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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Columbia University College of Physicians and Surgeons

&#x6FC0;&#x6D3B;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x80DE;&#x82F7;&#x8131;&#x6C28;&#x9176; &#xFF08;&#x63F4;&#x52A9;&#xFF09; &#x542F;&#x52A8;&#x514D;&#x75AB;&#x7403;&#x86CB;&#x767D; (Ig) &#x91CD;&#x94FE; (&#x5BA4;&#x5185;&#x8FD0;&#x52A8;&#x573A;) &#x7C7B;&#x4EA4;&#x6362;&#x673A;&#x91CD;&#x7EC4; (CSR) &#x548C;&#x8D85; Ig &#x53EF;&#x53D8;&#x533A;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x53D8;&#x5F02; (&#x9655;&#x897F;&#x795E;&#x6728;) &#x5728; B &#x6DCB;&#x5DF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684; deaminating cytidines &#x886C;&#x5E95; DNA &#x8F6C;&#x5F55;&#x7684;&#x6A21;&#x677F;&#x548C;&#x975E;&#x6A21;&#x677F;&#x94FE;&#x4E0A;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x63F4;&#x52A9;&#x8BBF;&#x95EE;&#x6A21;&#x677F; DNA &#x94FE;&#xFF0C;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x5F53;&#x6742;&#x4EA4;&#x65B0;&#x751F; RNA &#x8A8A;&#x672C;&#xFF0C;&#x4E00;&#x76F4;&#x662F;&#x4E2A;&#x8C1C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x73B0;&#x5728;&#x7275;&#x8FDE; RNA exosome&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE; RNA &#x52A0;&#x5DE5;/&#x964D;&#x89E3;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x3001; &#x9488;&#x5BF9;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD; DNA &#x94FE;&#x5230;&#x63F4;&#x52A9;&#x3002;B &#x6CBF;&#x88AD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6FC0;&#x6D3B; CSR&#xFF0C;RNA exosome &#x63F4;&#x52A9;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3001; &#x9644;&#x7740;&#x5728;&#x5BA4;&#x5185;&#x8FD0;&#x52A8;&#x573A;&#x5F00;&#x5173;&#x533A;&#x57DF;&#x4F9D;&#x8D56;&#x63F4;&#x52A9;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x548C;&#x662F;&#x6700;&#x4F73;&#x4F01;&#x4E1A;&#x793E;&#x4F1A;&#x8D23;&#x4EFB;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE; RNA exosome &#x548C;&#x91CD;&#x7EC4; RNA exosome &#x6838;&#x5FC3;&#x590D;&#x6742;&#x4F20;&#x6388;&#x4F9D;&#x8D56;&#x63F4;&#x52A9;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7684;&#x9C81;&#x68D2; DNA &#x8131;&#x6C28;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x8F6C;&#x5F55;&#x9655;&#x897F;&#x795E;&#x6728;&#x886C;&#x5E95;&#x4E24;&#x80A1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x975E;&#x7F16;&#x7801; RNA &#x76D1;&#x89C6;&#x673A;&#x68B0;&#x4E2D;&#x751F;&#x6210;&#x6297;&#x4F53;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x65B9;&#x9762;&#x53D1;&#x6325;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

RNA exosome &#x76EE;&#x6807;&#x63F4;&#x52A9;&#x80DE;&#x82F7;&#x8131;&#x6C28;&#x9176;&#x5BF9;&#x8F6C;&#x5F55;&#x53CC;&#x9762; DNA &#x57FA;&#x7247;&#x4E24;&#x80A1;&#x3002;

