilizzo in sistemi di analisi, come il Western Blot e come immunogeni. Qui di seguito, presentiamo un metodo facile per migliorare le propriet&agrave; di peptidi per applicazioni multiple di legare i peptidi delle proteine carrier intein generato. La legatura stechiometrica del peptide e vettore ottenuto tramite la legatura proteina intein-mediata (IPL) risultati nel prodotto legatura la migrazione come una singola banda su un gel di SDS-PAGE. Le proteine carrier, HhaI metilasi (M.HhaI) e maltosio-binding protein (MBP), erano legate a vari peptidi; i prodotti dei carrier-peptide ha dato forte, riproducibile bande quando utilizzati come controlli positivi per gli anticorpi alzati contro i peptidi stessi durante il Western blot analisi. Mostriamo ulteriormente tale legatura degli antigeni del peptide di una proteina dell&#39;elemento portante tioesteri-tag diversi, Swanny, prodotto immunogeni per la produzione di antisieri in conigli o topi. Inoltre, dimostriamo la generazione di un substrato per dosaggi enzimatici di legare un peptide contenente il sito di fosforilazione per Abl proteina tirosina chinasi a una proteina carrier. Questa proteina carrier-peptide &egrave; stata utilizzata come substrato della chinasi che potrebbe facilmente essere testato per fosforilazione usando un anticorpo phosphotyrosine in analisi Western blot. Queste tecniche non richiedono sofisticate apparecchiature, reagenti o fornendo un metodo semplice per la ricerca e lo sviluppo di competenze.

Un metodo migliore per l&#39;utilizzo di substrati peptidici per la caratterizzazione dell&#39;anticorpo e dosaggi enzimatici.

&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x3068;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x304C;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30A6;&#x30A8;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x59A8;&#x3052;&#x3001;&#x305D;&#x3057;&#x3066;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; - &#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x9023;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3059;&#x308B;&#x5BB9;&#x6613;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x3002; SDS-PAGE&#x30B2;&#x30EB;&#x4E0A;&#x3067;&#x5358;&#x4E00;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x79FB;&#x884C;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7523;&#x7269;&#x3067;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x9054;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3068;&#x62C5;&#x4F53;&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x7684;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3002;&#x62C5;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;HhaI&#x30E1;&#x30C1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;M.HhaI&#xFF09;&#x3068;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;MBP&#xFF09;&#x3001;&#x7A2E;&#x3005;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306B;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E2D;&#x306B;&#x540C;&#x3058;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x7523;&#x751F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x967D;&#x6027;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x306F;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x88FD;&#x54C1;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30E3;&#x30FC;&#x30D7;&#x3067;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x306E;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x30A6;&#x30B5;&#x30AE;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x6297;&#x8840;&#x6E05;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x3092;&#x88FD;&#x9020;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x30BF;&#x30B0;&#x4ED8;&#x304D;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;&#x30D1;&#x30E9;&#x30DF;&#x30AA;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;&#x5225;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x62C5;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;Abl&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x9023;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x9175;&#x7D20;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x6D17;&#x7DF4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6A5F;&#x5668;&#x3001;&#x8A66;&#x85AC;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7814;&#x7A76;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30B7;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x30B9;&#x30AD;&#x30EB;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x3068;&#x9175;&#x7D20;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x7528;&#x306E;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x5229;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x6CD5;

&#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xBC0F; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD2B9;&#xC131;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xAC00; &#xB418;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;, &#xC791;&#xC740; &#xD06C;&#xAE30; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; immunogens &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xB4F1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xBC29;&#xD574; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC; intein&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; ligating &#xD558; &#xC5EC; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC190;&#xC26C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xC2DC;. &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xBC0F; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4;&#xC758; stoichiometric &#xACB0; &#xCC30; &#xACB0;&#xACFC;: SDS &#xD398;&#xC774;&#xC9C0; &#xC824;&#xC5D0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBC34;&#xB4DC;&#xB85C; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xACB0; &#xCC30; &#xC81C;&#xD488; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; (IPL)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB2EC;&#xC131;. HhaI methylase (M.HhaI)&#xC640; &#x7CD6; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (MBP) &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;; &#xD558; &#xCD9C;&#xD608; &#xD588;&#xB2E4; &#xD569;&#xC790; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC; &#xC81C;&#xD488; &#xC0E4; &#xD504;, &#xC7AC;&#xD604;&#xD560; &#xC218; &#xBC34;&#xB4DC; &#xAC19;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC11C; &#xBD80; &#xC911;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB354; &#xD1A0;&#xB07C; &#xB610;&#xB294; &#xC950;&#xC5D0;&#xC11C; antisera&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; immunogens &#xC0DD;&#xC0B0; paramyosin, &#xB2E4;&#xB978; thioester &#xD0DC;&#xADF8; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xC6D0;&#xC744; &#xACB0; &#xCC30; &#xD558; &#xC1FC;. &#xB610;&#xD55C;, Abl &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xAC00; &#xC788;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; ligating&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4;-&#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC774; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C; phosphotyrosine &#xD56D; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC27D;&#xAC8C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xD560; &#xC218; &#xB2C8; &#xAE30;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAE30;&#xC220;&#xC774; &#xBCF5;&#xC7A1;&#xB41C; &#xD55C; &#xC7A5;&#xBE44;, &#xC2DC; &#xC57D;, &#xB610;&#xB294; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBC0F; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xC220;&#xC774; &#xD544;&#xC694; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD56D; &#xCCB4; &#xD2B9;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D; &#xBC0F; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC774;&#xC6A9;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC29;&#xBC95;.

Los p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos se han convertido en una herramienta importante en la producci&#xF3;n de anticuerpos y la caracterizaci&#xF3;n de la enzima. El peque&#xF1;o tama&#xF1;o de los p&#xE9;ptidos, sin embargo, ha impedido su uso en sistemas de ensayos, tales como transferencias Western, y como inmun&#xF3;genos. Aqu&#xED;, se presenta un m&#xE9;todo f&#xE1;cil para mejorar las propiedades de los p&#xE9;ptidos para m&#xFA;ltiples aplicaciones por ligaci&#xF3;n de los p&#xE9;ptidos a prote&#xED;nas portadoras intein-generados. La ligaci&#xF3;n estequiom&#xE9;trica de p&#xE9;ptido y el portador consigue intein mediadas por prote&#xED;na de ligaci&#xF3;n (IPL) se traduce en el producto de ligaci&#xF3;n migrando como una &#xFA;nica banda en un gel de SDS-PAGE. Las prote&#xED;nas portadoras, HhaI metilasa (M.HhaI) y la maltosa, la prote&#xED;na de uni&#xF3;n (MBP), se ligaron a varios p&#xE9;ptidos, los p&#xE9;ptidos ligados portadora productos dieron las bandas n&#xED;tidas y reproducibles cuando se utilizaron como controles positivos para anticuerpos contra los p&#xE9;ptidos mismos durante el Western blot. Adem&#xE1;s, muestran que la ligadura de los ant&#xED;genos pept&#xED;dicos a una diferente tio&#xE9;ster-etiquetados prote&#xED;na transportadora, paramiosina, producido inmun&#xF3;genos para la producci&#xF3;n de antisueros en conejos o ratones. Adem&#xE1;s, se demuestra la generaci&#xF3;n de un sustrato para ensayos enzim&#xE1;ticos por ligaci&#xF3;n de un p&#xE9;ptido que contiene el sitio de fosforilaci&#xF3;n para quinasa Abl tirosina prote&#xED;na a una prote&#xED;na portadora. Esta prote&#xED;na portador de p&#xE9;ptido se utiliz&#xF3; como sustrato una quinasa que podr&#xED;a ser f&#xE1;cilmente probado para la fosforilaci&#xF3;n utilizando un anticuerpo fosfotirosina en el an&#xE1;lisis Western blot. Estas t&#xE9;cnicas no requieren sofisticados equipos, reactivos, o habilidades, proporcionando as&#xED; un m&#xE9;todo sencillo para la investigaci&#xF3;n y el desarrollo.

Un m&#xE9;todo mejorado para la utilizaci&#xF3;n de sustratos pept&#xED;dicos para la caracterizaci&#xF3;n de anticuerpos y ensayos enzim&#xE1;ticos

&#x53CD;&#x9988;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x81EA;&#x9002;&#x5E94;&#x514D;&#x75AB;&#x662F;&#x63A7;&#x5236;&#x6574;&#x4F53;&#x8F93;&#x51FA;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x901A;&#x8DEF;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x4ECB;&#x5BFC; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x53D7;&#x4F53; (TCR) &#x7684;&#x57FA;&#x672C;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x548C; Ras &#x79F0;&#x4E3A; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x671F;&#x95F4;&#x6709;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5982;&#x4F55;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#x7EC8;&#x6B62;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x4ECD;&#x7136;&#x662F;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x672A;&#x77E5;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x7684;&#x62A5;&#x9053;&#xFF0C;&#x6CA1;&#x6709;&#x5982;&#x5176;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x4E0D;&#x662F;&#x56DE;&#x5E94; TCR &#x4FE1;&#x53F7;&#x7B26;&#x5408;&#x53CD;&#x9988;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x6807;&#x51C6;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C06;&#x53D1;&#x73B0;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x6291;&#x5236;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#xFF0C;&#x540D;&#x4E3A;&#x767B;&#x5C71;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E5F;&#x6291;&#x5236;&#x4E86; Ras &#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#x901A;&#x8FC7;&#x5176;&#x56FA;&#x6709;&#x7684; Ras &#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D; (GAP) &#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x767B;&#x5C71;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x662F;&#x4E0A;&#x8C03;&#x5BF9; TCR &#x4FE1;&#x53F7;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x5BF9;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x767B;&#x5C71;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#x7684;&#x80DE;&#x5185; TCR &#x6784;&#x6210;&#x8D1F;&#x9762;&#x7684;&#x89C4;&#x7BA1;&#x5FAA;&#x73AF;&#x7684;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x2477; &#x77ED;&#x5E72;&#x6270; rna &#x7684;&#x767B;&#x5C71;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x5F02;&#x6027; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x767D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4ECB;&#x7D20;-2 &#x751F;&#x4EA7;&#x663E;&#x8457;&#x589E;&#x5F3A;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x767B;&#x5C71;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x8D1F;&#x9762;&#x53CD;&#x9988;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8FD8;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x548C; Ras &#x4E32;&#x6270;&#x7684;&#x901A;&#x8DEF;&#x3002;

&#x53CD;&#x9988;&#x6291;&#x5236;&#x9499;&#x8C03;&#x795E;&#x7ECF;&#x78F7;&#x9178;&#x548C; Ras &#x7684;&#x53CC;&#x91CD;&#x6291;&#x5236;&#x86CB;&#x767D;&#x767B;&#x5C71;&#x3002;

Feedback regulation of adaptive immunity is a fundamental mechanism for controlling the overall output of different signal transduction pathways, including that mediated by the T-cell antigen receptor (TCR). Calcineurin and Ras are known to have essential functions during T-cell activation. However, how the calcineurin signalling pathway is terminated in the process is still largely unknown. Although several endogenous inhibitors of calcineurin have been reported, none fulfils the criteria of a feedback inhibitor, as their expression is not responsive to TCR signalling. Here we identify an endogenous inhibitor of calcineurin, named Carabin, which also inhibits the Ras signalling pathway through its intrinsic Ras GTPase-activating protein (GAP) activity. Expression of Carabin is upregulated on TCR signalling in a manner that is sensitive to inhibitors of calcineurin, indicating that Carabin constitutes part of a negative regulatory loop for the intracellular TCR signalling pathway. Knockdown of Carabin by short interfering RNA led to a significant enhancement of interleukin-2 production by antigen-specific T cells in vitro and in vivo. Thus, Carabin is a negative feedback inhibitor of the calcineurin signalling pathway that also mediates crosstalk between calcineurin and Ras.

Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin.

Commentaires r&#xE9;glementation de l&#x26;#39;immunit&#xE9; adaptative est un m&#xE9;canisme fondamental pour le contr&#xF4;le de la production globale des diff&#xE9;rentes voies de transduction de signaux, y compris celle m&#xE9;di&#xE9;e par le r&#xE9;cepteur d&#x26;#39;antig&#xE8;ne des cellules T (TCR). Calcineurine et Ras sont connus pour avoir des fonctions essentielles au cours activation des lymphocytes T. Cependant, la fa&#xE7;on dont la voie de la calcineurine de signalisation est r&#xE9;sili&#xE9; dans le processus est encore largement inconnu. Bien que plusieurs inhibiteurs endog&#xE8;nes de la calcineurine ont &#xE9;t&#xE9; signal&#xE9;s, aucun remplit les crit&#xE8;res d&#x26;#39;un inhibiteur de commentaires, que leur expression ne r&#xE9;pond pas &#xE0; signalisation du TCR. Ici nous identifions un inhibiteur endog&#xE8;ne de la calcineurine, nomm&#xE9; Carabin, qui inhibe aussi la voie de signalisation Ras l&#x26;#39;interm&#xE9;diaire de son intrins&#xE8;que Ras GTPase-activating protein (GAP) l&#x26;#39;activit&#xE9;. Expression de Carabin est r&#xE9;gul&#xE9;e positivement sur TCR de signalisation d&#x26;#39;une mani&#xE8;re qui est sensible aux inhibiteurs de la calcineurine, indiquant que Carabin constitue une partie d&#x26;#39;une boucle de r&#xE9;gulation n&#xE9;gative de la voie intracellulaire TCR signalisation. Knockdown de Carabin par de petit ARN interf&#xE9;rent conduit &#xE0; une am&#xE9;lioration significative de la production d&#x26;#39;interleukine-2 par l&#x26;#39;antig&#xE8;ne des cellules T sp&#xE9;cifiques in vitro et in vivo. Ainsi, Carabin est un inhibiteur de la r&#xE9;troaction n&#xE9;gative sur la voie de signalisation calcineurine qui m&#xE9;die &#xE9;galement diaphonie entre la calcineurine et Ras.

La r&#xE9;tro-inhibition de la calcineurine et Ras par un Carabin prot&#xE9;ine inhibitrice double

R&uuml;ckmeldungen Regulierung der adaptiven Immunit&auml;t ist ein grundlegender Mechanismus zur Steuerung der Gesamtleistung von verschiedenen Signaltransduktion wegen, einschlie&szlig;lich der von der T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) vermittelt. Calcineurin und Ras sind bekannterma&szlig;en wesentliche Funktionen bei der T-Zell-Aktivierung haben. Wie ist der Calcineurin signalisieren, dass Stoffwechselweg im Prozess beendet ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Obwohl mehrere endogene Calcineurin-Inhibitoren berichtet wurden, erf&uuml;llt keiner die Kriterien eine R&uuml;ckmeldung-Inhibitor, wie ihren Ausdruck nicht TCR Signalisierung tr&auml;gt. Hier erkennen wir einen endogenen Inhibitor der Calcineurin, benannt Carabin, das auch die Ras Signalisierung Weg durch seinen intrinsischen Aktivierung von Ras GTPase Protein (GAP) Aktivit&auml;t hemmt. Ausdruck der Carabin ist herraufreguliert auf TCR Signalisierung in einer Weise, die sensibel auf Calcineurin-Inhibitoren, die darauf hinweist, dass Carabin Teil einer negativen regulatorischen Schleife f&uuml;r die intrazellul&auml;re TCR Signalisierung Weg darstellt. Niederschlag von Carabin von short interfering RNA f&uuml;hrte zu eine bedeutende Verbesserung der Interleukin-2 Produktion von Antigen-spezifische T-Zellen in vitro und in vivo. Carabin ist daher ein negatives Feedback-Inhibitor, der die Calcineurin-Signalisierung Weg, die auch &Uuml;bersprechen zwischen Calcineurin und Ras vermittelt.

