in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

<em>In vivo</em> and <em>in vitro</em> Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Colorado State University

&#x5728;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x9002;&#x914D;&#x5668;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x53D1;&#x6325;&#x7740;&#x6838;&#x5FC3;&#x4F5C;&#x7528;&#x5728;&#x534F;&#x8C03;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x5916;&#x8863;&#x548C;&#x8D27;&#x7269;&#x9009;&#x62E9;&#x96C6;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x7279;&#x6709;&#x9175;&#x6BCD;&#x541E;&#x9002;&#x914D;&#x5668; Sla1p &#x5230;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x4EA7;&#x751F;&#x8D1F;&#x9762;&#x53D7; Sla1p SHD2 &#x57DF;&#x53D8;&#x578B;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E3B;&#x9898;&#x901A;&#x8FC7;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;SHD2 &#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x6807;&#x8BC6;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E0D;&#x80B2;&#x7684; alpha &#x6BCD;&#x9898; (SAM) &#x57DF;&#x7684;&#x57DF;&#xFF0C;&#x5E76;&#x663E;&#x793A; oligomerize &#x7684;&#x503E;&#x5411;&#x3002;Sla1p co-&#x6C89;&#x6DC0;&#xFF0C;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x548C; self-associates &#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x5728;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6BCD;&#x9898;&#x4E2D;&#x53D6;&#x6D88;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x548C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x963B;&#x788D;&#x81EA;&#x7F14;&#x5408;&#x5728; SHD2 &#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x541E;&#x7F3A;&#x9677;&#x548C;&#x6539;&#x53D8;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x7684; Sla1p &#x5927;&#x4F1A;&#x5730;&#x70B9;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x901A;&#x8FC7;&#x9002;&#x914D;&#x5668;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x7684;&#x8D1F;&#x5411;&#x8C03;&#x63A7;&#x7684;&#x65B0;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5EFA;&#x8BAE; SAM &#x57DF;&#x7684;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x5185;&#x541E;&#x9002;&#x914D;&#x5668;&#x529F;&#x80FD;&#x8C03;&#x8282;&#xFF1A; SAM &#x57DF;&#x65B0;&#x89D2;&#x8272;&#x3002;

During clathrin-mediated endocytosis, adaptor proteins play central roles in coordinating the assembly of clathrin coats and cargo selection. Here we characterize the binding of the yeast endocytic adaptor Sla1p to clathrin through a variant clathrin-binding motif that is negatively regulated by the Sla1p SHD2 domain. The crystal structure of SHD2 identifies the domain as a sterile alpha-motif (SAM) domain and shows a propensity to oligomerize. By co-immunoprecipitation, Sla1p binds to clathrin and self-associates in vivo. Mutations in the clathrin-binding motif that abolish clathrin binding and structure-based mutations in SHD2 that impede self-association result in endocytosis defects and altered dynamics of Sla1p assembly at the sites of endocytosis. These results define a novel mechanism for negative regulation of clathrin binding by an adaptor and suggest a role for SAM domains in clathrin-mediated endocytosis.

Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: novel role for the SAM domain.

Au cours de la clathrine endocytose, prot&#xE9;ines adaptatrices jouent un r&#xF4;le central dans la coordination de l&#x26;#39;ensemble des couches de clathrine et de s&#xE9;lection du fret. Ici on caract&#xE9;rise la liaison de l&#x26;#39;adaptateur de levure Sla1p endocytique &#xE0; clathrine d&#x26;#39;une variante de la clathrine motif de liaison qui est n&#xE9;gativement r&#xE9;gul&#xE9;e par le domaine Sla1p SHD2. La structure cristalline de SHD2 identifie le domaine comme un st&#xE9;rile alpha-motif (SAM) de domaine et montre une propension &#xE0; oligom&#xE9;riser. Par co-immunopr&#xE9;cipitation, Sla1p se lie &#xE0; la clathrine et les auto-associ&#xE9;s in vivo. Des mutations dans le motif de la clathrine contraignant qui lie abolir la clathrine et bas&#xE9;es sur la structure des mutations dans SHD2 qui entravent l&#x26;#39;auto-association traduisent par des d&#xE9;fauts d&#x26;#39;endocytose et de la dynamique d&#x26;#39;assemblage alt&#xE9;r&#xE9;s Sla1p sur les sites de l&#x26;#39;endocytose. Ces r&#xE9;sultats d&#xE9;finissent un nouveau m&#xE9;canisme de r&#xE9;gulation n&#xE9;gative de la liaison clathrine par un adaptateur et sugg&#xE8;rent un r&#xF4;le pour les domaines SAM dans la clathrine endocytose.