Activation-induced cytidine deaminase (AID) initiates immunoglobulin (Ig) heavy-chain (IgH) class switch recombination (CSR) and Ig variable region somatic hypermutation (SHM) in B lymphocytes by deaminating cytidines on template and nontemplate strands of transcribed DNA substrates. However, the mechanism of AID access to the template DNA strand, particularly when hybridized to a nascent RNA transcript, has been an enigma. We now implicate the RNA exosome, a cellular RNA-processing/degradation complex, in targeting AID to both DNA strands. In B lineage cells activated for CSR, the RNA exosome associates with AID, accumulates on IgH switch regions in an AID-dependent fashion, and is required for optimal CSR. Moreover, both the cellular RNA exosome complex and a recombinant RNA exosome core complex impart robust AID- and transcription-dependent DNA deamination of both strands of transcribed SHM substrates in vitro. Our findings reveal a role for noncoding RNA surveillance machinery in generating antibody diversity.

The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.

Activation-induced cytidine d&#xE9;saminase (AID) initie des immunoglobulines (Ig) de recombinaison de la cha&#xEE;ne lourde (IgH) de commutation de classe des entreprises (RSE) et Ig r&#xE9;gion variable hypermutation somatique (SHM) dans les lymphocytes B par d&#xE9;saminante cytidines sur mod&#xE8;le et des brins d&#x26;#39;ADN de substrats nontemplate transcrits. Cependant, le m&#xE9;canisme d&#x26;#39;acc&#xE8;s &#xE0; l &#x26;#39;AID brin d&#x26;#39;ADN matrice, en particulier lorsqu&#x26;#39;elles sont hybrid&#xE9;es &#xE0; une transcription ARN naissante, a &#xE9;t&#xE9; une &#xE9;nigme. Nous avons maintenant impliquer le exosomes ARN, un complexe RNA-processing/degradation cellulaire, en ciblant l&#x26;#39;aide &#xE0; deux brins d&#x26;#39;ADN. Dans les cellules de lign&#xE9;e B activ&#xE9;s pour la RSE, les associ&#xE9;s d&#x26;#39;ARN exosomes avec l&#x26;#39;AID, s&#x26;#39;accumule sur les r&#xE9;gions de commutation IgH dans un mode d&#xE9;pendant de l&#x26;#39;aide, et est n&#xE9;cessaire pour la RSE optimale. En outre, &#xE0; la fois le complexe ARN cellulaire exosomes et un complexe d&#x26;#39;ARN recombinant coeur exosomes de r&#xE9;pandre AIDE-et robuste de la transcription d&#xE9;pendante de l&#x26;#39;ADN d&#xE9;samination des deux brins de transcrite SHM substrats in vitro. Nos r&#xE9;sultats r&#xE9;v&#xE8;lent un r&#xF4;le de surveillance pour les machines ARN non codant pour g&#xE9;n&#xE9;rer la diversit&#xE9; des anticorps.

Le Exosome ARN cible le Cytidine Deaminase AID pour les deux brins de l&#x26;#39;ADN double brin Transcribed Substrats

Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID) initiiert Immunglobuline (Ig) schwere-Kette (IgH) Klasse Switch Rekombination (CSR) und Ig Variable Region somatische Hypermutation (SHM) in B-Lymphozyten, indem deaminating Cytidines auf Vorlage und nicht auf Vorlagen basierende Str&auml;nge transkribierte DNA-Substrate. Der Mechanismus der Hilfe Zugang zu der Vorlage-DNA-Strang, wurde insbesondere dann, wenn auf eine entstehende RNA-Transkript hybridisiert ein R&auml;tsel jedoch. Wir jetzt implizieren die RNA Exosome, komplexe zellul&auml;re RNA-Verarbeitung/Abbau, ins Visier nehmen Hilfe an beiden DNA-Str&auml;nge. In B-Linie-Zellen aktiviert f&uuml;r CSR verkn&uuml;pft mit Hilfe der RNA-Exosome, sammelt IgH Switch Regionen in einer Weise Hilfe abh&auml;ngig, und f&uuml;r optimale CSR ist erforderlich. Dar&uuml;ber hinaus vermitteln die komplexen zellul&auml;ren RNA-Exosome und ein rekombinantes RNA Exosome Kernkomplex robuste Beihilfen - und Transkription-abh&auml;ngigen DNA Deamination von beide Str&auml;nge der transkribierten SHM-Substrate, die in-vitro. Unsere Ergebnisse zeigen eine Rolle f&uuml;r nichtkodierende RNA-&Uuml;berwachung-Maschinen bei der Erzeugung von Antik&ouml;rper-Vielfalt.