Feedback-Hemmung von Calcineurin und Ras durch eine duale hemmendes Protein Carabin.

Regolamento feedback dell&#39;immunit&agrave; adattativa &egrave; un meccanismo fondamentale per controllare l&#39;output complessivo di vie di trasduzione del segnale diversi, tra cui quella mediata dal recettore dell&#39;antigene delle cellule T (TCR). Calcineurina e Ras sono noti per avere funzioni essenziali durante l&#39;attivazione delle cellule T. Tuttavia, come la calcineurina pathway &egrave; terminato il processo di segnalazione &egrave; ancora in gran parte sconosciuta. Anche se sono stati segnalati parecchi endogeni inibitori della calcineurina, nessuno risponde ai criteri di un inibitore di feedback, come loro espressione non &egrave; reattivo alla segnalazione del TCR. Qui ci identifichiamo un inibitore della calcineurina, denominato Carabin, che inibisce anche il percorso attraverso la sua intrinseca attivit&agrave; proteina (GAP) Ras gap di segnalazione Ras endogeno. Espressione di Carabin &egrave; sovraregolati su TCR segnalazione in un modo che &egrave; sensibile agli inibitori della calcineurina, indicando che Carabin costituisce parte di un ciclo negativo normativo per il TCR intracellulare pathway di segnalazione. Atterramento di Carabin da breve RNA interferente ha portato a un significativo aumento della produzione di interleuchina-2 da cellule T antigene-specifiche in vitro e in vivo. Cos&igrave;, Carabin &egrave; un feedback negativo inibitore della calcineurina segnalazione percorso che anche da intermediario diafonia tra calcineurina e Ras.

Feedback inibizione della calcineurina e Ras da una proteina inibitoria dual Carabin.

&#x9069;&#x5FDC;&#x514D;&#x75AB;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30C9;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x5236;&#x5FA1;&#x306F;&#x3001;T&#x7D30;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;TCR&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306A;&#x51FA;&#x529B;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x3068;Ras&#x306F;T&#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3067;&#x7D42;&#x4E86;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x307E;&#x3060;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x304C;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F0F;&#x304C;TCR&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x3082;&#x3001;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30C9;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x57FA;&#x6E96;&#x3092;&#x6E80;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;Ras&#x306E;GTPase&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;GAP&#xFF09;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;Ras&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x9A0E;&#x9283;&#x540D;&#x524D;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3092;&#x3001;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9A0E;&#x9283;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;TCR&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x9A0E;&#x9283;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;TCR&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x8CA0;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3092;&#x69CB;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002; in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x3067;&#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x7570;&#x7684;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30ED;&#x30A4;&#x30AD;&#x30F3;2&#x7523;&#x751F;&#x306E;&#x5927;&#x5E45;&#x306A;&#x5411;&#x4E0A;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x77ED;&#x9396;&#x5E72;&#x6E09;RNA&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x9A0E;&#x9283;&#x306E;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x9A0E;&#x9283;&#x3082;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x3068;Ras&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30AF;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C8;&#x30FC;&#x30AF;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x8CA0;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30C9;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;

&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x963B;&#x5BB3;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x9A0E;&#x9283;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x3068;Ras&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30C9;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x963B;&#x5BB3;

&#xC801;&#xC751; &#xBA74;&#xC5ED;&#xC758; &#xD53C;&#xB4DC;&#xBC31; &#xADDC;&#xC81C; T &#xC138;&#xD3EC; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (TCR)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xACBD;&#xB85C;&#xC758; &#xC804;&#xCCB4; &#xCD9C;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xC5B4; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. Calcineurin &#xBC0F; Ras T &#xC138;&#xD3EC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC911; &#xD544;&#xC218; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC838; &#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xACBD;&#xB85C; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC885;&#xB8CC; calcineurin &#xC5EC;&#xC804;&#xD788; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xC73C;&#xBA74;. &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC0DD; calcineurin &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xBCF4;&#xACE0;&#xAC00; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC544;&#xBB34;&#xB3C4; &#xB2E4; &#xD53C;&#xB4DC;&#xBC31; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC758; &#xC870;&#xAC74;&#xC744;&#xC73C;&#xB85C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC2DD; TCR &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0; &#xC751;&#xB2F5; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB610;&#xD55C; &#xC2E0;&#xD638; &#xD1B5;&#xB85C; &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC778; Ras GTPase &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GAP) &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; Ras&#xB97C; &#xC5B5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; Carabin &#xB77C;&#xB294; calcineurin&#xC758; &#xC0DD; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Carabin&#xC758; &#xC2DD; TCR calcineurin &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2E0;&#xD638;, &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; Carabin &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; TCR &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xACBD;&#xB85C; &#xB300; &#xD55C; &#xB124;&#xAC70;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xADDC;&#xC81C; &#xB8E8;&#xD504;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80;&#xB97C; &#xAD6C;&#xC131; &#xD55C;&#xB2E4;&#xC5D0; upregulated&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9E7;&#xC740; &#xAC04;&#xC12D; RNA&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; Carabin&#xC758; &#xCD5C;&#xC800;&#xC758; interleukin-2 &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1;&#xC744; &#xC774;&#xB044;&#xB294; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD2B9;&#xC815; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, Carabin calcineurin &#xC2E0;&#xD638; &#xB610;&#xD55C; calcineurin Ras &#xC0AC;&#xC774; &#xB204;&#xD654;&#xB97C; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xD1B5;&#xB85C;&#xC758; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xD53C;&#xB4DC;&#xBC31; &#xC5B5;&#xC81C; &#xBB3C; &#xC774;&#xB2E4;.

Carabin &#xB4C0;&#xC5BC; &#xC5B5;&#xC81C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; calcineurin &#xBC0F; Ras&#xC758; &#xD53C;&#xB4DC;&#xBC31; &#xC800;&#xD574;.

Regulaci&#xF3;n de la retroalimentaci&#xF3;n de la inmunidad adaptativa es un mecanismo fundamental para controlar la producci&#xF3;n global de las diferentes v&#xED;as de transducci&#xF3;n de se&#xF1;ales, entre ellas la mediada por el receptor para el ant&#xED;geno de c&#xE9;lulas T (TCR). Calcineurina y Ras se sabe que tienen funciones esenciales durante la activaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas T. Sin embargo, c&#xF3;mo la v&#xED;a de se&#xF1;alizaci&#xF3;n de la calcineurina se termina en el proceso es todav&#xED;a muy desconocido. A pesar de varios inhibidores end&#xF3;genos de la calcineurina se ha informado, no cumple los criterios de un inhibidor de la retroalimentaci&#xF3;n, ya que su expresi&#xF3;n no es sensible a la se&#xF1;alizaci&#xF3;n del TCR. Aqu&#xED; podemos identificar un inhibidor end&#xF3;geno de la calcineurina, llamado Carabin, que tambi&#xE9;n inhibe la v&#xED;a de se&#xF1;alizaci&#xF3;n Ras a trav&#xE9;s de su intr&#xED;nseca GTPasa Ras-activaci&#xF3;n de la prote&#xED;na (BPA) de actividad. Expresi&#xF3;n de Carabin es upregulated en TCR de se&#xF1;alizaci&#xF3;n de una manera que es sensible a los inhibidores de la calcineurina, lo que indica que Carabin constituye parte de un bucle negativo regulador de la v&#xED;a intracelular TCR se&#xF1;alizaci&#xF3;n. Desmontables de Carabin cortos por ARN de interferencia condujo a una mejora significativa de la producci&#xF3;n de interleucina-2 por ant&#xED;genos espec&#xED;ficos de c&#xE9;lulas T in vitro e in vivo. Por lo tanto, Carabin es un inhibidor de la retroalimentaci&#xF3;n negativa de la v&#xED;a de se&#xF1;alizaci&#xF3;n de la calcineurina, que tambi&#xE9;n interviene en la diafon&#xED;a entre la calcineurina y Ras.

Comentarios La inhibici&#xF3;n de la calcineurina y Ras por un Carabin Prote&#xED;na Inhibidora doble

&#x5408;&#x6210;&#x80BD;&#x7EB3;&#x5165;&#x5404;&#x79CD;&#x5316;&#x5B66;&#x4E2D;&#x95F4;&#x76F8;&#x9694;&#xFF0C;&#x4F8B;&#x5982;&#xFF0C;&#x78F7;&#x9178;&#x7FA4;&#x4F53;&#xFF0C;&#x662F;&#x8C03;&#x67E5;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4FEE;&#x9970;&#x9176;&#xFF0C;&#x5982;&#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (PPs) &#x7684;&#x65B9;&#x4FBF;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x77ED;&#x80BD;&#x6709;&#x65F6;&#x7A77;&#x5E95;&#x4E0A;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5E38;&#x7528;&#x77E9;&#x9635;&#x662F;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9884;&#x77E5;&#x548C;&#x53D8;&#x91CF;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5E95;&#x7269;&#x805A;&#x82EF;&#x786B;&#x919A;&#x662F;&#x9176;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#x548C;&#x5370;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x4E2D;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x8272;&#x3002;&#x5236;&#x5907;&#x548C;&#x8868;&#x5F81;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x662F;&#x56F0;&#x96BE;&#x548C;&#x6280;&#x672F;&#x8981;&#x6C42;&#x9AD8;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E; (IPL) &#x6280;&#x672F;&#x7528;&#x6765;&#x968F;&#x65F6;&#x901A;&#x8FC7;&#x7ED3;&#x624E;&#x5185;&#x542B;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D; (CP) &#x62E5;&#x6709;&#x4E00;&#x5BF9;&#x4E00;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x5B66;&#x4E0E;&#x7FA7;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x786B;&#x916F;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x78F7;&#x9178;&#x80BD;&#x751F;&#x6210;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x8D28;&#x3002;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x78F7; (&#x50A8;&#x5907;) &#x57FA;&#x677F;&#x662F;&#x5BF9;&#x5F85; PP &#x5E76;&#x968F;&#x540E;&#x906D;&#x53D7;&#x6570;&#x7EC4;&#x6216;&#x5370;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x4E0E;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7279;&#x5F02;&#x6297;&#x4F53;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x505A;&#x6CD5;&#x662F;&#x6781;&#x4E3A;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x751F;&#x4EA7;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x677F;&#x542B;&#x6709;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x7684;&#x6570;&#x7EC4;&#x548C;&#x5DF2;&#x5E94;&#x7528;&#x7B5B;&#x9009;&#x805A;&#x82EF;&#x786B;&#x919A;&#x4E0E;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x3001; &#x4E1D;&#x6C28;&#x9178;&#x6216;&#x82CF;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x7EA6; 240-fold &#x589E;&#x52A0;&#x70B9;&#x6C61;&#x70B9;&#x5206;&#x6790;&#x4E0E;&#x5408;&#x6210;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x76F8;&#x6BD4;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x5728;&#x671D;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x3002;IPL &#x6280;&#x672F;&#x514B;&#x670D;&#x4E86;&#x5F53;&#x524D;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7F3A;&#x70B9;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x591A;&#x624D;&#x591A;&#x827A;&#x7684;&#x7B80;&#x6613;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x677F;&#x542B;&#x6709;&#x660E;&#x786E;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x56FE;&#x6848;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4FEE;&#x9970;&#x9176;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;

&#x8981;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x7684;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x9635;&#x5217;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;

Synthetic peptides incorporating various chemical moieties, for example, phosphate groups, are convenient tools for investigating protein modification enzymes, such as protein phosphatases (PPs). However, short peptides are sometimes poor substrates, and their binding to commonly used matrices is unpredictable and variable. In general, protein substrates for PPs are superior for enzymatic assays, binding to various matrices, and Western blot analysis. The preparation and characterization of phosphoproteins, however can be difficult and technically demanding. In this study, the intein-mediated protein ligation (IPL) technique was used to readily generate phosphorylated protein substrates by ligating a synthetic phosphopeptide to an intein-generated carrier protein (CP) possessing a carboxyl-terminal thioester with a one-to-one stoichiometry. The ligated phosphoprotein (LPP) substrate was treated with a PP and subsequently subjected to array or Western blot analysis with a phospho-specific antibody. This approach is highly effective in producing arrays of protein substrates containing phosphorylated amino acid residues and has been applied for screening of PPs with specificity toward phosphorylated tyrosine, serine, or threonine residues, resulting in an approximately 240-fold increase in sensitivity in dot blot analysis compared with the use of synthetic peptides. The IPL technique overcomes the disadvantages of current methods and is a versatile system for the facile production of protein substrates containing well-defined structural motifs for the study of protein modification enzymes.

Use of intein-mediated phosphoprotein arrays to study substrate specificity of protein phosphatases.

Peptides synth&#xE9;tiques comportant des groupements chimiques diff&#xE9;rents, par exemple, les groupes phosphates, sont des outils pratiques pour enqu&#xEA;ter sur des enzymes de modification des prot&#xE9;ines, tels que des prot&#xE9;ines phosphatases (PP). Cependant, les peptides courts sont parfois substrats pauvres, et leur liaison aux matrices couramment utilis&#xE9;es est impr&#xE9;visible et variable. En g&#xE9;n&#xE9;ral, substrats prot&#xE9;iques pour PP sont sup&#xE9;rieurs pour les dosages enzymatiques, se lier &#xE0; diverses matrices, et des analyses par Western blot. La pr&#xE9;paration et la caract&#xE9;risation des phosphoprot&#xE9;ines, mais peut &#xEA;tre difficile et techniquement exigeant. Dans cette &#xE9;tude, l&#x26;#39;int&#xE9;ine m&#xE9;di&#xE9;e par la prot&#xE9;ine ligature (IPL) a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;e pour g&#xE9;n&#xE9;rer facilement des substrats prot&#xE9;iques phosphoryl&#xE9;es par ligature d&#x26;#39;un phosphopeptide synth&#xE9;tique &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse int&#xE9;ine-g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9; (CP) poss&#xE9;dant un thioester carboxyle-terminal avec un one-to-one stoechiom&#xE9;trie. La phosphoprot&#xE9;ine ligatur&#xE9; (LPP) substrat a &#xE9;t&#xE9; trait&#xE9; avec un PP et ensuite soumis &#xE0; tableau ou analyse par Western blot avec un anticorps phospho-sp&#xE9;cifique. Cette approche est tr&#xE8;s efficace dans la production de tableaux de substrats prot&#xE9;iques phosphoryl&#xE9;es contenant des r&#xE9;sidus d&#x26;#39;acides amin&#xE9;s et a &#xE9;t&#xE9; appliqu&#xE9;e pour le d&#xE9;pistage de la PP avec une sp&#xE9;cificit&#xE9; envers tyrosine phosphoryl&#xE9;e, la s&#xE9;rine ou thr&#xE9;onine, r&#xE9;sultant en une augmentation d&#x26;#39;environ 240 fois de la sensibilit&#xE9; dans l&#x26;#39;analyse dot blot par rapport &#xE0; l&#x26;#39;utilisation de peptides synth&#xE9;tiques. La technique IPL permet de surmonter les inconv&#xE9;nients des m&#xE9;thodes actuelles et est un syst&#xE8;me polyvalent pour la production facile des substrats prot&#xE9;iques contenant bien d&#xE9;finis motifs structuraux pour l&#x26;#39;&#xE9;tude des enzymes de modification des prot&#xE9;ines.