R&#xE8;glement de la Fonction adaptateur clathrine dans l&#x26;#39;endocytose: nouveau r&#xF4;le pour le domaine SAM

Adapter-Proteine spielen w&auml;hrend Clathrin-vermittelte Endozytose zentrale Rollen bei der Koordinierung der Versammlung der Clathrin-M&auml;ntel und Fracht-Auswahl. Hier pr&auml;gen wir die Bindung des endocytic Adapters Hefe Sla1p, Clathrin durch ein variant Clathrin-Bindung-Motiv, das negativ von der Dom&auml;ne Sla1p SHD2 geregelt ist. Die Kristallstruktur von SHD2 identifiziert die Dom&auml;ne als sterile Alpha-Motiv (SAM) Dom&auml;ne und zeigt eine Neigung zu oligomerize. Durch co-Immunopr&auml;zipitation Sla1p bindet an Clathrin und in-vivo self-associates. Endozytose M&auml;ngel und ver&auml;nderte Dynamik der Sla1p Versammlung an den Standorten der Endozytose f&uuml;hren Mutationen der Clathrin-Bindung-Motiv, die Abschaffung der Clathrin-Bindung und Struktur-basierte Mutationen im SHD2, die Self-association zu behindern. Diese Ergebnisse definieren einen neuen Mechanismus f&uuml;r negative Verordnung der Clathrin-Bindung durch einen Adapter und weisen eine Rolle f&uuml;r SAM Dom&auml;nen in Clathrin-vermittelte Endozytose.

Verordnung der Clathrin-Adapter-Funktion in der Endozytose: neue Rolle f&uuml;r die SAM-Dom&auml;ne.

Durante l&#39;endocitosi clatrina-mediata, proteine adattatore giocano un ruolo centrale nel coordinare l&#39;Assemblea di clatrina cappotti e selezione cargo. Qui ci caratterizzano l&#39;associazione dell&#39;adattatore endocitico lievito Sla1p alla clatrina attraverso un variante clatrina-associazione motivo che &egrave; regolato negativamente dal dominio Sla1p SHD2. La struttura di cristallo di SHD2 identifica il dominio come sterile dominio alfa-motif (SAM) e mostra una propensione a oligomerize. Di co-immunoprecipitazione, Sla1p si lega al clatrina e self-associates in vivo. Mutazioni il motivo clatrina-associazione che abolire associazione clatrina e mutazioni basata su struttura in SHD2 che impediscono moltiplicava causare difetti endocitosi e alterata dinamica dell&#39;Assemblea Sla1p presso i siti di endocitosi. Questi risultati un adattatore per definire un romanzo meccanismo per regolazione negativa del legame Clatrina e suggeriscono un ruolo per i domini di SAM in endocitosi Clatrina-mediata.

Regolamento della funzione adattatore clatrina nell&#39;endocitosi: romanzo ruolo per il dominio di SAM.