Die RNA-Exosome zielt auf die Hilfe-Cytidin-Desaminase auf beide Str&auml;nge der transkribierten duplex DNA-Substrate.

Deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto) avvia immunoglobuline (Ig) catene pesanti (IgH) classe switch ricombinazione (CSR) e Ig regione variabile ipermutazione somatica (SHM) nei linfociti B deammina cytidines sul modello e non template ciocche di substrati DNA trascritti. Tuttavia, il meccanismo di accesso aiuti a filo del DNA template, particolarmente quando ibridato a una trascrizione di RNA nascente, &egrave; stato un enigma. Abbiamo ora coinvolgono il RNA exosome, un complesso RNA-elaborazione/degradazione cellulare, in aiuto di targeting di due filamenti di DNA. In cellule di lignaggio B attivate per la RSI, il RNA exosome associa gli aiuti, si accumula sulle regioni switch IgH in maniera aiuto-dipendente ed &egrave; necessaria per la RSI ottimale. Inoltre, sia il cellulare RNA exosome complesso e un nucleo di exosome RNA complesso ricombinante impartire deaminazione DNA robusto aiuto - e trascrizione-dipendente di due fili di substrati SHM trascritti in vitro. I nostri risultati rivelano un ruolo per macchinari di sorveglianza RNA non codificante nel generare diversit&agrave; dell&#39;anticorpo.

il RNA exosome obiettivi la deaminasi della citidina aiuti a due filoni di trascritti substrati duplex di DNA.

&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x8A98;&#x5C0E;&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;AID&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#x3001;DNA&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3068;&#x975E;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x9396;&#x306B;&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x3092;&#x8131;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x308B;B&#x30EA;&#x30F3;&#x30D1;&#x7403;&#x306E;&#x514D;&#x75AB;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;Ig&#xFF09;&#x91CD;&#x9396;&#xFF08;IGH&#xFF09;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30B9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1;&#x7D44;&#x307F;&#x63DB;&#x3048;&#xFF08;CSR&#xFF09;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Ig&#x53EF;&#x5909;&#x9818;&#x57DF;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x8D85;&#x5909;&#x7570;&#xFF08;SHM&#xFF09;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x65B0;&#x751F;RNA&#x8EE2;&#x5199;&#x7269;&#x306B;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BA;&#x3057;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x92F3;&#x578B;DNA&#x9396;&#x3078;&#x306E;AID&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x8B0E;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4ECA;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;DNA&#x9396;&#x306B;AID&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;RNA&#x30A8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;RNA-processing/degradation&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x3001;&#x5DFB;&#x304D;&#x8FBC;&#x3080;&#x3002; CSR&#x3001;AID&#x306E;RNA&#x30A8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;Associates&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;B&#x7CFB;&#x7D71;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x3001;AID&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x5F62;&#x3067;&#x306E;IgH&#x30B9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1;&#x9818;&#x57DF;&#x306B;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3057;&#x3001;&#x6700;&#x9069;&#x306A;CSR&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;RNA&#x30A8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;RNA&#x30A8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x30B3;&#x30A2;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306F;&#x3001;&#x5805;&#x7262;&#x306A;AID&#x3068;in vitro&#x3067;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;SHM&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x9396;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;DNA&#x8131;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x5316;&#x3092;&#x4ED8;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x30CE;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;RNA&#x30B5;&#x30FC;&#x30D9;&#x30A4;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

RNA&#x30A8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x57FA;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x9396;&#x306B;AID&#x306E;&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x5BFE;&#x8C61;