L&#x26;#39;utilisation de tableaux phosphoprot&#xE9;ines int&#xE9;ine m&#xE9;diation pour &#xE9;tudier sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat de prot&#xE9;ines phosphatases

Synthetische Peptide mit verschiedenen chemische Adsorptionseigenschaften, z. B. sind Phosphatgruppen, praktische Tools f&uuml;r die Untersuchung von Protein-&Auml;nderung-Enzyme, wie Protein-Phosphatasen (PPs). Jedoch kurze Peptide sind manchmal schlechte Substrate und ihre Bindung an h&auml;ufig verwendeten Matrizen ist unvorhersehbar und Variable. Im Allgemeinen sind Protein-Substrate f&uuml;r PPs &uuml;berlegen f&uuml;r enzymatische Assays, binden an verschiedenen Matrizen und Western-Blot-Analyse. Die Herstellung und Charakterisierung von Phosphoproteine, jedoch kann schwierig und technisch anspruchsvoll. In dieser Studie wurde die Intein-vermitteltes Protein-Ligaturen (IPL)-Technik verwendet, leicht phosphorylierte Protein Substrate durch Verbindung eines synthetischen Phosphopeptide zu einem Intein generierte Permease (CP) besitzen ein Thioester Karboxyl--Terminal mit einem 1: 1-St&ouml;chiometrie generiert. Das Ligaturen Phosphoprotein (LPP)-Substrat wurde behandelt mit einer PP und anschlie&szlig;end Array oder Western-Blot-Analyse mit einem Phospho-spezifische Antik&ouml;rper. Dieser Ansatz ist sehr effektiv in der Herstellung von Arrays von Protein-Substraten, die Phosphorylierte Aminos&auml;ure R&uuml;ckst&auml;nde und f&uuml;r die Pr&uuml;fung von Pharmazeutika mit Spezifit&auml;t gegen&uuml;ber phosphorylierten Tyrosin, Serin oder Threonin R&uuml;ckst&auml;nde, etwa 240-fold erh&ouml;hte Empfindlichkeit in Punkt Fleckanalyse gegen&uuml;ber der Verwendung synthetischer Peptide angewendet wurde. Die IPL-Technik &uuml;berwindet die Nachteile der aktuellen Methoden und ist ein vielseitiges System f&uuml;r die oberfl&auml;chlichen Herstellung von Protein-Substrate, die klar definierte strukturelle Motive f&uuml;r das Studium der Protein-&Auml;nderung-Enzyme enthalten.

Verwendung von Intein-vermitteltes Phosphoprotein Arrays Substratspezifit&auml;t der Protein-Phosphatasen zu studieren.

Peptidi sintetici che incorpora vari moiety chimico, per esempio, gruppi fosfato, sono pratici strumenti per indagare gli enzimi di modificazione della proteina, come protein fosfatasi (PPs). Tuttavia, brevi peptidi sono talvolta substrati poveri e loro associazione a matrici comunemente usati &egrave; imprevedibile e variabile. In generale, i substrati della proteina per PPs sono superiori per dosaggi enzimatici, associazione alle varie matrici e analisi Western blot. La preparazione e caratterizzazione di fosfoproteine, tuttavia pu&ograve; essere difficile e tecnicamente impegnativo. In questo studio, la tecnica di legatura (IPL) proteina intein-mediata &egrave; stata utilizzata per generare facilmente substrati proteina fosforilata da legare un fosfopeptide sintetica a una proteina vettore generato intein (CP) che possiedono un tioestere carbossi-terminale con una stechiometria uno a uno. Il substrato dei fosfoproteina (LPP) &egrave; stato trattato con un PP e successivamente sottoposti ad analisi Western blot con un anticorpo specifico fosfo o matrice. Questo approccio &egrave; altamente efficacia nella produzione di matrici di substrati di proteine contenenti residui fosforilati aminoacido ed &egrave; stato applicato per lo screening di PPs con specificit&agrave; verso fosforilate residui di tirosina, Serina o treonina, risultanti in un aumento di circa 240-fold in sensibilit&agrave; in analisi di macchia dot rispetto all&#39;uso di peptidi sintetici. La tecnica IPL supera gli inconvenienti dei metodi attuali ed &egrave; un sistema versatile per la facile produzione di substrati di proteine contenenti motivi strutturali ben definiti per lo studio degli enzimi di modificazione della proteina.

Uso di matrici fosfoproteina intein-mediato per studiare la specificit&agrave; di substrato della protein fosfatasi.

&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x90E8;&#x5206;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3093;&#x3060;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x57FA;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;PPS&#xFF09;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4FEE;&#x98FE;&#x9175;&#x7D20;&#x3092;&#x3001;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4FBF;&#x5229;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x77ED;&#x3044;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x3070;&#x3057;&#x3070;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x884C;&#x5217;&#x3078;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x304C;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x3068;&#x5909;&#x6570;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x306F;&#x3001;PPS&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3078;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x9175;&#x7D20;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A6;&#x30A8;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x512A;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3068;&#x30AD;&#x30E3;&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x6280;&#x8853;&#x7684;&#x306B;&#x8981;&#x6C42;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x4E00;&#x5BFE;&#x4E00;&#x3067;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x672B;&#x7AEF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; - &#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;CP&#xFF09;&#x306B;&#x5408;&#x6210;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x9023;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x3002;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;LPP&#xFF09;&#x57FA;&#x677F;&#x306F;&#x3001;PP&#x3067;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x3001;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x914D;&#x5217;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x4F9B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x88FD;&#x9020;&#x306B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6709;&#x52B9;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x30C9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x7D04;240&#x500D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;&#x30BB;&#x30EA;&#x30F3;&#x3001;&#x30B9;&#x30EC;&#x30AA;&#x30CB;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3068;PP&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x305F;&#x3002; IPL&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x6B20;&#x70B9;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3057;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4FEE;&#x98FE;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x660E;&#x78BA;&#x306B;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x69CB;&#x9020;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x5BB9;&#x6613;&#x306A;&#x88FD;&#x9020;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6C4E;&#x7528;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x5A92;&#x4ECB;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;

&#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB294; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD654;&#xD559; moieties &#xD1B5;&#xD569;, &#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;, &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC744; &#xD3B8;&#xB9AC; &#xD558; &#xAC8C; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xC218;&#xC815; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; (&#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;) &#xB4F1;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558; &#xACE0; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC9E7;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB294; &#xB54C;&#xB85C;&#xB294; &#xBD88; &#xC30D; &#xD55C; &#xAE30;&#xD310; &#xBC0F; &#xC790;&#xC8FC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xD589;&#xB82C;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC608;&#xCE21;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xBCC0;&#xC218;. &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD589;&#xB82C; &#xBC0F; &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xC218;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC900;&#xBE44; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC131; phosphoproteins, &#xC5B4;&#xB835;&#xACE0; &#xAE30;&#xC220;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC694;&#xAD6C; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; (IPL) &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC27D;&#xAC8C; phosphorylated &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; intein &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (CP) &#xC77C;&#xB300;&#xC77C; stoichiometry&#xC640; carboxyl &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; thioester &#xC18C;&#xC9C0;&#xB97C; &#xD569;&#xC131; phosphopeptide ligating&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD569;&#xC790; phosphoprotein (LPP://) &#xAE30;&#xD310; PP&#xB85C; &#xCE58;&#xB8CC; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xADF8; &#xD6C4; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC774; &#xB098; &#xC778; &#xD2B9;&#xC815; &#xD56D; &#xCCB4;&#xB294; &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D; &#xB300;&#xC0C1;&#xC774;. &#xC774; &#xC774;&#xB807;&#xAC8C; &#xBC30;&#xC5F4; phosphorylated &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801; &#xC774;&#xBA70; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC810; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xAC10;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC57D; 240-fold &#xC99D;&#xAC00;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C; phosphorylated &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;, &#xB5A0;&#xB4E4;&#xACE0;, &#xB610;&#xB294; &#xD2B8;&#xB808;&#xC624;&#xB2CC; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xD5A5;&#xD574; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;&#xC758; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. IPL &#xAE30;&#xC220; &#xD604;&#xC7AC; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xB2E8;&#xC810;&#xC744; &#xADF9;&#xBCF5; &#xD558; &#xACE0; &#xC190;&#xC26C;&#xC6B4; &#xC218;&#xC815; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC798; &#xC815;&#xC758; &#xB41C; &#xAD6C;&#xC870; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xD504;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574;&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xC5F0;&#xAD6C; phosphoprotein intein &#xC911;&#xC7AC; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;.

Los p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos que incorporan diversos restos qu&#xED;micos, por ejemplo, grupos fosfato, son herramientas convenientes para la investigaci&#xF3;n de enzimas de las prote&#xED;nas de modificaci&#xF3;n, tales como prote&#xED;nas fosfatasas (PPS). Sin embargo, los p&#xE9;ptidos cortos son a veces sustratos pobres, y su uni&#xF3;n a las matrices utilizadas es impredecible y variable. En general, los sustratos de prote&#xED;nas para PP son superiores para ensayos enzim&#xE1;ticos, la uni&#xF3;n a diversas matrices, y an&#xE1;lisis Western blot. La preparaci&#xF3;n y caracterizaci&#xF3;n de fosfoprote&#xED;nas, sin embargo puede ser dif&#xED;cil y exigente t&#xE9;cnicamente. En este estudio, la intein mediada por ligaci&#xF3;n prote&#xED;na (IPL) se utiliz&#xF3; la t&#xE9;cnica para generar f&#xE1;cilmente sustratos fosforilados prote&#xED;na ligando un fosfop&#xE9;ptido sint&#xE9;tico a una prote&#xED;na portadora intein generado (PC) que posea un tio&#xE9;ster carboxilo-terminal con un uno-a-uno estequiometr&#xED;a. La fosfoprote&#xED;na lig&#xF3; (LPP) sustrato fue tratado con un PP y posteriormente sometido a la matriz o el an&#xE1;lisis de transferencia Western con un anticuerpo fosfo-espec&#xED;fico. Este enfoque es muy eficaz en la producci&#xF3;n de matrices de sustratos que contienen prote&#xED;nas fosforiladas residuos de amino&#xE1;cidos y se ha aplicado para la detecci&#xF3;n de PP con especificidad hacia tirosina fosforilado, serina, treonina o residuos, lo que resulta en un aumento de aproximadamente 240-veces en la sensibilidad en el an&#xE1;lisis de transferencia de puntos en comparaci&#xF3;n con el uso de p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos. La t&#xE9;cnica de IPL supera las desventajas de los m&#xE9;todos actuales y es un sistema vers&#xE1;til para la producci&#xF3;n f&#xE1;cil de sustratos que contienen prote&#xED;nas bien definidas motivos estructurales para el estudio de las enzimas de modificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas.

El uso de matrices fosfoprote&#xED;na intein mediadas para estudiar la especificidad de sustrato de fosfatasas de prote&#xED;nas

&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x5F88;&#x96BE;&#x51C6;&#x5907;&#x5408;&#x9002;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x5E95;&#x7269;&#x5E95;&#x7269;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (PPs) &#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x662F;&#x975E;&#x5E38;&#x5177;&#x6709;&#x6311;&#x6218;&#x6027;&#x3002;&#x805A;&#x82EF;&#x786B;&#x919A;&#x5E38;&#x7528;&#x7684;&#x57FA;&#x8D28;&#x78F7;&#x9178;&#xFF0C;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176;&#x6216;&#x78F7;&#x9178;&#x80BD;&#x5316;&#x5B66;&#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5E95;&#x7269;&#x6709;&#x5176;&#x4F18;&#x70B9;&#x548C;&#x5C40;&#x9650;&#x6027;&#x3002;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x66F4;&#x5BC6;&#x5207;&#x5730;&#x6A21;&#x4EFF;&#x7684;&#x751F;&#x7406;&#x6709;&#x5173; PP &#x886C;&#x5E95;&#x6750;&#x6599;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5176;&#x5236;&#x5907;&#x6280;&#x672F;&#x8981;&#x6C42;&#x5F88;&#x9AD8;&#x3002;&#x5408;&#x6210;&#x78F7;&#x9178;&#x80BD;&#x76EE;&#x524D;&#x8D85;&#x8FC7;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x4F18;&#x52BF;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8F7B;&#x677E;&#x5730;&#x5236;&#x4F5C;&#x91CF;&#x5927;&#xFF0C;&#x5176;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x5E8F;&#x5217;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x5305;&#x542B;&#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x51B3;&#x5B9A;&#x56E0;&#x7D20;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x77ED;&#x80BD;&#x5C11;&#x4F18;&#x5316;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E0E;&#x57FA;&#x5E95; PP &#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x5F80;&#x5F80;&#x663E;&#x793A;&#x7A77;&#x4EBA;&#x548C;&#x53D8;&#x91CF;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x4F4E;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x5206;&#x6790;&#x4E2D;&#x7684;&#x575A;&#x5B9E;&#x652F;&#x6301; PP &#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5229;&#x7528;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E; (IPL) &#x6280;&#x672F;&#x76F8;&#x7ED3;&#x5408;&#x7684;&#x4F18;&#x52BF;&#x86CB;&#x767D;&#x53CA;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5206;&#x5B50;&#x5408;&#x6210;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x805A;&#x82EF;&#x786B;&#x919A;&#x4E3A;&#x751F;&#x6210;&#x886C;&#x5E95;&#x3002;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x78F7;&#x9178;&#x80BD;&#x5185;&#x542B;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D; (CP) &#x7684;&#x4E00;&#x5BF9;&#x4E00;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x6BD4;&#x5BF9;&#x7ED3;&#x679C;&#x7ED3;&#x624E;&#x78F7;&#x86CB;&#x767D; &#xFF08;&#x50A8;&#x5907;&#xFF09; &#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x5C31;&#x4E1A;&#x4E09;&#x4E2A;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3001; &#x70B9;&#x6C61;&#x70B9;&#x6570;&#x7EC4;&#x3001; &#x5370;&#x8FF9;&#x548C;&#x9176;&#x8054;&#x514D;&#x75AB;&#x5438;&#x9644;&#x6CD5;&#x7814;&#x7A76;&#x50A8;&#x5907;&#x886C;&#x5E95;&#x4E0A;&#x7684; PP &#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x8131;&#x6C2E;&#x9664;&#x78F7;&#x662F;&#x5269;&#x4F59;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#xFF0C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6216;&#x4E0E;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7279;&#x5F02;&#x6297;&#x4F53;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x5B83;&#xFF0C;&#x7528;&#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x663E;&#x793A;&#x83B1;&#x5361;&#x4F18;&#x52BF;&#x514D;&#x8D39;&#x80BD;&#x56FA;&#x76F8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0A;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x83B1;&#x5361;&#x5C55;&#x793A;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7528;&#x5728;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x63D0;&#x9AD8;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x4E00;&#x81F4;&#x6027;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x9971;&#x548C;&#x5EA6;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E32;&#x884C;&#x7A00;&#x91CA;&#x6CD5;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x6837;&#x54C1;&#x7684;&#x89C4;&#x907F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4EFD;&#x62A5;&#x544A;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E86;&#x50A8;&#x5907;&#x57FA;&#x677F;&#x5236;&#x5907;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5229;&#x7528;&#x5728;&#x57FA;&#x4E8E;&#x56FA;&#x76F8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0A;&#x7684;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x7684; PP &#x5316;&#x9A8C;&#x3002;