&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x3001;&#x30A2;&#x30C0;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C8;&#x3084;&#x8CA8;&#x7269;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306E;&#x8ABF;&#x6574;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x7684;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x8CA0;&#x306E;Sla1p SHD2&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x200B;&#x200B;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5236;&#x5FA1;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x306B;&#x9175;&#x6BCD;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C0;&#x30D7;&#x30BF;Sla1p&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x3002; SHD2&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;&#x7121;&#x83CC;&#x306E;&#x3B1;-&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#xFF08;SAM&#xFF09;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x50BE;&#x5411;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5171;&#x514D;&#x75AB;&#x6C88;&#x964D;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;Sla1p&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x3068;&#x81EA;&#x5DF1;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x3084;Sla1p&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x81EA;&#x5DF1;&#x4F1A;&#x5408;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x59A8;&#x3052;&#x308B;SHD2&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3068;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3059;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C0;&#x30D7;&#x30BF;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x8CA0;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3057;&#x3001;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306B;SAM&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30A2;&#x30C0;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#xFF1A;SAM&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;

Endocytosis clathrin &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC5B4;&#xB311;&#xD130; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD611;&#xC870; clathrin &#xCF54;&#xD2B8;&#xC640; &#xD654;&#xBB3C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC758; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC911;&#xC559; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC7AC;&#xC0DD;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; Sla1p SHD2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xB41C; variant clathrin &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; clathrin &#xD558; &#xB204; &#xB8E9; endocytic &#xC5B4;&#xB311;&#xD130; Sla1p &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC9D5;. Shd2&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;&#xB294; &#xBA54; &#xB9C8;&#xB978; &#xC54C;&#xD30C; &#xC8FC;&#xC81C; (SAM) &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xACE0; oligomerize &#xC131;&#xD5A5;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Co immunoprecipitation&#xC73C;&#xB85C; Sla1p clathrin&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; vivo&#xC5D0;&#xC11C; self-associates. &#xD3D0;&#xC9C0; clathrin &#xBC14;&#xC778;&#xB529; clathrin &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; self-association&#xC744; &#xBC29;&#xD574; &#xD558;&#xB294; shd2&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xBC18; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBC1C;&#xC0DD; endocytosis &#xACB0;&#xD568;&#xACFC; endocytosis &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; Sla1p &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC758; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB41C; &#xC5ED;&#xD559;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xC5B4;&#xB311;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; clathrin &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC758; &#xB124;&#xAC70;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xADDC;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC815;&#xC758; &#xD558; &#xACE0; SAM &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; endocytosis clathrin &#xC911;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;.

Endocytosis clathrin &#xC5B4;&#xB311;&#xD130; &#xD568;&#xC218;&#xC758; &#xADDC;&#xC815;: SAM &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC5ED;&#xD560;.

Durante clathrin endocitosis mediada, adaptador de prote&#xED;nas juegan un papel central en la coordinaci&#xF3;n del conjunto de capas clatrina y la selecci&#xF3;n de la carga. Aqu&#xED; caracterizar la uni&#xF3;n de la levadura Sla1p adaptador endoc&#xED;tica clathrin a trav&#xE9;s de una variante clathrin vinculante motivo que se regula negativamente por el dominio Sla1p SHD2. La estructura cristalina de SHD2 identifica el dominio como un est&#xE9;ril alfa-motivo (SAM) de dominio y muestra una propensi&#xF3;n a oligomerizar. Al co-inmunoprecipitaci&#xF3;n, Sla1p se une a clatrina y asociados de auto-in vivo. Las mutaciones en el motivo de clathrin vinculante que abolir la uni&#xF3;n clatrina y mutaciones basadas en la estructura de SHD2 que impiden la libre asociaci&#xF3;n como resultado defectos de endocitosis y la din&#xE1;mica de la alteraci&#xF3;n de la asamblea Sla1p en los sitios de la endocitosis. Estos resultados definen un nuevo mecanismo de regulaci&#xF3;n negativa de la uni&#xF3;n de clatrina por un adaptador y sugieren un papel para los dominios SAM en clathrin endocitosis mediada.

Daniel Feliciano

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