&#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC720;&#xB3C4; cytidine deaminase (&#xC6D0;&#xC870;) &#xBCA0;&#xB080;&#xB41C; DNA &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF;&#xACFC; &#xBE44;&#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; cytidines deaminating&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBA74;&#xC5ED; &#xAE00;&#xB85C;&#xBD88;&#xB9B0; (Ig) &#xBB34;&#xAC70;&#xC6B4; &#xCCB4;&#xC778; (IgH) &#xD074;&#xB798;&#xC2A4; &#xC2A4;&#xC704;&#xCE58; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; (CSR)&#xACFC; Ig &#xBCC0;&#xC218; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC758; &#xC2E0;&#xCCB4;&#xC801;&#xC778; hypermutation (SHM) B &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xC791; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xC11C;&#xC2DD; &#xD30C;&#xC77C; DNA &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xC870; &#xC561;&#xC138;&#xC2A4; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xCD08;&#xAE30; RNA &#xC0AC;&#xBCF8;&#xC744; hybridized &#xB54C;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xC218;&#xC218;&#xAED8;&#xB07C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC9C0;&#xAE08; &#xB450; DNA &#xAC00;&#xB2E5;&#xC744; &#xC6D0;&#xC870; &#xB300;&#xC0C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; RNA-&#xCC98;&#xB9AC;/&#xC800;&#xD558; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; RNA exosome &#xC5F0;&#xB8E8;. B &#xD608;&#xD1B5; &#xC140; CSR&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;, RNA exosome &#xC6D0;&#xC870;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558; &#xACE0; &#xBCF4;&#xC870; &#xC885;&#xC18D; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C; IgH &#xC2A4;&#xC704;&#xCE58; &#xC601;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xCD95;&#xC801; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; CSR&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694;. &#xB610;&#xD55C;, &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; RNA exosome &#xBC0F; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; RNA exosome &#xCF54;&#xC5B4; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA0;&#xB080;&#xB41C; SHM &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC758; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xC885;&#xC18D; DNA &#xD0C8;&#xC744; &#xC5BB;&#xC73C;&#xBA70;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; noncoding RNA &#xAC10;&#xC2DC; &#xAE30;&#xACC4; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C;.

RNA exosome &#xC6D0;&#xC870; cytidine deaminase &#xBCA0;&#xB080;&#xB41C; &#xC774;&#xC911; DNA &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC744; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

La activaci&#xF3;n inducida por la citidina deaminasa (AID) inicia inmunoglobulina (Ig) de recombinaci&#xF3;n de la cadena pesada (IgH) cambio de clase (CSR) y la regi&#xF3;n variable de Ig hipermutaci&#xF3;n som&#xE1;tica (SHM) en los linfocitos B por desaminar cytidines en la plantilla y las hebras nontemplate de sustratos de ADN transcrito. Sin embargo, el mecanismo de acceso AID a la cadena de ADN plantilla, particularmente cuando se hibridan a una transcripci&#xF3;n de ARN naciente, ha sido un enigma. Ahora implican el exosoma ARN, un complejo RNA-processing/degradation celular, en la orientaci&#xF3;n de la ayuda de dos hebras de ADN. En las c&#xE9;lulas de linaje B activadas para la RSE, el ARN asocia exosoma con la AID, se acumula en las regiones del interruptor CIB en una forma dependiente de la ayuda, y es necesario para una &#xF3;ptima RSE. Adem&#xE1;s, tanto el complejo ARN celular exosoma y un complejo ARN recombinante n&#xFA;cleo exosoma impartir robusto AID y la transcripci&#xF3;n dependiente de la desaminaci&#xF3;n de ADN de ambas hebras de transcrito sustratos SHM in vitro. Nuestros resultados revelan un papel para la maquinaria de vigilancia no codificante del ARN en la generaci&#xF3;n de diversidad de anticuerpos.

Veronika Grinstein

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