&#x7ED3;&#x624E;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x3001; &#x5236;&#x5907;&#x548C;&#x4F7F;&#x7528;&#xFF1A; &#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x7531;&#x70B9;&#x6C61;&#x70B9;&#x9635;&#x5217;&#xFF0C;&#x9176;&#x8054;&#x514D;&#x75AB;&#x5438;&#x9644;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x548C;&#x897F;&#x65B9;&#x7814;&#x7A76;&#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

The study of substrate specificity of protein phosphatases (PPs) is very challenging since it is difficult to prepare a suitable phosphorylated substrate. Phosphoproteins, phosphorylated by a protein kinase, or chemically synthesized phosphopeptides are commonly used substrates for PPs. Both types of these substrates have their advantages and limitations. Phosphoproteins mimic more closely the physiologically relevant PP substrates, but their preparation is technically demanding. Synthetic phosphopeptides present advantages over proteins because they can be easily produced in large quantity and their amino acid sequence can be designed to contain potential determinants of substrate specificity. However, short peptides are less optimal compared to in vivo PP substrates and often display poor and variable binding to different matrices, resulting in low sensitivity in analysis of PP activity on solid support. In this work we utilize the intein-mediated protein ligation (IPL) technique to generate substrates for PPs, combining the advantages of proteins and synthetic peptides in one molecule. The ligation of a synthetic phosphopeptide to an intein-generated carrier protein (CP) with a one-to-one stoichiometry results in the formation of a ligated phosphoprotein (LPP). Three widely used assays, dot blot array, Western blot and ELISA were employed to study the PP activity on LPP substrates. Dephosphorylation was measured by detection of the remaining phosphorylation, or lack of it, with a phospho-specific antibody. The data show the advantage of LPPs over free peptides in assays on solid supports. LPPs exhibited enhanced binding to the matrices used in the study, which significantly improved sensitivity and consistency of the assays. In addition, saturation of the signal was circumvented by serial dilution of the assay samples. This report describes detailed experimental procedures for preparation of LPP substrates and their use in PP assays based on immobilization on solid supports.

Design, preparation and use of ligated phosphoproteins: a novel approach to study protein phosphatases by dot blot array, ELISA and Western blot assays.

L&#x26;#39;&#xE9;tude de la sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat de prot&#xE9;ines phosphatases (PP) est tr&#xE8;s difficile car il est difficile de pr&#xE9;parer un substrat appropri&#xE9; phosphoryl&#xE9;e. Phosphoprot&#xE9;ines, phosphoryl&#xE9;e par une prot&#xE9;ine kinase, ou phosphopeptides synth&#xE9;tis&#xE9;s chimiquement sont couramment utilis&#xE9;s pour les substrats PP. Les deux types de ces substrats ont leurs avantages et leurs limites. Phosphoprot&#xE9;ine imiter de plus pr&#xE8;s les substrats physiologiquement pertinents PP, mais leur pr&#xE9;paration est techniquement difficile. Phosphopeptides synth&#xE9;tiques pr&#xE9;sentent des avantages par rapport prot&#xE9;ines, car ils peuvent &#xEA;tre facilement produit en grande quantit&#xE9; et de leur s&#xE9;quence d&#x26;#39;acides amin&#xE9;s peuvent &#xEA;tre con&#xE7;us pour contenir des d&#xE9;terminants potentiels de la sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat. Cependant, les peptides courts sont moins optimale par rapport &#xE0; in vivo PP substrats et affichent souvent contraignant les pauvres et variable &#xE0; diff&#xE9;rentes matrices, ce qui entra&#xEE;ne une faible sensibilit&#xE9; dans l&#x26;#39;analyse de l&#x26;#39;activit&#xE9; PP sur support solide. Dans ce travail, nous utilisons l&#x26;#39;int&#xE9;ine m&#xE9;di&#xE9;e par la prot&#xE9;ine ligature (IPL) technique pour g&#xE9;n&#xE9;rer des substrats pour le SPP, combinant les avantages des prot&#xE9;ines et des peptides synth&#xE9;tiques dans une mol&#xE9;cule. La ligature d&#x26;#39;un phosphopeptide de synth&#xE8;se &#xE0; une prot&#xE9;ine porteuse g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;e par int&#xE9;ine (CP) avec un r&#xE9;sultat stoechiom&#xE9;trie un-&#xE0;-un &#xE0; la formation d&#x26;#39;une phosphoprot&#xE9;ine ligatur&#xE9; (LPP). Trois tests largement utilis&#xE9;s, array dot blot, Western Blot et ELISA ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;es pour &#xE9;tudier l&#x26;#39;activit&#xE9; PP sur des substrats LPP. D&#xE9;phosphorylation a &#xE9;t&#xE9; mesur&#xE9;e par d&#xE9;tection de la phosphorylation restante, ou de l&#x26;#39;absence de celui-ci, avec un anticorps phospho-sp&#xE9;cifique. Les donn&#xE9;es montrent l&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t de PPR sur des peptides libres dans les essais sur des supports solides. PPR expos&#xE9; am&#xE9;lior&#xE9; contraignante pour les matrices utilis&#xE9;es dans l&#x26;#39;&#xE9;tude, qui a consid&#xE9;rablement am&#xE9;lior&#xE9; la sensibilit&#xE9; et la coh&#xE9;rence des analyses. En outre, la saturation du signal a &#xE9;t&#xE9; contourn&#xE9;e par une dilution en s&#xE9;rie des &#xE9;chantillons d&#x26;#39;essai. Ce rapport d&#xE9;crit d&#xE9;taill&#xE9;es des proc&#xE9;dures exp&#xE9;rimentales pour la pr&#xE9;paration de la LPP substrats et leur utilisation dans des essais de PP sur la base de l&#x26;#39;immobilisation sur supports solides.

Conception, pr&#xE9;paration et l&#x26;#39;utilisation des phosphoprot&#xE9;ines ligatur&#xE9;s: une nouvelle approche pour &#xE9;tudier des prot&#xE9;ines phosphatases par Array Dot Blot, ELISA et dosages Western Blot

Das Studium der Substratspezifit&auml;t der Protein-Phosphatasen (PPs) ist sehr herausfordernd, da es schwierig ist, eine geeignete phosphorylierten vorbereitet. Phosphoproteine, durch eine Proteinkinase oder chemisch synthetisierte Phosphopeptides phosphoryliert sind h&auml;ufig verwendete Substrate f&uuml;r PPs. Beide Arten von diesen Substraten haben ihre Vorteile und Einschr&auml;nkungen. Phosphoproteine imitieren st&auml;rker die physiologisch relevanten PP-Substrate, aber ihre Vorbereitung ist technisch anspruchsvoll. Synthetische Phosphopeptides pr&auml;sentieren Vorteile gegen&uuml;ber Proteine, da sie leicht in gro&szlig;en Mengen hergestellt werden k&ouml;nnen und ihrer Aminos&auml;ure-Sequenz entworfen werden, kann um potenzielle Determinanten der Substratspezifit&auml;t enthalten. Jedoch kurze Peptide sind weniger optimal im Vergleich zu in-vivo-PP-Substraten und oft Armen und Variable Bindung f&uuml;r verschiedene Matrizen, die zu geringe Empfindlichkeit Analyse PP T&auml;tigkeit auf solide Unterst&uuml;tzung anzuzeigen. In dieser Arbeit verwenden wir die Intein-vermitteltes Protein Ligaturen (IPL) Technik zum Generieren von Substraten f&uuml;r PPs, kombinieren die Vorteile von Proteinen und synthetische Peptide in einem Molek&uuml;l. Die Verbindung der eine synthetische Phosphopeptide, ein Intein generierte Permease (CP) mit einem 1: 1-St&ouml;chiometrie f&uuml;hrt zur Bildung von einem Ligaturen Phosphoprotein (LPP). Drei weit verbreitete Assays, Dot Fleck Array, Western-Blot und ELISA waren besch&auml;ftigt, die PP-Aktivit&auml;t auf BVG-Substraten zu studieren. Dephosphorylierung wurde durch Nachweis von den verbleibenden Phosphorylierung oder Mangel daran, mit einem Phospho-spezifische Antik&ouml;rper gemessen. Die Daten zeigen die Vorteile von LPPs gegen&uuml;ber freien Peptiden bei Assays auf solide Unterst&uuml;tzungen. LPPs ausgestellt verst&auml;rkte Bindung an die Matrizen verwendet, die in der Studie, die Empfindlichkeit und Konsistenz der Tests deutlich verbessert. Dar&uuml;ber hinaus wurde die S&auml;ttigung des Signals durch serielle Verd&uuml;nnung der Probe Proben umgangen. Dieser Bericht beschreibt ausf&uuml;hrliche experimentelle Verfahren zur Vorbereitung der BVG Substraten und deren Verwendung bei PP-Assays, die auf der Grundlage von Immobilisierung auf solide unterst&uuml;tzt.

Design, Erstellung und Verwendung von eine Ligatur Phosphoproteine: eine neuartige Herangehensweise an das Studium von Protein-Phosphatasen durch Punkt Fleck Array, ELISA und Western blot Assays.

Lo studio delle specificit&agrave; di substrato della protein fosfatasi (PPs) &egrave; molto impegnativo poich&eacute; &egrave; difficile preparare un substrato adatto fosforilato. Fosfoproteine, fosforilate da una chinasi di proteina, o chimicamente sintetizzato fosfopeptidi sono comunemente utilizzati substrati per PPs. Entrambi i tipi di questi substrati hanno i loro vantaggi e limitazioni. Fosfoproteine imitano pi&ugrave; da vicino i substrati PP fisiologicamente rilevanti, ma la loro preparazione &egrave; tecnicamente impegnativo. Fosfopeptidi sintetiche presentano vantaggi rispetto le proteine perch&eacute; possono essere facilmente prodotte in grande quantit&agrave; e loro sequenza dell&#39;amminoacido pu&ograve; essere progettato per contenere i potenziali fattori determinanti della specificit&agrave; di substrato. Tuttavia, brevi peptidi sono meno ottimale rispetto ai substrati PP in vivo e mostrano spesso scarsa e variabile associazione a matrici diverse, con conseguente bassa sensibilit&agrave; nell&#39;analisi dell&#39;attivit&agrave; PP su supporto solido. In questo lavoro utilizziamo la tecnica di legatura (IPL) proteina intein-mediato per generare i substrati di PPs, combinando i vantaggi delle proteine e peptidi sintetici in una molecola. La legatura di un fosfopeptide sintetica a una proteina carrier generato intein (CP) con una stechiometria biunivoca provoca la formazione di una fosfoproteina dei (LPP). Tre saggi ampiamente utilizzati, matrice di dot blot, Western blot ed ELISA sono stati impiegati per studiare l&#39;attivit&agrave; PP su substrati LPP. Defosforilazione &egrave; stata misurata mediante rilevamento della fosforilazione rimanente, o mancanza di esso, con un anticorpo specifico fosfo. I dati mostrano il vantaggio di LPPs su peptidi gratis in dosaggi su supporti solidi. LPPs esposto associazione rafforzata per le matrici utilizzate nello studio, che ha migliorato significativamente la sensibilit&agrave; e la coerenza dei saggi. Inoltre, saturazione del segnale fu aggirata mediante diluizione seriale dei campioni di analisi. Questo rapporto descrive dettagliate procedure sperimentali per la preparazione di substrati LPP e loro uso in dosaggi PP basato su immobilizzazione su supporti solidi.

Progettazione, preparazione e uso di legare fosfoproteine: un nuovo approccio allo studio protein fosfatasi da matrice di dot blot, ELISA e Western blot dosaggi.

&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x6E96;&#x5099;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#xFF08;PPS&#xFF09;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x5408;&#x6210;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;PPS&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x3068;&#x5236;&#x9650;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;PP&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x6A21;&#x5023;&#x3059;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x304C;&#x6280;&#x8853;&#x7684;&#x306B;&#x8981;&#x6C42;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x5927;&#x91CF;&#x306B;&#x88FD;&#x9020;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x914D;&#x5217;&#x306F;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x5408;&#x6210;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4E0A;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x77ED;&#x3044;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x56FA;&#x4F53;&#x652F;&#x6301;&#x4F53;&#x4E0A;&#x306B;PP&#xB7;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x306F;&#x611F;&#x5EA6;&#x304C;&#x4F4E;&#x3044;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;in vivo&#x3067;PP&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x6700;&#x9069;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x3057;&#x3070;&#x3057;&#x3070;&#x5225;&#x306E;&#x884C;&#x5217;&#x306B;&#x8CA7;&#x3057;&#x3044;&#x4EBA;&#x3005;&#x3084;&#x5909;&#x6570;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;1&#x5206;&#x5B50;&#x4E2D;&#x306B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3084;&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B8;&#x30A7;&#x30AF;&#x30C8;&#x53C2;&#x52A0;&#x8005;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9023;&#x7D50;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;LPP&#xFF09;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306B;&#x4E00;&#x5BFE;&#x4E00;&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;CP&#xFF09;&#x3078;&#x5408;&#x6210;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3002;&#x4E09;&#x5E83;&#x304F;&#x4F7F;&#x308F;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3001;&#x30C9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x3001;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x304A;&#x3088;&#x3073;ELISA&#x306F;&#x3001;LPP&#x57FA;&#x677F;&#x4E0A;&#x306B;PP&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x63A1;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8131;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x3001;&#x6B8B;&#x308A;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x306E;&#x6B20;&#x5982;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x56FA;&#x4F53;&#x652F;&#x6301;&#x4F53;&#x4E0A;&#x3067;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x30D5;&#x30EA;&#x30FC;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x4EE5;&#x4E0A;LPPS&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; LPPS&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3057;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x884C;&#x5217;&#x3078;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x304C;&#x5F37;&#x5316;&#x51FA;&#x5C55;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x98FD;&#x548C;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x8A66;&#x6599;&#x306E;&#x5E0C;&#x91C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x56DE;&#x907F;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;LPP&#x57FA;&#x677F;&#x3068;&#x56FA;&#x4F53;&#x652F;&#x6301;&#x4F53;&#x4E0A;&#x306B;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;PP&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x5B9F;&#x9A13;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30C7;&#x30B6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3001;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5229;&#x7528;&#xFF1A;&#x30C9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3001;ELISA&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;

&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; (&#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;)&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC774;&#xD6C4; &#xC801;&#xD569; phosphorylated &#xAE30;&#xD310; &#xC900;&#xBE44; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB3C4;&#xC804; &#xC774;&#xB2E4;. Phosphoproteins, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; &#xB610;&#xB294; &#xD654;&#xD559;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xC131; &#xB41C; phosphopeptides&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; phosphorylated &#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xAE30;&#xD310;&#xC740;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xB450; &#xC885;&#xB958;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC774;&#xC810; &#xBC0F; &#xC81C;&#xD55C; &#xC0AC;&#xD56D;. &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC900;&#xBE44;&#xB97C; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC740; &#xAE30;&#xC220;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; phosphoproteins &#xBAA8;&#xBC29; &#xB354; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xC21C;&#xC218; &#xAD00;&#xB828; PP &#xAE30;&#xD310;. &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xC27D;&#xAC8C; &#xB300;&#xB7C9; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xACB0;&#xC815; &#xC694;&#xC778; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB3C4;&#xB85D; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xD560; &#xC218; &#xD569;&#xC131; phosphopeptides &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC7A5;&#xC810;&#xC744; &#xC81C;&#xC2DC;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC9E7;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; vivo&#xC5D0;&#xC11C; PP &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB35C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xD558; &#xACE0; &#xC885;&#xC885; &#xAC00;&#xB09C; &#xD558; &#xACE0; &#xAC00;&#xBCC0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xACE0;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xC5D0; PP &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB0AE;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xB2E4;&#xB978; &#xD589;&#xB82C;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC;. &#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0; &#xC870;&#xB2EC; &#xCCAD;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; &#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB294; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xBD84;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC7A5;&#xC810;&#xC774; &#xACB0;&#xD569;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xD310; &#xC0DD;&#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xACB0; &#xCC30; (IPL) &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xC774;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC77C;&#xB300;&#xC77C; stoichiometry&#xC640; intein&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (CP)&#xB97C; &#xD569;&#xC131; phosphopeptide &#xACB0; &#xCC30; &#xD569;&#xC790; phosphoprotein (LPP://)&#xC758; &#xD615;&#xC131; &#xACB0;&#xACFC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB110;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;, &#xC810; &#xC624; &#xC810; &#xBC30;&#xC5F4;, &#xC11C;&#xCABD; &#xC624; &#xC810; &#xBC0F; ELISA LPP:// &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; PP &#xD65C;&#xB3D9; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xACE0;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. Dephosphorylation&#xB294; &#xB098;&#xBA38;&#xC9C0; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xB610;&#xB294; &#xC778; &#xD2B9;&#xC815; &#xD56D; &#xCCB4;&#xB85C;, &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xBD80;&#xC871;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCE21;&#xC815; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xACE0;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xC5D0; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xBB34;&#xB8CC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; Lpps&#xC758; &#xC774;&#xC810;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. LPPs &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD06C;&#xAC8C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xC77C;&#xAD00;&#xC131; &#xC788;&#xB294; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB41C; &#xD589;&#xB82C;&#xC744; &#xC804;&#xC2DC;. &#xB610;&#xD55C;, &#xCC44;&#xB3C4; &#xC2E0;&#xD638;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xC9C1;&#xB82C; &#xD76C;&#xC11D; &#xD558; &#xC5EC; &#xD53C;&#xD560; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C; LPP:// &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC900;&#xBE44;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC790;&#xC138;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC808;&#xCC28;&#xC640; &#xACE0;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xC5D0; &#xB3D9;&#xC6D0; &#xC815;&#xC9C0;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; PP &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC548;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB514;&#xC790;&#xC778;, &#xC900;&#xBE44; &#xBC0F; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCD9C;&#xD608; phosphoproteins: &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xC560; &#xB780;&#xACFC; &#xC11C; &#xC810; &#xC624; &#xC810; &#xBC30;&#xC5F4; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xACF5;&#xBD80; &#xC624; &#xC810; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;.

El estudio de la especificidad por el sustrato de las prote&#xED;nas fosfatasas (PP) es muy dif&#xED;cil, ya que es dif&#xED;cil preparar un sustrato fosforilado adecuado. Fosfoprote&#xED;nas, fosforilada por una prote&#xED;na quinasa, o fosfop&#xE9;ptidos de s&#xED;ntesis qu&#xED;mica se utilizan sustratos para el PP. Ambos tipos de estos sustratos tienen sus ventajas y limitaciones. Fosfoprote&#xED;nas imitar m&#xE1;s de cerca los sustratos PP fisiol&#xF3;gicamente relevantes, pero su preparaci&#xF3;n es exigente t&#xE9;cnicamente. Fosfop&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos presentan ventajas sobre las prote&#xED;nas, ya que pueden ser f&#xE1;cilmente producidos en grandes cantidades y su secuencia de amino&#xE1;cidos pueden ser dise&#xF1;ados para contener posibles determinantes de la especificidad de sustrato. Sin embargo, los p&#xE9;ptidos cortos son menos &#xF3;ptimo en comparaci&#xF3;n con el PP en vivo y sustratos a menudo muestran vinculante pobres y variable para diferentes matrices, lo que resulta en una baja sensibilidad en el an&#xE1;lisis de la actividad del PP en el soporte s&#xF3;lido. En este trabajo se utilizan la intein mediada por ligaci&#xF3;n prote&#xED;na (IPL) t&#xE9;cnica para generar sustratos para PP, que combina las ventajas de las prote&#xED;nas y p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos en una mol&#xE9;cula. La ligaci&#xF3;n de un fosfop&#xE9;ptido sint&#xE9;tico a una prote&#xED;na portadora intein generado (PC) con un resultados estequiometr&#xED;a de uno a uno en la formaci&#xF3;n de una fosfoprote&#xED;na ligado (LPP). Tres ensayos ampliamente utilizados, matriz dot blot, el Western blot y ELISA fueron empleados para estudiar la actividad del PP en sustratos LPP. Desfosforilaci&#xF3;n se midi&#xF3; mediante la detecci&#xF3;n de la fosforilaci&#xF3;n restante, o falta de ella, con un anticuerpo fosfo-espec&#xED;fico. Los datos muestran la ventaja de la LPP en p&#xE9;ptidos libres en los ensayos sobre soportes s&#xF3;lidos. LPP exhibieron una mayor uni&#xF3;n a las matrices utilizadas en el estudio, lo que mejora significativamente la sensibilidad y la coherencia de los ensayos. Adem&#xE1;s, la saturaci&#xF3;n de la se&#xF1;al fue eludido por diluci&#xF3;n en serie de las muestras de ensayo. Este informe describe los detalles del procedimiento experimental para la preparaci&#xF3;n de LPP sustratos y su uso en ensayos de PP basado en la inmovilizaci&#xF3;n sobre soportes s&#xF3;lidos.

Dise&#xF1;o, preparaci&#xF3;n y utilizaci&#xF3;n de fosfoprote&#xED;nas ligados: un nuevo enfoque para el Estudio de fosfatasas de prote&#xED;nas por la matriz de Dot Blot, ELISA y Western blot

&#x5408;&#x6210;&#x80BD;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7528;&#x4E8E;&#x751F;&#x4EA7;&#x548C;&#x6297;&#x4F53;&#x4EE5;&#x53CA;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4FEE;&#x9970;&#x9176;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E0E;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x907F;&#x5F00;&#x80BD;&#x91CF;&#x5316;&#x548C;&#x6807;&#x51C6;&#x5316;&#x65B9;&#x9762;&#x7684;&#x73B0;&#x6709;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x6311;&#x6218;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E86;&#x751F;&#x4EA7;&#x591A;&#x80BD;&#x9635;&#x5217;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x91C7;&#x7528;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E;&#xFF0C;&#x6D89;&#x53CA;&#x85CF;&#x6709;&#x65E0;&#x529F;&#x7684;&#x7FA7;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x786B;&#x916F;&#x5BF9;&#x6C28;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x901A;&#x8FC7;&#x672C;&#x673A;&#x7684;&#x80BD;&#x952E;&#x4E0E;&#x80BD;&#x8F7D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8054;&#x7CFB;&#x3002;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x8D28;&#x6216;&#x9176;&#x5904;&#x7406;&#x6837;&#x54C1;&#x8FDB;&#x884C;&#x9635;&#x5217;&#x4E0A;&#x6807;&#x51C6;&#x6591;&#x70B9;&#x5668;&#x5177;&#x4E0E;&#x785D;&#x9178;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7D20;&#x819C;&#x548C;&#x514D;&#x75AB;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6B64;&#x6280;&#x672F;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x53EF;&#x91CD;&#x590D;&#x6027;&#xFF0C;&#x5F97;&#x5230;&#x4E86;&#x6539;&#x5584;&#xFF0C;&#x9002;&#x5408;&#x5404;&#x79CD;&#x57FA;&#x4E8E;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E86;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x5305;&#x62EC;&#x6297;&#x539F;&#x51B3;&#x5B9A;&#x7C07;&#x4E0E;&#x7814;&#x7A76;&#x86CB;&#x767D;&#x8FDB;&#x884C;&#x4FEE;&#x6539;&#x3002;

&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x6620;&#x5C04;&#x548C;&#x6FC0;&#x9176;/&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7684;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x5185;&#x542B;&#x80BD;&#x9635;&#x5217;&#x3002;

Synthetic peptides are widely used for production and analysis of antibodies as well as in the study of protein modification enzymes. To circumvent the technical challenges of the existing techniques regarding peptide quantization and normalization, a new method of producing peptide arrays has been developed. This approach utilizes intein-mediated protein ligation that involves linkage of a carrier protein possessing a reactive carboxyl-terminal thioester to a peptide with an amino-terminal cysteine through a native peptide bond. Ligated protein substrates or enzyme-treated samples are arrayed on nitrocellulose membranes with a standard dot-blot apparatus and analyzed by immunoassay. This technique has improved sensitivity and reproducibility, and is suitable for various peptide-based applications. In this report, several experimental procedures including epitope mapping and the study of protein modifications were described.

Intein-mediated peptide arrays for epitope mapping and kinase/phosphatase assays.

Les peptides synth&#xE9;tiques sont largement utilis&#xE9;s pour la production et l&#x26;#39;analyse des anticorps ainsi que dans l&#x26;#39;&#xE9;tude des enzymes de modification des prot&#xE9;ines. Pour contourner les difficult&#xE9;s techniques des techniques existantes en mati&#xE8;re de quantification des peptides et de normalisation, une nouvelle m&#xE9;thode de production de r&#xE9;seaux peptidiques a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;velopp&#xE9;. Cette m&#xE9;thode utilise ligature prot&#xE9;ine int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation qui implique liaison d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine porteuse poss&#xE9;dant une r&#xE9;active carboxyle-terminale &#xE0; un peptide thioester avec une cyst&#xE9;ine amino-terminal par une liaison peptidique natif. Substrats prot&#xE9;iques ligatur&#xE9;es ou trait&#xE9;s aux enzymes &#xE9;chantillons sont dispos&#xE9;s sur des membranes de nitrocellulose avec une norme dot-blot appareils et analys&#xE9; par dosage immunologique. Cette technique a permis d&#x26;#39;am&#xE9;liorer la sensibilit&#xE9; et de reproductibilit&#xE9;, et est adapt&#xE9; pour diverses applications &#xE0; base de peptides. Dans ce rapport, plusieurs proc&#xE9;dures exp&#xE9;rimentales, notamment la cartographie des &#xE9;pitopes et l&#x26;#39;&#xE9;tude des modifications des prot&#xE9;ines ont &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;crits.

Int&#xE9;ine m&#xE9;diation tableaux peptidiques pour la cartographie des &#xE9;pitopes et de la kinase / phosphatase essais

Synthetische Peptide werden zur Produktion und Analyse von Antik&ouml;rpern ebenso wie in der Studie von Protein &Auml;nderung Enzymen eingesetzt. Um die technischen Herausforderungen der vorhandenen Techniken bez&uuml;glich Peptid-Quantisierung und Normalisierung zu umgehen, wurde eine neue Methode zur Herstellung von Peptid-Arrays entwickelt. Dieser Ansatz nutzt Intein-vermitteltes Protein-Verbindung, bei der Verkn&uuml;pfung von einem Permease besitzen eine reaktive Karboxyl--Terminal-Thioester um ein Peptid mit einer amino-Terminal-Cystein durch eine native Peptidbindung. Ligaturen Protein Substrate oder Enzym-behandelten Proben sind gekleidet auf Nitrocellulose-Membranen mit einem standard Dot-Blot-Apparat und von Immunoassay analysiert. Diese Technik wurde verbessert, Sensitivit&auml;t und Reproduzierbarkeit und eignet sich f&uuml;r verschiedene Peptid-basierte Anwendungen. In diesem Bericht wurden verschiedene experimentelle Verfahren einschlie&szlig;lich Epitop Mapping und die Untersuchung von Protein-&Auml;nderungen beschrieben.

Intein-vermitteltes Peptid-Arrays f&uuml;r Epitop Mapping und Kinase/Phosphatase Assays.

Peptidi sintetici sono ampiamente utilizzati per la produzione e l&#39;analisi degli anticorpi, cos&igrave; come lo studio degli enzimi di modificazione della proteina. Per aggirare le sfide tecniche delle tecniche esistenti per quanto riguarda la quantizzazione del peptide e la normalizzazione, &egrave; stato sviluppato un nuovo metodo di produzione di matrici del peptide. Questo approccio utilizza la legatura intein-mediato proteina che coinvolge una proteina carrier, possedendo un tioestere reattiva carbossi-terminale di un peptide con una cisteina amminico-terminale attraverso un legame peptidico nativo del sollevatore. Campioni trattati con enzima o proteina dei substrati sono disposti sulle membrane di nitrocellulosa con un apparato standard dot-blot e analizzati da immunodosaggio. Questa tecnica ha migliorato la sensibilit&agrave; e la riproducibilit&agrave; ed &egrave; adatta per varie applicazioni basate su peptidi. In questa relazione, sono state descritte diverse procedure sperimentali tra cui epitope mapping e lo studio delle modificazioni della proteina.

Matrici Intein-mediata del peptide per saggi di mappatura e chinasi/fosfatasi epitopo.

&#x5408;&#x6210;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x5E83;&#x304F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4FEE;&#x98FE;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x307B;&#x304B;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x7523;&#x751F;&#x3068;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x91CF;&#x5B50;&#x5316;&#x3068;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x65E2;&#x5B58;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x7684;&#x8AB2;&#x984C;&#x3092;&#x56DE;&#x907F;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x304C;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x5929;&#x7136;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x672B;&#x7AEF;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x672B;&#x7AEF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x57FA;&#x8CEA;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9175;&#x7D20;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x305F;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x6E96;&#x306E;&#x30C9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x88C5;&#x7F6E;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x30CB;&#x30C8;&#x30ED;&#x30BB;&#x30EB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B9;&#x819C;&#x4E0A;&#x306B;&#x914D;&#x5217;&#x3068;&#x514D;&#x75AB;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x5831;&#x544A;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x4FEE;&#x98FE;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306A;&#x624B;&#x9806;&#x304C;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;/&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;

&#xD569;&#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xBC0F; &#xC218;&#xC815; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB110;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC591;&#xC790;&#xD654; &#xBC0F; &#xC815;&#xADDC;&#xD654;&#xC5D0; &#xAD00;&#xD55C; &#xAE30;&#xC874; &#xAE30;&#xC220;&#xC758; &#xAE30;&#xC220;&#xC801;&#xC778; &#xB3C4;&#xC804;&#xC744; &#xD68C;&#xD53C;, &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC5B4;&#xB808;&#xC774; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC774;&#xB807;&#xAC8C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xC18C;&#xC9C0; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xACFC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xBC18;&#xC751; carboxyl &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; thioester &#xCE90;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD569;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xD310; &#xB610;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C; &#xCC98;&#xB9AC; &#xC0D8;&#xD50C; &#xD45C;&#xC900; &#xC810; &#xC624; &#xC810; &#xAE30;&#xAD6C;&#xC640; &#xB2C8;&#xD2B8;&#xB85C; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC9D3;&#xACE0; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; immunoassay&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC7AC;&#xD604;&#xC131;, &#xAC1C;&#xC120; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;-&#xAE30;&#xBC18; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0; &#xD53C;&#xD1A0; &#xD504; &#xB9E4;&#xD551; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC815; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC808;&#xCC28; &#xC124;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4;.

Epitope &#xB9E4;&#xD551; &#xBC0F; &#xD0A4;/&#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; Intein &#xC911;&#xC7AC; &#xBC30;&#xC5F4;.

Los p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos se utilizan ampliamente para la producci&#xF3;n y el an&#xE1;lisis de anticuerpos, as&#xED; como en el estudio de las enzimas de modificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas. Para sortear los desaf&#xED;os t&#xE9;cnicos de las t&#xE9;cnicas existentes en materia de cuantificaci&#xF3;n de p&#xE9;ptidos y la normalizaci&#xF3;n, un nuevo m&#xE9;todo de producci&#xF3;n de matrices de p&#xE9;ptidos se ha desarrollado. Este enfoque utiliza intein mediada por ligaci&#xF3;n prote&#xED;na que implica la vinculaci&#xF3;n de una prote&#xED;na transportadora que posee un reactivo carboxilo-terminal tio&#xE9;ster a un p&#xE9;ptido con una ciste&#xED;na amino-terminal a trav&#xE9;s de un enlace pept&#xED;dico nativo. Ligaron sustratos proteicos o muestras tratados con enzimas est&#xE1;n dispuestos sobre membranas de nitrocelulosa con un est&#xE1;ndar dot-blot aparato y se analizaron mediante inmunoensayo. Esta t&#xE9;cnica ha mejorado la sensibilidad y reproducibilidad, y es adecuado para diversas aplicaciones basadas en p&#xE9;ptidos. En este informe, varios procedimientos experimentales como ep&#xED;topo cartograf&#xED;a y el estudio de las modificaciones de la prote&#xED;na se ha descrito.

Intein mediadas por matrices de p&#xE9;ptidos para la asignaci&#xF3;n de ep&#xED;topo y ensayos quinasa / fosfatasa

&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E; (IPL) &#x91C7;&#x7528;&#x5185;&#x542B;&#x521B;&#x5EFA;&#x62E5;&#x6709;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5230;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6216;&#x80BD;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x901A;&#x8FC7;&#x672C;&#x673A;&#x7684;&#x80BD;&#x952E;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x786B;&#x916F;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x8FDB;&#x884C;&#x9694;&#x79BB;&#x548C;&#x6807;&#x7B7E;&#x4F7F;&#x7528;&#x5408;&#x6210;&#x77ED;&#x80BD;&#x85CF;&#x6709;&#x8367;&#x5149;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F88;&#x5BB9;&#x6613;&#x7528;&#x4E8E;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x5229;&#x76CA;&#xFF0C;&#x800C;&#x975E;&#x7279;&#x5B9A;&#x5316;&#x5B66;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x7F3A;&#x70B9;&#x4E0D; C &#x603B;&#x7AD9;&#x5171;&#x8F6D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7AE0;&#x8FD8;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x5BF9;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5288;&#x88C2;&#x548C;&#x7ED3;&#x624E;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x53C2;&#x6570;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E00;&#x822C;&#x6027;&#x5BA1;&#x67E5;&#x3002;

&#x7AD9;&#x70B9;&#x7279;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x6807;&#x8BB0;&#x5185;&#x542B;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x624E;&#x3002;

Intein-mediated protein ligation (IPL) employs an intein to create a protein possessing a C-terminal thioester that can be ligated to a protein or peptide with an amino-terminal cysteine via a native peptide bond. Here we present a procedure to conduct isolation and labeling of recombinant proteins expressed in E. coli using synthetic short peptides possessing a fluorescent moiety. This approach can be readily utilized for site-specific conjugation of a fluorophore to the C-terminus of a protein of interest, without the drawback of non-specific chemical labeling. This chapter also gives a general review of the critical parameters of intein-mediated cleavage and ligation reactions.

Site-specific protein labeling by intein-mediated protein ligation.

Ligature prot&#xE9;ine int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation (IPL) emploie une int&#xE9;ine pour cr&#xE9;er une prot&#xE9;ine poss&#xE9;dant un thioester C-terminal qui peut &#xEA;tre ligatur&#xE9; &#xE0; une prot&#xE9;ine ou un peptide avec une cyst&#xE9;ine amino-terminal par l&#x26;#39;interm&#xE9;diaire d&#x26;#39;une liaison peptidique natif. Ici, nous pr&#xE9;sentons une proc&#xE9;dure pour effectuer l&#x26;#39;isolement et l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage des prot&#xE9;ines recombinantes exprim&#xE9;es dans E. coli en utilisant des peptides courts synth&#xE9;tiques poss&#xE9;dant un groupement fluorescent. Cette approche peut &#xEA;tre facilement utilis&#xE9; pour le site sp&#xE9;cifique de conjugaison d&#x26;#39;un fluorophore &#xE0; l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; C-terminale d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t, sans l&#x26;#39;inconv&#xE9;nient d&#x26;#39;&#xE9;tiquetage des produits chimiques non-sp&#xE9;cifique. Ce chapitre donne &#xE9;galement un aper&#xE7;u g&#xE9;n&#xE9;ral des param&#xE8;tres critiques de int&#xE9;ine clivage m&#xE9;di&#xE9; et r&#xE9;actions de ligature.

Site sp&#xE9;cifique marquage des prot&#xE9;ines par ligature des prot&#xE9;ines int&#xE9;ine &#xE0; m&#xE9;diation

Intein-vermitteltes Protein Ligaturen (IPL) besch&auml;ftigt ein Intein erstellen ein Protein mit einer C-terminalen Thioester, die zu einem Protein oder Peptid mit einem Cystein amino-Terminal &uuml;ber eine native Peptidbindung eine Ligatur werden kann. Hier pr&auml;sentieren wir ein Verfahren zur Trennung und Kennzeichnung von rekombinanten Proteinen in E. Coli mit synthetischen kurze Peptide besitzen eine fluoreszierende Gruppe ausgedr&uuml;ckt durchf&uuml;hren. Dieser Ansatz kann leicht f&uuml;r standortspezifische Konjugation von einem Fluorophore zu den C-Terminus eines Proteins von Interesse, ohne den Nachteil der unspezifischen chemischen Bezeichnung genutzt werden. Dieses Kapitel enth&auml;lt auch eine allgemeine &Uuml;berpr&uuml;fung der kritischen Parameter Intein-vermitteltes Spaltung und Ligaturen Reaktionen.

Standortspezifische Protein Kennzeichnung von Intein-vermitteltes Protein Ligaturen.

Legatura proteina Intein-mediata (IPL) impiega un intein per creare una proteina che possiede un tioestere C-terminale che pu&ograve; essere legato ad una proteina o peptide con una cisteina amminico-terminale tramite un legame peptidico nativo. Presentiamo qui una procedura per condurre l&#39;isolamento e l&#39;etichettatura delle proteine ricombinanti espresse in e. coli usando peptidi sintetici brevi che possiedono un gruppo fluorescente. Questo approccio pu&ograve; essere facilmente utilizzato per coniugazione site-specific di un fluoroforo al C-terminale di una proteina di interesse, senza l&#39;inconveniente di contrassegno chimico non specifico. Questo capitolo fornisce anche una revisione generale dei parametri critici di clivaggio mediato intein e reazioni di legatura.

Site-specific protein etichettatura di legatura di proteina intein-mediata.

&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;IPL&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x5929;&#x7136;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x672B;&#x7AEF;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306B;&#x9023;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;C&#x672B;&#x7AEF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30A8;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EB;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x63A1;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x90E8;&#x5206;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x5408;&#x6210;&#x77ED;&#x3044;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5B9F;&#x65BD;&#x3059;&#x308B;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x975E;&#x200B;&#x200B;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x6A19;&#x8B58;&#x306E;&#x6B20;&#x70B9;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;C&#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x306E;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x5229;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x7AE0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x5A92;&#x4ECB;&#x5207;&#x65AD;&#x53CA;&#x3073;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30EC;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B2;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6A19;&#x8B58;

Intein &#xC911;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0; &#xCC30; (IPL) &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB610;&#xB294; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD9C;&#xD608; &#xC218; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; thioester&#xB97C; &#xBCF4;&#xC720; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; intein&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD604;&#xC7AC; &#xACA9;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xD615;&#xAD11; moiety &#xC18C;&#xC9C0; &#xD569;&#xC131; &#xC9E7;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB77C;&#xBCA8; &#xCC98;&#xB9AC; &#xC808;&#xCC28;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xD654;&#xD559; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC758; &#xB2E8;&#xC810; &#xC5C6;&#xC774; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC0AC;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; C-&#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0; fluorophore&#xC758; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD65C;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC774;&#xC6A9;&#xD558;&#xC2E4; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB610;&#xD55C; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xC808;&#xB2E8;, &#xACB0; &#xCC30; &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218;&#xC758; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xAC80;&#xD1A0;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; intein &#xC911;&#xC7AC; &#xACB0; &#xCC30;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB77C;&#xBCA8;.

Intein mediada por ligaci&#xF3;n prote&#xED;na (IPL) emplea una intein para crear una prote&#xED;na que posee un tio&#xE9;ster C-terminal que puede ser ligado a una prote&#xED;na o p&#xE9;ptido con una ciste&#xED;na amino-terminal a trav&#xE9;s de un enlace pept&#xED;dico nativo. Aqu&#xED; se presenta un procedimiento para llevar a cabo el aislamiento y el etiquetado de las prote&#xED;nas recombinantes expresadas en E. coli usando p&#xE9;ptidos sint&#xE9;ticos cortos que poseen un resto fluorescente. Este enfoque puede utilizarse f&#xE1;cilmente para el sitio-espec&#xED;fica conjugaci&#xF3;n de un fluor&#xF3;foro para el C-terminal de una prote&#xED;na de inter&#xE9;s, sin el inconveniente de etiquetado qu&#xED;mico no espec&#xED;fica. En este cap&#xED;tulo tambi&#xE9;n ofrece una revisi&#xF3;n general de los par&#xE1;metros cr&#xED;ticos de intein mediada por divisi&#xF3;n y reacciones de ligaci&#xF3;n.

Sitio espec&#xED;fico de etiquetado de prote&#xED;nas por la ligadura de prote&#xED;nas mediada por intein

&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x5149;&#x5B66;&#x5206;&#x6790;&#x548C;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x5DF2;&#x6210;&#x4E3A;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x4E00;&#x6B65;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6807;&#x8BB0;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x548C;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x548C;&#x968F;&#x540E;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x4E0E; Sfp phosphopantetheinyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; (Sfp &#x5408;) &#x4ECE;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;&#x5728;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7684;&#x793A;&#x4F8B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x817A;&#x75C5;&#x6BD2;&#x86CB;&#x767D; E3 14.7 K (E14.7) &#x4F5C;&#x4E3A;&#x8868;&#x793A;&#x8367;&#x5149;&#x9776;&#x5411;&#x4E09;&#x65B9;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x80BD;&#x6807;&#x8BB0;&#x548C;&#x51E0;&#x4E01;&#x8D28;&#x7ED3;&#x5408;&#x57DF;&#x3002;&#x6B64;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5141;&#x8BB8;&#x5FEB;&#x901F;&#x5206;&#x79BB;&#x539F;&#x6CB9;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x91CD;&#x7EC4;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x88C2;&#x89E3;&#x901A;&#x8FC7;&#x5355;&#x4E2A;&#x7532;&#x58F3;&#x7D20;&#x7684;&#x5217;&#x3002;Sfp &#x5408;&#x9176;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x8D34;&#x6807;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x8F6D;&#x5BF9;&#x8F85;&#x9176; A-SH (CoA-SH) &#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x7684;&#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x80BD;&#x6807;&#x8BB0;&#x901A;&#x8FC7; phosphopantetheinyl &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684; E14.7 &#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x4E0E;&#x8367;&#x5149;&#x6210;&#x50CF;&#x4EEA;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;&#x968F;&#x540E;&#x7528;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x67D3;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x3002;

&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E0E; Sfp phosphopantetheinyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

Fluorescent tagging of proteins has become a critical step in optical analysis of protein function in vitro and in living cells. Here we describe a two-tag system for expression and isolation of a protein of interest from Escherichia coli and subsequent site-specific fluorescent labeling with Sfp phosphopantetheinyl transferase (Sfp synthase). In the example presented, adenoviral protein E3-14.7 K (E14.7) was expressed as a tripartite fusion protein with a fluorophore-targeting peptide tag and a chitin-binding domain. This system allows for rapid isolation of the recombinant fusion protein from crude bacterial cell lysate via a single chitin column. Sfp synthase-mediated labeling with fluorophore conjugated to coenzyme A-SH (CoA-SH) resulted in covalent attachment of a fluorescent dye to a specific residue of the peptide tag via a phosphopantetheinyl linker. The fluorescently labeled E14.7 fusion protein was analyzed with a fluorescence imager and subsequently transfected into mammalian cells for imaging with a fluorescence microscope.

Fluorescent site-specific labeling of Escherichia coli expressed proteins with Sfp phosphopantetheinyl transferase.

Marquage fluorescent des prot&#xE9;ines est devenu une &#xE9;tape cruciale dans l&#x26;#39;analyse optique de la fonction des prot&#xE9;ines in vitro et dans des cellules vivantes. Nous d&#xE9;crivons ici un syst&#xE8;me &#xE0; deux mots-cl&#xE9; pour l&#x26;#39;expression et l&#x26;#39;isolement d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t &#xE0; partir d&#x26;#39;Escherichia coli et ult&#xE9;rieure sp&#xE9;cifique au site marquage fluorescent avec Sfp phosphopant&#xE9;th&#xE9;inyle transf&#xE9;rase (synthase Sfp). Dans l&#x26;#39;exemple pr&#xE9;sent&#xE9;, E3-14.7 prot&#xE9;ine ad&#xE9;novirale K (E14.7) a &#xE9;t&#xE9; exprim&#xE9;e comme une prot&#xE9;ine de fusion tripartite avec une &#xE9;tiquette fluorophore-peptide ciblant et un domaine de liaison &#xE0; la chitine. Ce syst&#xE8;me permet d&#x26;#39;isoler rapide de la prot&#xE9;ine de fusion recombinante &#xE0; partir du lysat cellulaire brut bact&#xE9;rienne par l&#x26;#39;interm&#xE9;diaire d&#x26;#39;une colonne de chitine unique. Sfp synthase m&#xE9;di&#xE9;e marquage avec un fluorophore conjugu&#xE9; &#xE0; la coenzyme A-SH (CoA-SH) entra&#xEE;n&#xE9; fixation covalente d&#x26;#39;un colorant fluorescent &#xE0; un r&#xE9;sidu sp&#xE9;cifique de l&#x26;#39;&#xE9;tiquette peptidique par l&#x26;#39;interm&#xE9;diaire d&#x26;#39;un lieur phosphopant&#xE9;th&#xE9;inyle. Le marqu&#xE9; par fluorescence E14.7 prot&#xE9;ine de fusion a &#xE9;t&#xE9; analys&#xE9;e avec un imageur de fluorescence et par la suite transfect&#xE9; dans des cellules de mammif&#xE8;res pour l&#x26;#39;imagerie avec un microscope &#xE0; fluorescence.

Fluorescent &#xE9;tiquetage sp&#xE9;cifique &#xE0; un site d&#x26;#39;Escherichia coli prot&#xE9;ines exprim&#xE9;es avec Sfp PHOSPHOPANT&#xC9;TH&#xC9;INYL TRANSF&#xC9;RASE

Fluoreszierende Markierung von Proteinen ist ein entscheidender Schritt bei optischen Analyse der Proteinfunktion in-vitro- und in lebenden Zellen geworden. Hier beschreiben wir eine zwei-Tag-System f&uuml;r Ausdruck und Isolierung eines Proteins des Interesses von Escherichia coli und nachfolgende standortspezifische Leuchtstofflampen, die Kennzeichnung mit Sfp-Phosphopantetheinyl-Transferase (Sfp-Synthase). Im Beispiel dargestellt wurde adenoviral Protein E3-14.7 K (E14.7) ausgedr&uuml;ckt als eine dreigliedrige Fusionsprotein mit einem Fluorophor-targeting Peptid-Tag und einem Chitin-bindende Dom&auml;ne. Dieses System erm&ouml;glicht schnelle Isolierung der rekombinanten Fusionsprotein aus Roh&ouml;l bakterielle Zelle lysate &uuml;ber eine einzelne Chitin-Spalte. SFP, die Synthase-vermittelte Kennzeichnung mit Fluorophor, Coenzym A-SH (CoA-SH) konjugiert f&uuml;hrte zu kovalente Anlage eines fluoreszierenden Farbstoffes auf bestimmte R&uuml;ckst&auml;nde des Peptid-Tags &uuml;ber einen Phosphopantetheinyl-Linker. Der Leuchtstoff beschriftetem E14.7-Fusionsprotein wurde mit einem Fluoreszenz-Imager analysiert und anschlie&szlig;end die in S&auml;ugetierzellen f&uuml;r Imaging mit einem Fluoreszenzmikroskop transfected.

Fluoreszierende standortspezifische Kennzeichnung von Escherichia coli ausgedr&uuml;ckt Proteine mit Sfp-Phosphopantetheinyl-Transferase.

Fluorescente tagging delle proteine &egrave; diventata un passaggio fondamentale nella analisi ottica di funzione della proteina in vitro e in cellule viventi. Qui descriviamo un sistema due-tag per l&#39;espressione e l&#39;isolamento di una proteina di interesse da parte di Escherichia coli e successive fluorescenti site-specific di etichettatura con Sfp phosphopantetheinyl trasferasi (Sfp sintasi). Nell&#39;esempio presentato, proteine adenovirali E3-14,7 K (E14.7) &egrave; stata espressa come una proteina di fusione tripartito con un fluoroforo-targeting del peptide tag e un dominio di chitina-associazione. Questo sistema permette rapido isolamento della proteina di fusione ricombinante da grezzo cellula batterica lisato tramite una colonna singola chitina. SFP sintasi-mediata etichettatura con fluoroforo coniugato a coenzima A-SH (CoA-SH) portato in attacco covalente di un colorante fluorescente di un residuo specifico del tag del peptide tramite un linker phosphopantetheinyl. La proteina di fusione E14.7 fluorescente contrassegnata &egrave; stata analizzata con un imager di fluorescenza e successivamente transfected nelle cellule di mammiferi per l&#39;imaging con un microscopio a fluorescenza.

Etichettatura fluorescente site-specific di Escherichia coli espressi proteine con Sfp phosphopantetheinyl trasferasi.

&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x3067;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5149;&#x5B66;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;SFP phosphopantetheinyl&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;SFP&#x30B7;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF09;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x304B;&#x3089;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3068;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x30BF;&#x30B0;&#xB7;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x63D0;&#x793A;&#x306E;&#x4F8B;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;E3-14.7 K&#xFF08;E14.7&#xFF09;&#x306F;&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x6A19;&#x7684;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30BF;&#x30B0;&#x3068;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x4E09;&#x8005;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x30AB;&#x30E9;&#x30E0;&#x3092;&#x7D4C;&#x7531;&#x3057;&#x3066;&#x539F;&#x6CB9;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BB;&#x30FC;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8FC5;&#x901F;&#x306A;&#x5206;&#x96E2;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B6;&#x30A4;&#x30E0;A-SH&#xFF08;&#x30A2;&#x30B7;&#x30EB;CoA-SH&#xFF09;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x3092;&#x5099;&#x3048;&#x305F;SFP&#x30B7;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x5A92;&#x4ECB;&#x6A19;&#x8B58;phosphopantetheinyl&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x30BF;&#x30B0;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x8272;&#x7D20;&#x306E;&#x5171;&#x6709;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;E14.7&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x86CD;&#x5149;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x3067;&#x89E3;&#x6790;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3068;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30C8;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;SFP Phosphopantetheinyl&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;

&#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD0DC;&#xADF8; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xB2A5; &#xCCB4; &#xC678;&#xC758; &#xAD11;&#xD559; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xB420; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD45C;&#xD604;&#xACFC; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xBC0F; Sfp phosphopantetheinyl &#xC804;&#xC774; (Sfp synthase)&#xB85C; &#xD6C4;&#xC18D; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xD615;&#xAD11;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC0AC;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACA9;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; 2 &#xD0DC;&#xADF8; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xC608;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; adenoviral &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; E3 14.7 K (E14.7) fluorophore &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xB178;&#xC0AC; &#xC815; &#xD4E8;&#xC804; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC640; &#xD2F4; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;. &#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC740; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD2F4; &#xC5F4; &#xD1B5;&#xD574; lysate &#xC6D0;&#xC720; &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xC735;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC2E0;&#xC18D;&#xD55C; &#xACA9;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Sfp &#xCF54;&#xC5D4;&#xC790;&#xC784; A-SH (CoA-SH)&#xC5D0; &#xD3EC;&#xB974;&#xD22C;&#xAC08;&#xC5B4; fluorophore&#xC640; &#xB77C;&#xBCA8; synthase &#xC911;&#xC7AC; phosphopantetheinyl &#xB9C1;&#xCEE4;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xBB3C;&#xC9C8;&#xC744; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC758; &#xACF5;&#xC720; &#xCCA8;&#xBD80; &#xD30C;&#xC77C;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC;. &#xBD99;&#xC77C; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xB41C; E14.7 &#xC735;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD615;&#xAD11; &#xC601;&#xC0C1; &#xBD84;&#xC11D; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xADF8; &#xD6C4; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xD398;.

&#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xB77C;&#xBCA8; Sfp phosphopantetheinyl&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD45C;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4;.

Marcado fluorescente de prote&#xED;nas se ha convertido en un paso cr&#xED;tico en el an&#xE1;lisis &#xF3;ptico de la funci&#xF3;n de prote&#xED;nas in vitro y en c&#xE9;lulas vivas. Aqu&#xED; se describe un sistema de dos etiqueta para la expresi&#xF3;n y el aislamiento de una prote&#xED;na de inter&#xE9;s a partir de E. coli y posterior sitio-espec&#xED;fico de etiquetado fluorescente con SFP phosphopantetheinyl transferasa (sintasa SFP). En el ejemplo presentado, E3-14.7 prote&#xED;na adenov&#xED;rico K (E14.7) se expres&#xF3; como una prote&#xED;na de fusi&#xF3;n tripartita con una etiqueta fluor&#xF3;foro segmentaci&#xF3;n p&#xE9;ptido y un dominio de uni&#xF3;n a la quitina. Este sistema permite el aislamiento r&#xE1;pido de la prote&#xED;na de fusi&#xF3;n recombinante a partir de lisado bruto c&#xE9;lula bacteriana a trav&#xE9;s de una columna de quitina clave. Sfp sintasa mediada etiquetado con fluor&#xF3;foro conjugada con coenzima A-SH (CoA-SH) dio lugar a la uni&#xF3;n covalente de un colorante fluorescente a un residuo espec&#xED;fico de la etiqueta de p&#xE9;ptido a trav&#xE9;s de un enlazador phosphopantetheinyl. La marcada con fluorescencia E14.7 prote&#xED;na de fusi&#xF3;n se analiz&#xF3; con un reproductor de im&#xE1;genes de fluorescencia y posteriormente transfectadas en c&#xE9;lulas de mam&#xED;fero para obtener im&#xE1;genes con un microscopio de fluorescencia.

De marcaje fluorescente espec&#xED;fica del sitio de Escherichia coli prote&#xED;nas expresadas con Phosphopantetheinyl Sfp transferasa

&#x7279;&#x522B;&#x91CD;&#x89C6;&#x4E2A;&#x522B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5316;&#x5B66;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x8868;&#x793A;&#x4E00;&#x79CD;&#x529F;&#x80FD;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7814;&#x7A76;&#x548C;&#x64CD;&#x7EB5;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x5B83;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x6210;&#x50CF;&#x7B80;&#x5355;&#x3001; &#x53EF;&#x9760;&#x548C;&#x591A;&#x529F;&#x80FD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x5316;&#x5B66;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x63A2;&#x6D4B;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6F5C;&#x5728;&#x7F3A;&#x70B9;&#x662F;&#x4ECE;&#x672A;&#x53CD;&#x5E94;&#x6216; nonspecifically &#x7ED1;&#x5B9A;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x80CC;&#x666F;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x548C;&#x5E94;&#x7528;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x8367;&#x5149;&#x63A2;&#x9488;&#x6807;&#x8BB0;&#x5BF9;&#x9F50;&#x6807;&#x8BB0;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0;&#x662F;&#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x4E0E; benzylguanine &#x884D;&#x751F;&#x7269;&#x53CD;&#x5E94;&#x4EBA;&#x4F53;&#x4FEE;&#x590D;&#x86CB;&#x767D; O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (hAGT) &#x5DE5;&#x7A0B;&#x5907;&#x9009;&#x6848;&#x6587;&#x3002;&#x8BB0;&#x8005;&#x7EC4;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x82C4;&#x57FA;&#x7ED3;&#x6784;&#x6210;&#x4E3A;&#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x5145;&#x5F53;&#x79BB;&#x5F00;&#x7EC4;&#x7684;&#x9E1F;&#x560C;&#x5464;&#x3002;&#x6DEC;&#x706B;&#x4E0A;&#x7684;&#x9E1F;&#x560C;&#x5464;&#x7EC4;&#x7EB3;&#x5165;&#x786E;&#x4FDD; benzylguanine &#x63A2;&#x9488;&#x53D8;&#x5F97;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x53EA;&#x6709;&#x540E;&#x8D34;&#x6807;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C06;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4F7F;&#x7528;&#x514D;&#x6D17;-&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x8868;&#x9762;&#x7684;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C; (EGFR) &#x878D;&#x5408;&#x5230;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0;&#x6807;&#x7B7E;&#x548C;&#x76F4;&#x63A5;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x7684;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0; &beta;-&#x86CB;&#x767D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x88C2;&#x89E3;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x5185;&#x6DEC;&#x706B;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6709;&#x7279;&#x70B9;&#x5FEB;&#x901F;&#x6807;&#x8BB0;&#x5BF9;&#x9F50;&#x6807;&#x8BB0;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A; SNAP(f)&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x4E2D; benzylguanine &#x57FA;&#x677F;&#x5BF9;&#x5176;&#x53CD;&#x5E94;&#x6027;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4E86; 10 &#x500D;&#x7684;&#x53D8;&#x4F53;&#x3002;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;SNAP(f) &#x548C;&#x8367;&#x5149;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x6781;&#x5927;&#x5730;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E86;&#x80CC;&#x666F;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x548C;&#x6210;&#x50CF;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4F7F;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x65F6;&#x7A7A;&#x8C03;&#x67E5;&#x3002;

&#x53D1;&#x5C55;&#x7BA1;&#x7406;&#x5355;&#x5143;&#x6807;&#x8BB0;&#x8367;&#x5149;&#x63A2;&#x9488;&#x7684;&#x514D;&#x6D17;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6210;&#x50CF;&#x3002;

The ability to specifically attach chemical probes to individual proteins represents a powerful approach to the study and manipulation of protein function in living cells. It provides a simple, robust and versatile approach to the imaging of fusion proteins in a wide range of experimental settings. However, a potential drawback of detection using chemical probes is the fluorescence background from unreacted or nonspecifically bound probes. In this report we present the design and application of novel fluorogenic probes for labeling SNAP-tag fusion proteins in living cells. SNAP-tag is an engineered variant of the human repair protein O(6)-alkylguanine-DNA alkyltransferase (hAGT) that covalently reacts with benzylguanine derivatives. Reporter groups attached to the benzyl moiety become covalently attached to the SNAP tag while the guanine acts as a leaving group. Incorporation of a quencher on the guanine group ensures that the benzylguanine probe becomes highly fluorescent only upon labeling of the SNAP-tag protein. We describe the use of intramolecularly quenched probes for wash-free labeling of cell surface-localized epidermal growth factor receptor (EGFR) fused to SNAP-tag and for direct quantification of SNAP-tagged Î²-tubulin in cell lysates. In addition, we have characterized a fast-labeling variant of SNAP-tag, termed SNAP(f), which displays up to a tenfold increase in its reactivity towards benzylguanine substrates. The presented data demonstrate that the combination of SNAP(f) and the fluorogenic substrates greatly reduces the background fluorescence for labeling and imaging applications. This approach enables highly sensitive spatiotemporal investigation of protein dynamics in living cells.

Development of SNAP-tag fluorogenic probes for wash-free fluorescence imaging.

La capacit&#xE9; &#xE0; fixer des sondes chimiques sp&#xE9;cifiquement &#xE0; des prot&#xE9;ines individuelles repr&#xE9;sente une approche puissante pour l&#x26;#39;&#xE9;tude et la manipulation de la fonction des prot&#xE9;ines dans les cellules vivantes. Il fournit une approche simple, robuste et polyvalent pour l&#x26;#39;imagerie des prot&#xE9;ines de fusion dans un large &#xE9;ventail de param&#xE8;tres exp&#xE9;rimentaux. Cependant, un inconv&#xE9;nient potentiel de d&#xE9;tection en utilisant des sondes chimiques est le fond de fluorescence des sondes qui n&#x26;#39;ont pas r&#xE9;agi ou non sp&#xE9;cifique li&#xE9;. Dans ce rapport, nous pr&#xE9;sentons la conception et l&#x26;#39;application de nouvelles sondes fluorog&#xE8;nes pour l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage des prot&#xE9;ines de fusion SNAP-tag dans les cellules vivantes. SNAP-tag est une variante de l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie humaine prot&#xE9;ine de r&#xE9;paration de O (6)-alkylguanine-ADN alkyltransf&#xE9;rase (hAGT) qui r&#xE9;agit de mani&#xE8;re covalente avec des d&#xE9;riv&#xE9;s benzylguanines. Groupes rapporteurs attach&#xE9;s &#xE0; la fraction benzyle deviennent de mani&#xE8;re covalente &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;tiquette SNAP tandis que les actes guanine un groupe partant. L&#x26;#39;incorporation d&#x26;#39;un extincteur sur le groupe guanine assure que la sonde benzylguanine devient tr&#xE8;s fluorescente seulement sur l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage de la prot&#xE9;ine SNAP-tag. Nous d&#xE9;crivons l&#x26;#39;utilisation de sondes intramol&#xE9;culaire tremp&#xE9;s pour le lavage sans &#xE9;tiquetage de la cellule de croissance du r&#xE9;cepteur du facteur de surface localis&#xE9;e &#xE9;pidermique (EGFR) fusionn&#xE9;e &#xE0; la SNAP-tag et pour la quantification directe de la SNAP-&#xE9;tiquet&#xE9; &#x3B2;-tubuline dans les lysats cellulaires. En outre, nous avons caract&#xE9;ris&#xE9; une variante rapide &#xE9;tiquetage de SNAP-tag, SNAP appel&#xE9; (f), qui affiche jusqu&#x26;#39;&#xE0; un d&#xE9;cuplement de sa r&#xE9;activit&#xE9; vis &#xE0; vis des substrats benzylguanines. Les donn&#xE9;es pr&#xE9;sent&#xE9;es d&#xE9;montrent que la combinaison de SNAP (f) et les substrats fluorog&#xE8;nes r&#xE9;duit consid&#xE9;rablement la fluorescence de fond pour les applications d&#x26;#39;&#xE9;tiquetage et d&#x26;#39;imagerie. Cette approche permet tr&#xE8;s sensible enqu&#xEA;te spatio-temporelle de la dynamique des prot&#xE9;ines dans les cellules vivantes.

D&#xE9;veloppement de SNAP-tag sondes fluorog&#xE8;nes pour lavage sans imagerie par fluorescence

Die F&auml;higkeit, einzelne Proteine spezifisch chemische Sonden beimessen stellt einen leistungsf&auml;higen Ansatz f&uuml;r das Studium und die Manipulation der Proteinfunktion in lebenden Zellen dar. Es bietet einen einfachen, robusten und vielseitigen Ansatz um die Bildgebung von Fusionsproteinen in eine Vielzahl von experimentellen Einstellungen. Ein potenzieller Nachteil der chemische Sonden-Erkennung ist jedoch die Fluoreszenz-Hintergrund von Spurenverunreinigungen oder nonspecifically gebundenen Sonden. In diesem Bericht, dass pr&auml;sentieren wir die Gestaltung und Anwendung des Romans Sonden Fluorogenic zum Beschriften von SNAP-Tag Schmelzverfahrensproteine in lebenden Zellen. SNAP-Tag ist eine ver&auml;nderte Variante des die Reparaturen von Menschenhand Protein O 6-Alkylguanine-DNA Alkyltransferase (hAGT), die kovalent mit Benzylguanine Derivate reagiert. Reporter Gruppen an der Benzyl-Gruppe angeschlossen werden um das SNAP-Tag kovalent gebunden, w&auml;hrend die Guanin als verlassen Gruppe verh&auml;lt. Aufnahme von einem Quencher auf die Guanin-Gruppe sorgt daf&uuml;r, dass die Benzylguanine-Sonde stark fluoreszierende erst mit Kennzeichnung des Proteins SNAP-Tag wird. Wir beschreiben die Verwendung von intramolecularly verg&uuml;teten Sonden f&uuml;r Waschanlagen-freie Kennzeichnung von Zelle Oberfl&auml;che lokalisierte epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) verschmolzen SNAP-Tag und direkte Quantifizierung des &beta;-Tubulin in Zelllysate, SNAP-markiert. Dar&uuml;ber hinaus haben wir eine schnell-beschriften-Variante des SNAP-Tag, genannt SNAP(f), die bis zu verzehnfachen in seiner Reaktionsf&auml;higkeit gegen&uuml;ber dem Benzylguanine Substrate zeigt bezeichnet. Die pr&auml;sentierten Daten zeigen, dass die Kombination von SNAP(f) und die Fluorogenic Substrate der Hintergrundfluoreszenz zum Beschriften und imaging-Anwendungen erheblich reduziert. Dieser Ansatz erm&ouml;glicht hochsensiblen raumzeitliche Untersuchung von Protein-Dynamik in lebenden Zellen.

Entwicklung von SNAP-Tag Fluorogenic Sonden f&uuml;r Waschanlagen-freie Fluoreszenz-Imaging.

La possibilit&agrave; di collegare in particolare sonde chimiche di singole proteine rappresenta un potente approccio allo studio e alla manipolazione di funzione della proteina in cellule viventi. Esso fornisce un approccio semplice, robusto e versatile per l&#39;imaging delle proteine di fusione in una vasta gamma di impostazioni sperimentali. Tuttavia, un potenziale svantaggio di rilevamento utilizzando sonde chimiche &egrave; lo sfondo di fluorescenza da sonde non reagiti o vincolate. In questa relazione che vi presentiamo la progettazione e l&#39;applicazione del romanzo fluorogenic sonde per l&#39;etichettatura di proteine di fusione SNAP-tag in cellule viventi. SNAP-tag &egrave; una variante di ingegneria della proteina umana riparazione O (6) - alchilguanina - DNA alchiltransferase (hAGT) che reagisce covalentemente con benzylguanine derivati. Reporter gruppi fissati per il gruppo benzilico legarsi covalentemente al tag SNAP mentre la guanina agisce come un gruppo. Incorporazione di un quencher sul gruppo guanina assicura che la sonda benzylguanine diventa altamente fluorescente solo su etichettatura della proteina SNAP-tag. Descriviamo l&#39;uso di sonde intramolecularly temprate per il lavaggio senza contrassegno del recettore localizzato in superficie di fattore di crescita epidermico (EGFR) fuso a SNAP-tag e per la quantificazione diretta degli SNAP-Tag &beta;-tubulina nei lisati cellulari. Inoltre, noi abbiamo caratterizzato una variante veloce-etichettatura di SNAP-tag, chiamato SNAP(f), che consente di visualizzare fino a un aumento di dieci volte nella sua reattivit&agrave; verso benzylguanine substrati. I dati presentati dimostrano che la combinazione di SNAP(f) e i substrati fluorogenic riduce notevolmente la fluorescenza di fondo per l&#39;etichettatura e le applicazioni di imaging. Questo approccio consente di indagine altamente sensibile spatiotemporal dynamics della proteina in cellule viventi.

Sviluppo di SNAP-tag fluorogenic sonde per imaging di lavaggio senza fluorescenza.

&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x5316;&#x5B66;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3068;&#x64CD;&#x4F5C;&#x3078;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306A;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3067;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;&#x5805;&#x7262;&#x6027;&#x3068;&#x6C4E;&#x7528;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x5316;&#x5B66;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6B20;&#x70B9;&#x306F;&#x3001;&#x672A;&#x53CD;&#x5FDC;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x975E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B0;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C9;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x5831;&#x544A;&#x3067;&#x306F;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;SNAP-tag&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x6A19;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x86CD;&#x5149;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3068;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x7D39;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; SNAP-tag&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;O&#xFF08;6&#xFF09; -  alkylguanine-DNA alkyltransferase&#xFF08;hAGT&#xFF09;&#x5171;&#x6709;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4F53;&#x3068;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x57FA;&#x306F;&#x8131;&#x96E2;&#x57FA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;SNAP&#x30BF;&#x30B0;&#x306B;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5171;&#x6709;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30EB;&#x90E8;&#x5206;&#x306B;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x6D88;&#x5149;&#x5264;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306F;&#x3001;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306F;SNAP-&#x30BF;&#x30B0;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6A19;&#x8B58;&#x306B;&#x306E;&#x307F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x6027;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x4FDD;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;EGFR&#xFF09;SNAP-&#x30BF;&#x30B0;&#x306B;&#x878D;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x6EB6;&#x89E3;&#x7269;&#x4E2D;&#x306E;&#x3B2;-&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;SNAP&#x30BF;&#x30B0;&#x4ED8;&#x304D;&#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x5B9A;&#x91CF;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6D17;&#x6D44;&#x7121;&#x6A19;&#x8B58;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x5185;&#x6D88;&#x5149;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;SNAP-tag&#x306E;&#x9AD8;&#x901F;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x3001;&#x500D;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B0;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3059;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;SNAP&#xFF08;f&#xFF09;&#x3092;&#x3001;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x63D0;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;SNAP&#xFF08;f&#xFF09;&#x3068;&#x86CD;&#x5149;&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B0;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C9;&#x86CD;&#x5149;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x6642;&#x7A7A;&#x9593;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A6;&#x30A9;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E5;&#x7121;&#x86CD;&#x5149;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;SNAP-tag&#x3092;&#x86CD;&#x5149;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x958B;&#x767A;

&#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD654;&#xD559; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBC0F; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC870;&#xC791;&#xC5D0; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC124;&#xC815;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC735;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;, &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xAC04;&#xB2E8; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC7AC; &#xB2E4;&#xB2A5; &#xD55C; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xAC80;&#xCD9C; &#xD654;&#xD559; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xC810;&#xC740; unreacted &#xB610;&#xB294; nonspecifically &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD615;&#xAD11; &#xBC30;&#xACBD; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC120;&#xBB3C;&#xC774; &#xB514;&#xC790;&#xC778; &#xBC0F; &#xC18C;&#xC124;&#xC758; &#xC751;&#xC6A9;&#xC774;&#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; fluorogenic &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8; &#xC735;&#xD574; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC870;&#xC0AC;. &#xC2A4;&#xB0C5;-&#xD0DC;&#xADF8;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC218;&#xB9AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; O (6)-alkylguanine-DNA alkyltransferase (hAGT) &#x70AD; benzylguanine &#xC720;&#xB3C4;&#xCCB4;&#xC640; &#xBC18;&#xC751; &#xD558;&#xB294;&#xC758; &#xC870;&#xC791;&#xB41C; &#xBCC0;&#xC885; &#xC774;&#xB2E4;. &#xAE30;&#xC790;&#xB294; guanine &#xB5A0;&#xB098; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC791;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBCA4; moiety&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xADF8;&#xB8F9; &#x70AD; &#xC2A4;&#xB0C5; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC5D0; &#xBD80;&#xCC29; &#xB418;. &#xB044;&#xB294; guanine &#xADF8;&#xB8F9;&#xC5D0;&#xC758; &#xD558;&#xBA74; benzylguanine &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xB41C;&#xB2E4; &#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB77C;&#xBCA8; &#xBD80;&#xCC29; &#xC2DC; &#xB192;&#xC740; &#xD615;&#xAD11;. &#xC6B0;&#xB9AC; intramolecularly &#xCE68;&#xBB35;&#xACFC; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC140; &#xD45C;&#xBA74; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB41C; &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (EGFR) &#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8; &#xC735;&#xD569;&#xC758; &#xB77C;&#xBCA8; &#xC138;&#xCC99; &#xBB34;&#xB8CC; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C1;&#xC811; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; &#xC140; lysates&#xC5D0; &beta; tubulin &#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8;, SNAP(f), benzylguanine &#xAE30;&#xD310; &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xB300; 10 &#xBC30;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418; &#xB098; &#xBE60;&#xB978; &#xB77C;&#xBCA8; &#xBCC0;&#xC885;&#xC744; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC81C;&#xC2DC; &#xB370;&#xC774;&#xD130; SNAP(f) &#xBC0F; fluorogenic &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xD06C;&#xAC8C; &#xB77C;&#xBCA8; &#xBC0F; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC30;&#xACBD; &#xD615;&#xAD11; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC5ED;&#xD559;&#xC758; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; spatiotemporal &#xC870;&#xC0AC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC2A4;&#xB0C5;&#xC778; &#xD0DC;&#xADF8; fluorogenic&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xC6CC;&#xC2DC; &#xBB34;&#xB8CC; &#xD615;&#xAD11; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;.

La capacidad de unir espec&#xED;ficamente sondas qu&#xED;micas a las prote&#xED;nas individuales representa un poderoso enfoque para el estudio y manipulaci&#xF3;n de funci&#xF3;n de las prote&#xED;nas en las c&#xE9;lulas vivas. Proporciona un enfoque simple, robusto y vers&#xE1;til para la proyecci&#xF3;n de imagen de las prote&#xED;nas de fusi&#xF3;n en una amplia gama de par&#xE1;metros experimentales. Sin embargo, un posible inconveniente de la detecci&#xF3;n mediante sondas qu&#xED;micas es el fondo de fluorescencia de las sondas que no han reaccionado o encuadernadas, no espec&#xED;fica. En este informe se presenta el dise&#xF1;o y aplicaci&#xF3;n de nuevas sondas fluorog&#xE9;nicos para el etiquetado de marcas SNAP-prote&#xED;nas de fusi&#xF3;n en las c&#xE9;lulas vivas. SNAP-tag es una variante de la ingenier&#xED;a humana reparaci&#xF3;n prote&#xED;na S (6)-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (hAGT) que reacciona de forma covalente con derivados bencilguanina. Grupos informadores unidos al resto bencilo quedan unidas covalentemente a la etiqueta de SNAP mientras que los actos de guanina como un grupo saliente. La incorporaci&#xF3;n de un extintor en el grupo de guanina asegura que la sonda bencilguanina se convierte en altamente fluorescente s&#xF3;lo en el etiquetado de la prote&#xED;na SNAP-etiqueta. Se describe el uso de sondas intramolecularmente enfriadas por lavado libre de etiquetado de c&#xE9;lulas del receptor del factor de crecimiento en superficie localizada epid&#xE9;rmico (EGFR) fusionado a SNAP-etiqueta y para la cuantificaci&#xF3;n directa de SNAP-etiquetados &#x3B2;-tubulina en lisados &#x200B;&#x200B;celulares. Adem&#xE1;s, hemos caracterizado una variante r&#xE1;pida de etiquetado de la SNAP-tag, denominado SNAP (f), que muestra a un aumento de diez veces en su reactividad frente a los sustratos bencilguanina. Los datos presentados demuestran que la combinaci&#xF3;n de la SNAP (f) y los sustratos fluorog&#xE9;nicos reduce en gran medida de la fluorescencia de fondo para aplicaciones de etiquetado y de imagen. Este enfoque permite la investigaci&#xF3;n espacial y temporal muy sensible de la din&#xE1;mica de prote&#xED;nas en las c&#xE9;lulas vivas.

Article	Year
Generation of an affinity column for antibody purification by intein-mediated protein ligation. Journal of immunological methods\| PubMed ID: 14604539	2003
Western blot analysis of Src kinase assays using peptide substrates ligated to a carrier protein. BioTechniques\| PubMed ID: 15211748	2004
Producing peptide arrays for epitope mapping by intein-mediated protein ligation. BioTechniques\| PubMed ID: 15470898	2004
An improved method for utilization of peptide substrates for antibody characterization and enzymatic assays. Journal of immunological methods\| PubMed ID: 15541279	2004
Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin. Nature\| PubMed ID: 17230191	2007
Use of intein-mediated phosphoprotein arrays to study substrate specificity of protein phosphatases. BioTechniques\| PubMed ID: 17269486	2007
Design, preparation and use of ligated phosphoproteins: a novel approach to study protein phosphatases by dot blot array, ELISA and Western blot assays. Methods (San Diego, Calif.)\| PubMed ID: 17532508	2007
Intein-mediated peptide arrays for epitope mapping and kinase/phosphatase assays. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 17984527	2007
Site-specific protein labeling by intein-mediated protein ligation. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 21125382	2011
Fluorescent site-specific labeling of Escherichia coli expressed proteins with Sfp phosphopantetheinyl transferase. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 21125394	2011
Development of SNAP-tag fluorogenic probes for wash-free fluorescence imaging. Chembiochem : a European journal of chemical biology\| PubMed ID: 21793150	2011

Luo Sun

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications