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Development of a Negative Selectable Marker for <em>Entamoeba histolytica</em>

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

University of Virginia Health System

&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x91CD;&#x65B0;&#x7EC4;&#x5EFA;&#x4E00;&#x5957;&#x50AC;&#x5316;&#x542F;&#x52A8;&#x5177;&#x4F53;&#x7684; R6K ori &#x4F3D;&#x739B;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x3001; &#x65AD;&#x88C2;&#x4F38;&#x957F;&#x7387;&#x7684;&#x53C9;&#x548C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5728;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x7EC8;&#x6B62;&#x7B26;&#x7684;&#x7EC8;&#x6B62;&#x7684; 22 &#x7EAF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684; multiprotein &#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x5F00;&#x59CB;&#x662F;&#x4E25;&#x683C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x8D28;&#x7C92;&#x7F16;&#x7801;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x86CB;&#x767D; pi &#x548C; DnaA &#x7F16;&#x7801;&#x4E3B;&#x673A;&#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi &#x662F;&#x51E0;&#x4E4E;&#x662F;&#x60F0;&#x6027;&#x7684;&#x7684;&#x800C;&#x5305;&#x542B; 3 &#x503E;&#x5411;&#x4E8E; monomerize &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x66FF;&#x6362;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7A97;&#x4F53;&#x662F;&#x5728;&#x521D;&#x59CB;&#x5316;&#x590D;&#x5236;&#x6709;&#x6548;&#x3002;&#x4F53;&#x5916;&#x590D;&#x5236;&#x88AB;&#x6307;&#x70B9; DnaG primase&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x5206;&#x6B21;&#x7C97;&#x63D0;&#x53D6;&#x7269;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5B83;&#x662F;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3002;&#x8D6B;&#x5C14;&#x8F9B;&#x57FA;&#x662F;&#x6700;&#x4F73;&#x590D;&#x5236;&#x548C;&#x6240;&#x9700;&#x5176;&#x66FF;&#x4EE3;&#x7531;&#x80E1;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x50CF;&#x5728;&#x5965;&#x91CC;&#x5947;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#xFF0C;DNA &#x5F2F;&#x66F2;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x8F83;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x4F18;&#x5316;&#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi &#x4ECB;&#x5BFC;&#x590D;&#x5236;&#x9700;&#x8981;&#x8D6B;&#x5C14;&#x8F9B;&#x57FA;&#x3002;&#x590D;&#x5236;&#x963B;&#x585E;&#x65B9;&#x5411;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x975E;&#x5BF9;&#x79F0;&#x653E;&#x7F6E;&#x4E4B;&#x4E09;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4F7F;&#x7528;&#x6A21;&#x677F;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x542B; ori &#x4F3D;&#x739B;&#x4E24;&#x4FA7;&#xFF0C;&#x63A5;&#x7740;&#x5728;&#x51EF;&#x6069;&#x65AF;&#x7C7B;&#x578B;&#x6A21;&#x5F0F;&#x548C;&#x751F;&#x6210;&#x9884;&#x671F;&#x7684;&#x7EC8;&#x6B62;&#x7684;&#x4EA7;&#x54C1;&#x7C7B;&#x578B;&#x3002;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x5206;&#x5B50;&#x4ECE; ori&#xFF0C;&#x5DF2;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x540C;&#x4E00;&#x65B9;&#x5411;&#x9006;&#x65F6;&#x9488;&#x65B9;&#x5411;&#x8FDB;&#x5C55;&#x3002;&#x91CD;&#x7EC4;&#x540E;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x8BB8;&#x591A;&#x529F;&#x80FD;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x6A21;&#x4EFF;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4F53;&#x5185;&#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x662F;&#x5728;&#x7EE7;&#x7EED;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x5B50;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x91CD;&#x8981;&#x91CC;&#x7A0B;&#x7891;&#x3002;

&#x91CD;&#x6784;&#x7684; R6K DNA &#x590D;&#x5236;&#x4F7F;&#x7528; 22 &#x7EAF;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x3002;

We have reconstituted a multiprotein system consisting of 22 purified proteins that catalyzed the initiation of replication specifically at ori gamma of R6K, elongation of the forks, and their termination at specific replication terminators. The initiation was strictly dependent on the plasmid-encoded initiator protein pi and on the host-encoded initiator DnaA. The wild type pi was almost inert, whereas a mutant form containing 3 amino acid substitutions that tended to monomerize the protein was effective in initiating replication. The replication in vitro was primed by DnaG primase, whereas in a crude extract system that had not been fractionated, it was dependent on RNA polymerase. The DNA-bending protein IHF was needed for optimal replication and its substitution by HU, unlike in the oriC system, was less effective in promoting optimal replication. In contrast, wild type pi-mediated replication in vivo requires IHF. Using a template that contained ori gamma flanked by two asymmetrically placed Ter sites in the blocking orientation, replication proceeded in the Cairns type mode and generated the expected types of termination products. A majority of the molecules progressed counterclockwise from the ori, in the same direction that has been observed in vivo. Many features of replication in the reconstituted system appeared to mimic those of in vivo replication. The system developed here is an important milestone in continuing biochemical analysis of this interesting replicon.

Reconstitution of R6K DNA replication in vitro using 22 purified proteins.

Nous avons reconstitu&eacute; un syst&egrave;me multiprot&eacute;ique comprenant 22 prot&eacute;ines purifi&eacute;es qui catalysent l&#39;initiation de la r&eacute;plication sp&eacute;cifiquement &agrave; ori gamma de R6K, &eacute;longation de la fourche et leur terminaison &agrave; terminateurs de r&eacute;plication sp&eacute;cifiques. L&#39;ouverture a &eacute;t&eacute; strictement d&eacute;pendante sur la pi de prot&eacute;ines cod&eacute;es par des plasmides initiateur et sur l&#39;initiateur h&ocirc;te cod&eacute;e DnaA. L&#39;IP de type sauvage est presque inerte, alors qu&#39;une forme mutante contenant 3 substitutions d&#39;acides amin&eacute;s qui avaient tendance &agrave; monomerize la prot&eacute;ine a &eacute;t&eacute; efficace pour le lancement de la r&eacute;plication. La r&eacute;plication in vitro a &eacute;t&eacute; amorc&eacute;e par la primase DnaG, tandis que dans un syst&egrave;me d&#39;extrait brut qui n&#39;avait pas &eacute;t&eacute; fractionn&eacute;, il &eacute;tait d&eacute;pendant de l&#39;ARN polym&eacute;rase. La courbure de l&#39;ADN prot&eacute;ine QU&#39;IHF &eacute;tait n&eacute;cessaire pour la r&eacute;plication optimale et sa substitution par HU, contrairement &agrave; dans le syst&egrave;me de l&#39;oriC, &eacute;tait moins efficace dans la promotion de r&eacute;plication optimale. En revanche, le type sauvage pi par r&eacute;plication in vivo requiert IHF. Utilisez un mod&egrave;le contenant gamma ori flanqu&eacute; de deux sites de Ter asym&eacute;triquement dispos&eacute;es dans le sens de blocage, r&eacute;plication a proc&eacute;d&eacute; dans le mode de type de Cairns et g&eacute;n&eacute;r&eacute; les types attendus des produits de la cessation d&#39;emploi. La majorit&eacute; des mol&eacute;cules a progress&eacute; dans le sens anti-horaire de l&#39;ori, dans le m&ecirc;me sens qui a &eacute;t&eacute; observ&eacute; in vivo. Nombreuses fonctions de r&eacute;plication dans le syst&egrave;me reconstitu&eacute; semblent imiter ceux de r&eacute;plication in vivo. Le syst&egrave;me d&eacute;velopp&eacute; ici est une &eacute;tape importante dans la poursuite de l&#39;analyse biochimique de cette int&eacute;ressante r&eacute;plicon.

Reconstitution de la r&eacute;plication de l&#39;ADN R6K in vitro en utilisant des prot&eacute;ines purifi&eacute;es 22.

Rekonstitution von R6K DNA-Replikation in vitro unter Verwendung von 22 gereinigten Proteinen.

Noi abbiamo ricostituito un sistema multiproteici costituito da 22 proteine purificate che ha catalizzato l&#39;iniziazione di replica in modo specifico all&#39;ori gamma di R6K, allungamento delle forche e loro terminazione a terminatori replica specifico. L&#39;iniziazione era strettamente dipendente su pi della proteina codificata del plasmide iniziatore e sull&#39;host codificato-iniziatore DnaA. Il pi di tipo selvatico era quasi inerte, mentre una forma mutante contenente 3 sostituzioni di aminoacidi che tendevano a monomerize la proteina &egrave; stata efficacia nell&#39;avviare la replica. La replicazione in vitro &egrave; stata innescata da DnaG primasi, considerando che in un sistema di estratto grezzo che non era stato frazionato, era dipendente da RNA polimerasi. La proteina DNA-flessione che IHF serviva per replica ottima e la sua sostituzione da HU, a differenza del sistema oriC, era meno efficacia nel promuovere la replica ottima. Al contrario, wild type pi-mediata replica in vivo richiede IHF. Utilizzando un modello che conteneva ori gamma fiancheggiato da due siti Ter asimmetricamente inseriti nell&#39;orientamento blocco, replica procedette in modalit&agrave; tipo Cairns e generati i tipi previsti di prodotti di terminazione. La maggioranza delle molecole in senso antiorario progredito da ori, nella stessa direzione che &egrave; stata osservata in vivo. Molte delle funzionalit&agrave; di replica nel sistema ricostituito apparso per imitare quelli di replicazione in vivo. Il sistema sviluppato qui &egrave; un&#39;importante pietra miliare nella continua analisi biochimica di questo interessante replicone.

Ricostituzione della replica del DNA R6K in vitro usando 22 proteine purificate.

&#x89E6;&#x5A92;&#x306E;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B; ori &gamma; R6K &#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x958B;&#x59CB;&#x3001;&#x4F38;&#x9577;&#x3001;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CD;&#x30FC;&#x30BF;&#x3067;&#x7D42;&#x7AEF;&#x306E; 22 &#x306E;&#x6D44;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x591A;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x958B;&#x59CB;&#x306F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9; &#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; pi &#x3068;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9; &#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; DnaA &#x306B;&#x53B3;&#x5BC6;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092; monomerize &#x3059;&#x308B;&#x50BE;&#x5411;&#x304C;&#x3042;&#x3063;&#x305F; 3 &#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x5909;&#x7570;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x6709;&#x52B9;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi &#x306F;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x4E0D;&#x6D3B;&#x6027;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x306A;&#x3044;&#x5206;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x7C97;&#x62BD;&#x51FA;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; DnaG &#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6E96;&#x5099;&#x4E07;&#x7AEF;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;IHF &#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4EE3;&#x66FF;&#x80E1;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7570;&#x306A;&#x308A; oriC &#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5FC5;&#x8981;&#x3060;&#x3063;&#x305F; DNA &#x66F2;&#x3052;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x4E0A;&#x3067;&#x3088;&#x308A;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x6709;&#x80FD;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; in vivo IHF &#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;2 &#x3064;&#x306E;&#x975E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x306B;&#x914D;&#x7F6E; Ter &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x306E;&#x5411;&#x304D;&#x3067;&#x4E26;&#x3076; ori &#x30AC;&#x30F3;&#x30DE;&#x306B;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x308B;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30B1;&#x30A2;&#x30F3;&#x30BA;&#x578B;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x3067;&#x9032;&#x3093;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x7D42;&#x4E86;&#x88FD;&#x54C1;&#x306E;&#x4E88;&#x671F;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x578B;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5927;&#x534A;&#x306F;&#x3001;&#x535A;&#x591A;&#x7E54;&#x306E; in vivo &#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x540C;&#x3058;&#x65B9;&#x5411;&#x304B;&#x3089;&#x53CD;&#x6642;&#x8A08;&#x56DE;&#x308A;&#x306B;&#x9032;&#x884C;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x7CFB;&#x3067;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x6A21;&#x5023;&#x3059;&#x308B;&#x767B;&#x5834;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x305F;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B3;&#x30F3;&#x306E;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x7D99;&#x7D9A;&#x7684;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30DE;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; &#x30C8;&#x30FC;&#x30F3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

R6K DNA &#x8907;&#x88FD; 22 &#x6D44;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x751F;&#x4F53;&#x5916;&#x306E;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;

&#xC6B0;&#xB9AC; r6k&#xC758; &#xC624; &#xAC10;&#xB9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xAC1C;&#xC2DC;, &#xD3EC;&#xD06C;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD2B9;&#xC815; &#xBCF5;&#xC81C; &#xCD9C;&#xD604;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC885;&#xB8CC;&#xC758; &#xC5F0;&#xC2E0; &#xC728; &#xCD09;&#xB9E4; 22 &#xC21C;&#xD654; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; multiprotein &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC1C;&#xC2DC; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB85C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; pi &#xBC0F; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; Dnaa&#xC5D0; &#xC5C4;&#xACA9; &#xD558; &#xAC8C; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785; &#xD30C;&#xC774; &#xAC70;&#xC758; &#xBD88;&#xD65C;&#xC131; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; monomerize &#xACBD;&#xD5A5;&#xC774; 3 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DC;&#xC791; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74;. &#xCCB4; &#xC678; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB294; fractionated &#xD558;&#xC9C0; &#xD588;&#xB2E4; &#xC6D0;&#xC720; &#xCD94;&#xCD9C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744;&#xC5D0; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC18;&#xBA74; DnaG primase&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC900;&#xBE44;&#xAC00; &#xB05D;&#xB0AC;&#xB2E4;. DNA &#xC808;&#xACE1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; IHF&#xB294; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C; &#xBC0F; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xB300;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; HU, &#xB2EC;&#xB9AC; &#xC624;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C; &#xCD94;&#xC9C4;&#xC5D0; &#xB35C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801; &#xC774;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xBA74;, vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785; pi &#xC911;&#xC7AC; &#xBCF5;&#xC81C; IHF &#xD544;&#xC694;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCC28;&#xB2E8; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0; 2 &#xAC1C;&#xC758; &#xBE44;&#xB300;&#xCE6D;&#xC73C;&#xB85C; &#xBC30;&#xCE58; Ter &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC624; &#xAC10;&#xB9C8; &#xCE21;&#xBA74;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC11C;&#xC2DD; &#xD30C;&#xC77C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xBCF5;&#xC81C; &#xCF00;&#xC5B8;&#xC988; &#xD615;&#xC2DD; &#xBAA8;&#xB4DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4;&#xD589; &#xD558; &#xACE0; &#xC885;&#xB8CC; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xC608;&#xC0C1;&#xB41C; &#xD615;&#xC2DD;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131;. &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; in vivo &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC19;&#xC740; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC624; &#xB77C;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xACC4; &#xBC18;&#xB300; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC73C;&#xB85C; &#xC9C4;&#xD589;. &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131;&#xB41C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xBAA8;&#xBC29;&#xC73C;&#xB85C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB41C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC740;&#xC774; &#xD765;&#xBBF8;&#xB85C;&#xC6B4; replicon&#xC758; &#xC0DD; &#xD654; &#xD655; &#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC774;&#xC815;&#xD45C;.

R6K DNA &#xBCF5;&#xC81C; 22 &#xC21C;&#xD654; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xAD00;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131;.

Nos hemos reconstituido un sistema multiprote&iacute;nas formado por 22 prote&iacute;nas purificadas que catalizaron la iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n espec&iacute;ficamente en ori gamma de R6K, alargamiento de las horquillas y su terminaci&oacute;n en terminadores de replicaci&oacute;n espec&iacute;fica. La iniciaci&oacute;n era estrictamente dependiente en el pi de prote&iacute;na plasm&iacute;dico iniciador y en el iniciador de host-codificado DnaA. El pi de tipo salvaje fue casi inerte, mientras que una forma mutante que contiene 3 sustituciones de amino&aacute;cidos que tienden a monomerize la prote&iacute;na fue eficaz en la iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n. La replicaci&oacute;n in vitro fue preparada por primase DnaG, mientras en un sistema de extracto crudo que no hab&iacute;a sido fraccionado, que era dependiente de ARN polimerasa. La prote&iacute;na ADN-flexi&oacute;n que IHF era necesaria para la replicaci&oacute;n &oacute;ptima y su sustituci&oacute;n por HU, a diferencia del sistema oriC, fue menos efectiva en la promoci&oacute;n de replicaci&oacute;n &oacute;ptima. Por el contrario, el tipo salvaje mediada por pi replicaci&oacute;n in vivo requiere IHF. Utilizando una plantilla que contiene gamma ori flanqueado por dos sitios de Ter asim&eacute;trico colocados en la orientaci&oacute;n bloqueo, replicaci&oacute;n procedi&oacute; en el modo de tipo de Cairns y generaron los esperado tipos de productos de terminaci&oacute;n. La mayor&iacute;a de las mol&eacute;culas progres&oacute; hacia la izquierda de la ori, en la misma direcci&oacute;n que se ha observado en vivo. Muchas caracter&iacute;sticas de la replicaci&oacute;n en el sistema reconstituido parec&iacute;an los de replicaci&oacute;n in vivo m&iacute;mico. El sistema desarrollado aqu&iacute; es un hito importante para continuar el an&aacute;lisis bioqu&iacute;mico de este interesante replic&oacute;n.

Reconstituci&oacute;n de la replicaci&oacute;n del ADN R6K in vitro utilizando 22 prote&iacute;nas purificadas.

&#x673A;&#x68B0;&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x8D28;&#x7C92; R6K &#x590D;&#x5236;&#x8D77;&#x59CB;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x901A;&#x8FC7;&#x89E3;&#x51B3;&#x4E0B;&#x9762;&#x7684;&#x95EE;&#x9898;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x8C03;&#x67E5;&#x3002;&#x7A81;&#x53D8;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x8D1F;&#x63A7;&#x5236;&#x8D77;&#x7206;&#x7684; pi &#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x7279;&#x6027;&#x662F;&#x4EC0;&#x4E48;&#xFF1F;&#x4E3B;&#x63A7;&#x4EF6;&#x662F;&#x5426;&#x6D89;&#x53CA;&#x552F;&#x4E00;&#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x86CB;&#x767D; ori DNA &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x6216;&#x5B83;&#x8FD8;&#x6D89;&#x53CA; pi &#x548C;&#x51E0;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x673A;&#x7F16;&#x7801;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x5417;&#xFF1F;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x533A;&#x57DF;&#x7684; pi &#x7F16;&#x7801;&#x5E8F;&#x5217;&#x7A81;&#x53D8;&#x5355;&#x72EC;&#x9020;&#x6210;&#x8D1F;&#x63A7;&#x5236;&#x4E00;&#x4E9B;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#xFF0C;&#x62F7;&#x8D1D;&#x6570;&#x76F8;&#x5BF9;&#x6E29;&#x548C;&#x589E;&#x52A0;&#x6240;&#x793A;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x5408;&#x7684; P42L&#xFF0C;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684; DNA &#x5FAA;&#x73AF;&#xFF0C;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x4E0E;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x8BE5;&#x533A;&#x57DF;&#x4E4B;&#x95F4;&#x6B8B;&#x7559; 106 &#x548C; 113 &#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684;&#x9C81;&#x68D2;&#x589E;&#x5F3A;&#x590D;&#x5236;&#x6570;&#x76EE;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F62;&#x5F0F;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x66F4;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x91CD;&#x7EC4;&#x7CFB;&#x7EDF; 22 &#x7EAF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x7EC4;&#x6210;&#x4E2D;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x3002;Pi &#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F62;&#x5F0F;&#x662F;&#x660E;&#x663E;&#x8BF1;&#x5BFC; iteron monomerization WT &#x86CB;&#x767D;&#x76F8;&#x5BF9;&#x5BB9;&#x6613;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E0E; DNA-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x5BF9;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi &#x4E0E; DnaA&#xFF0C;DnaB &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x3001; &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x6CA1;&#x6709;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5DEE;&#x5F02;&#x548C; DnaG primase &#x4E00;&#x65B9;&#x9762;&#x548C;&#x9AD8;&#x590D;&#x5236;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F62;&#x5F0F;&#x548C;&#x53E6;&#x4E00;&#x65B9;&#x9762;&#x7684;&#x540C;&#x4E00;&#x4E3B;&#x673A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4E4B;&#x95F4;&#x3002;DnaG pi &#x4E92;&#x52A8;&#x62A5;&#x9053;&#x8FD9;&#x91CC;&#x662F;&#x5C0F;&#x8BF4;&#x3002;&#x4E24;&#x8005;&#x5408;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x635F;&#x5931;&#x8D1F;&#x8BF1;&#x5BFC; iteron monomerization &#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x548C;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684; iteron &#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x4EA4;&#x4E92;&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x51FA;&#x73B0;&#x8981;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x62F7;&#x8D1D;&#x6570;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x539F;&#x56E0;&#x3002;

&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x8D28;&#x7C92; R6K &#x590D;&#x5236;&#x8D77;&#x59CB;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x8C03;&#x67E5;&#x3002;

The mechanistic basis of control of replication initiation of plasmid R6K was investigated by addressing the following questions. What are the biochemical attributes of mutations in the pi initiator protein that caused loss of negative control of initiation? Did the primary control involve only initiator protein-ori DNA interaction or did it also involve protein-protein interactions between pi and several host-encoded proteins? Mutations at two different regions of the pi-encoding sequence individually caused some loss of negative control as indicated by a relatively modest increase in copy number. However, combinations of the mutation P42L, which caused loss of DNA looping, with those located in the region between the residues 106 and 113 induced a robust enhancement of copy number. These mutant forms promoted higher levels of replication in vitro in a reconstituted system consisting of 22 purified proteins. The mutant forms of pi were susceptible to pronounced iteron-induced monomerization in comparison with the WT protein. As contrasted with the changes in DNA-protein interaction, we found no detectable differences in protein-protein interaction between wild type pi with DnaA, DnaB helicase, and DnaG primase on one hand and between the high copy mutant forms and the same host proteins on the other. The DnaG-pi interaction reported here is novel. Taken together, the results suggest that both loss of negative control due to iteron-induced monomerization of the initiator and enhanced iteron-initiator interaction appear to be the principal causes of enhanced copy number.

Biochemical investigations of control of replication initiation of plasmid R6K.

Les bases m&eacute;canistiques de contr&ocirc;le de l&#39;initiation de la r&eacute;plication du plasmide R6K a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;e en se penchant sur les questions suivantes. Quelles sont les caract&eacute;ristiques biochimiques des mutations de la prot&eacute;ine d&#39;initiateur de pi qui a provoqu&eacute; la perte du contr&ocirc;le n&eacute;gatif d&#39;initiation ? La commande principale comportait-elle une interaction de l&#39;ADN de prot&eacute;ine-ori seul initiateur ou s&#39;agit-il &eacute;galement des interactions de prot&eacute;ine-prot&eacute;ine entre pi et plusieurs prot&eacute;ines cod&eacute;es par l&#39;h&ocirc;te ? Des mutations dans deux r&eacute;gions diff&eacute;rentes de la s&eacute;quence de codage pi caus&eacute;e individuellement une perte de contr&ocirc;le n&eacute;gatif comme en t&eacute;moigne une augmentation relativement modeste en nombre de copies. Toutefois, les combinaisons de la mutation P42L, qu&#39;a caus&eacute; la perte de l&#39;ADN en boucle, avec ceux qui sont situ&eacute;s dans la r&eacute;gion entre les r&eacute;sidus 106 et 113 induite par une solide augmentation de nombre de copies. Ces formes mutantes promus &agrave; des niveaux plus &eacute;lev&eacute;s de la r&eacute;plication in vitro dans un syst&egrave;me reconstitu&eacute; compos&eacute; de prot&eacute;ines purifi&eacute;es 22. Les formes mutantes de pi &eacute;taient susceptibles d&#39;&ecirc;tre prononc&eacute;e monomerization induite par l&#39;iteron par rapport &agrave; la prot&eacute;ine WT. Par opposition &agrave; des changements dans l&#39;interaction ADN-prot&eacute;ine, nous avons ne trouv&eacute; aucune diff&eacute;rence d&eacute;celable dans l&#39;interaction prot&eacute;ine-prot&eacute;ine entre pi de type sauvage avec DnaA, DnaB h&eacute;licase et DnaG primase d&#39;une part et entre les formes mutantes de copies et les prot&eacute;ines de l&#39;h&ocirc;te m&ecirc;me sur l&#39;autre. L&#39;interaction DnaG-pi rapport&eacute;s ici est roman. Pris ensemble, les r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que les deux pertes de contr&ocirc;le n&eacute;gatif en raison de la monomerization induite par les iteron de l&#39;initiateur et l&#39;interaction am&eacute;lior&eacute;e avec un initiateur iteron semblent &ecirc;tre les principales causes de nombre de copie am&eacute;lior&eacute;e.

&Eacute;tudes biochimiques du contr&ocirc;le de l&#39;initiation de la r&eacute;plication du plasmide R6K.

Biochemische Untersuchungen der Kontrolle &#xFC;ber die Initiation der Replikation von Plasmid R6K.

Le basi meccanicistiche del controllo dell&#39;iniziazione di replicazione del plasmide R6K fu indagata rispondendo alle seguenti domande. Che cosa sono gli attributi biochimici di mutazioni della proteina di iniziatore pi che ha causato la perdita del controllo negativo di iniziazione? Ha fatto il controllo primario implica solo iniziatore della proteina-ori DNA interazione o coinvolgere anche le interazioni della proteina-proteina tra pi e diverse proteine con codifica host? Mutazioni in due diverse regioni della sequenza codifica pi individualmente ha causato qualche perdita di controllo negativo come indicato da un aumento relativamente modesto numero di copia. Tuttavia, combinazioni della mutazione P42L, che ha causato perdita di DNA looping, con quelli situati nella regione tra i residui 106 e 113 indotta da un robusto aumento di copiare il numero. Queste forme mutanti promosso pi&ugrave; elevati livelli di replicazione in vitro in un sistema ricostituito costituito da 22 proteine purificate. Le forme mutanti di pi erano suscettibili di monomerization indotta da iteron pronunciato nel confronto con la proteina WT. In contrasto con i cambiamenti nelle interazioni della DNA-proteina, abbiamo trovato differenze rilevabili nella interazione proteina-proteina tra pi di tipo selvatico con DnaA, elicasi DnaB e primasi DnaG su una mano e tra le forme mutanti alta copia e le stesse proteine ospite da altro. L&#39;interazione DnaG-pi segnalato qui &egrave; romanzo. Presi insieme, i risultati suggeriscono che sia la perdita del controllo negativo a causa di monomerization iteron-indotta dell&#39;iniziatore e interazione avanzata iteron-iniziatore sembrano essere le principali cause di numero copia avanzata.

Indagini biochimiche del controllo dell&#39;iniziazione di replicazione del plasmide R6K.

&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB; &#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; R6K &#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x958B;&#x59CB;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306E;&#x57FA;&#x790E;&#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x8CEA;&#x554F;&#x306B;&#x53D6;&#x308A;&#x7D44;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x958B;&#x59CB;&#x306E;&#x8CA0;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x305F; pi &#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x5C5E;&#x6027;&#x3068;&#x306F;&#x4F55;&#x3067;&#x3059;&#x304B;&#xFF1F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x307F;&#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; ori DNA &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x307E;&#x305F; pi &#x3068;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x304B;&#xFF1F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x9818;&#x57DF; pi &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306F;&#x500B;&#x5225;&#x306B;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x6570;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x7DE9;&#x3084;&#x304B;&#x306A;&#x5897;&#x52A0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;P42L&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x8A98;&#x8D77; 106 &#x3068; 113 &#x6B8B;&#x6E23;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x3042;&#x308B; DNA &#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x3069;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x640D;&#x5931;&#x306E;&#x30ED;&#x30D0;&#x30B9;&#x30C8;&#x5F37;&#x5316;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x756A;&#x53F7;&#x3092;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x5F62;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E; in vitro &#x306E; 22 &#x306E;&#x6D44;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x7CFB;&#x3067;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6607;&#x683C;&#x3002;Pi &#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x5F62;&#x306F;&#x3001;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x3068;&#x767A;&#x97F3; iteron &#x8A98;&#x8D77; monomerization WT &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;DNA &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3068;&#x306F;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; pi DnaA&#x3001;DnaB &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x304C;&#x9593;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x9055;&#x3044;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x306A;&#x3057;&#x3068; DnaG &#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x4E00;&#x65B9;&#x3068;&#x9AD8;&#x3044;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x5F62;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;&#x9593;&#x3002;DnaG &pi; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x53D6;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3001;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x8CA0;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1; monomerization iteron &#x8A98;&#x8D77;&#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x3068;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F; iteron &#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B7;&#x30D1;&#x30EB;&#x306E;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x6570;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; R6K &#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x958B;&#x59CB;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3002;

R6K &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC81C;&#xC5B4;&#xC758; &#xAE30;&#xACC4; &#xAE30;&#xCD08;&#xB294; &#xB2E4;&#xC74C;&#xACFC; &#xAC19;&#xC740; &#xC9C8;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB300;&#xC751; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864;&#xC758; &#xC190;&#xC2E4;&#xC744; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xC2DC;&#xD0A8; pi &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131;&#xC740; &#xBB34;&#xC5C7;&#xC785;&#xB2C8;&#xAE4C;? &#xAE30;&#xBCF8; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xD3EC;&#xD568; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;&#xB9CC; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xC624; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; DNA &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xB610;&#xB294; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; pi&#xC640; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;? Pi &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC1C;&#xBCC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9E4;&#xC218;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xACB8;&#xC190; &#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xC758;&#xD574; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xB300;&#xB85C; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80; &#xC190;&#xC2E4;&#xC774; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, DNA &#xBC18;&#xBCF5;&#xC758; &#xC6D0;&#xC778;&#xB41C; &#xC190;&#xC2E4; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 106&#xC640; 113 &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC704;&#xCE58;&#xD55C; &#xADF8;&#xC758; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC720;&#xB3C4; P42L, &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC870;&#xD569; &#xBC88;&#xD638;&#xB97C; &#xBCF5;&#xC0AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xC758; &#xC2B9;&#xC9C4; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; 22 &#xC21C;&#xD654; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC218;&#xC900;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xC758; pi WT &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xBC1C;&#xC74C;&#xB41C; iteron &#xC774;&#xC6A9;&#xD55C; monomerization&#xC5D0; &#xCDE8;&#xC57D; &#xD588;&#xB2E4;. DNA &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xC640; &#xB300;&#xC870;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785; pi DnaA, DnaB helicase&#xC640; &#xAC04;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;-&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xACAC;&#xD560; &#xC218; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xBC1C;&#xACAC; &#xBC0F; DnaG primase &#xD55C; &#xC190;&#xC73C;&#xB85C; &#xBC0F; &#xB192;&#xC740; &#xC0AC;&#xBCF8; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;. DnaG pi &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC18C;&#xC124; &#xAC19;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8; &#xCC0D;&#xC740; &#xACB0;&#xACFC; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790;&#xC640; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; iteron &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; monomerization iteron &#xC720;&#xB3C4; &#xC81C;&#xC5B4;&#xC758; &#xB450; &#xC190;&#xC2E4; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBCF5;&#xC0AC; &#xBC88;&#xD638;&#xC758; &#xC8FC; &#xC6D0;&#xC778; &#xAC83; &#xCC98;&#xB7FC; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

R6K &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC81C;&#xC5B4;&#xC758; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xC870;&#xC0AC;.

La base mecanicista del control de la iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n del pl&aacute;smido R6K fue investigada por abordar las siguientes preguntas. &iquest;Cu&aacute;les son los atributos bioqu&iacute;micos de mutaciones en la prote&iacute;na de iniciador de pi que caus&oacute; la p&eacute;rdida de control negativo de iniciaci&oacute;n? &iquest;El control primario implican interacci&oacute;n de ADN de prote&iacute;na-ori &uacute;nico iniciador o tambi&eacute;n implican interacciones prote&iacute;na-prote&iacute;na entre pi y varias prote&iacute;nas codificada en host? Las mutaciones en dos diferentes regiones de la secuencia de codificaci&oacute;n de pi individualmente causaban cierta p&eacute;rdida de control negativo seg&uacute;n lo indicado por un relativamente modesto aumento en el n&uacute;mero de copias. Sin embargo, combinaciones de la mutaci&oacute;n P42L, que caus&oacute; la p&eacute;rdida de bucles de ADN, con los situados en la regi&oacute;n entre los residuos 106 y 113 inducida por una s&oacute;lida mejora de copiar el n&uacute;mero. Estas formas mutantes promueven mayores niveles de replicaci&oacute;n in vitro en un sistema reconstituido, compuesto por 22 prote&iacute;nas purificadas. Las formas mutantes de pi fueron susceptibles a pronunciado inducida por iteron monomerization en comparaci&oacute;n con la prote&iacute;na WT. En contraste con los cambios en la interacci&oacute;n de ADN y prote&iacute;nas, encontramos diferencias detectables en la interacci&oacute;n prote&iacute;na-prote&iacute;na entre pi de tipo salvaje con DnaA, DnaB helicasa y primase DnaG por un lado y entre las formas mutantes de copia alta y las prote&iacute;nas de anfitri&oacute;n mismo por el otro. La interacci&oacute;n DnaG-pi registrados aqu&iacute; es novela. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que tanto p&eacute;rdida de control negativo debido a monomerization de iteron-inducida del iniciador e interacci&oacute;n mejorada iniciador iteron parecen ser las principales causas de n&uacute;mero de copia mejorada.

Investigaciones bioqu&iacute;micas del control de la iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n del pl&aacute;smido R6K.

&#x96C5;&#x5404;&#x3001; &#x52C3;&#x4F26;&#x7EB3;&#x5C71;&#x53E3;&#x548C; Cuzin &#x7387;&#x5148;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684; F &#x8D28;&#x7C92;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7814;&#x7A76;&#x590D;&#x5236;&#x63A7;&#x5236;&#x548C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8C03;&#x67E5;&#x5BFC;&#x81F4;&quot;&#x590D;&#x5236;&#x5B50;&#x6A21;&#x578B;&quot;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55; &#xFF08;&#x96C5;&#x5404;&#xFF0C;F.&#xFF0C;&#x52C3;&#x4F26;&#x7EB3;&#x5C71;&#x53E3;&#xFF0C;S.&#x548C; Cuzin&#xFF0C;F.(1964 &#x5E74;) &#x51B7;&#x6625;&#x6E2F;&#x5E7B;&#x5F69;&#x3002;Quant.Biol.28&#xFF0C;329 348)&#x3002;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7684;&#x6F84;&#x6E05;&#x6B64;&#x8D28;&#x7C92;&#x548C;&#x5176;&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x542F;&#x52A8;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x91CD;&#x7EC4;&#x5176;&#x590D;&#x5236;&#x4F53;&#x5916; 21 &#x7EAF;&#x51C0;&#x7684;&#x4E3B;&#x673A;&#x7F16;&#x7801;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x8D28;&#x7C92;&#x7F16;&#x7801;&#x542F;&#x52A8;&#x5668; RepE&#x3002;&#x4F53;&#x5916;&#x590D;&#x5236;&#x4E13;&#x95E8;&#x53D1;&#x8D77;&#x4E86;&#x5728; F ori (oriV) &#x548C;&#x7EC6;&#x83CC;&#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x86CB;&#x767D; DnaA &#x548C; RepE &#x8D28;&#x7C92;&#x7F16;&#x7801;&#x542F;&#x52A8;&#x5668;&#x6240;&#x9700;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x4E8C;&#x805A; RepE &#x662F;&#x50AC;&#x5316;&#x590D;&#x5236;&#xFF0C;&#x5728;&#x5904;&#x4E8E;&#x975E;&#x6D3B;&#x52A8;&#x72B6;&#x6001;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5355;&#x4F53;&#x7A81;&#x53D8;&#x79F0;&#x4E3A; RepE(*) &#xFF08;R118P&#xFF09; &#x7684;&#x7A97;&#x4F53;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x50AC;&#x5316;&#x6709;&#x529B;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x590D;&#x5236;&#x62D3;&#x6251;&#x662F;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x51EF;&#x6069;&#x65AF;&#x7A97;&#x4F53;&#x4E0A;&#xFF0C;&#x5E76;&#x53C9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x662F;&#x5355;&#x5411;&#x7684;&#x5927;&#x591A;&#x662F;&#x4ECE;&#x53F3;&#x5230;&#x5DE6;&#x3002;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x80E1;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x5F2F;&#x66F2;&#x8D6B;&#x5C14;&#x8F9B;&#x57FA;&#x4E0D;&#x80FD;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x53D6;&#x4EE3;&#x80E1;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x4E0A;&#x76F8;&#x5173;&#x7684; DNA &#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x9884;&#x5145;&#x662F;&#x4F9D;&#x8D56; DnaG primase&#x3002;&#x8BB8;&#x591A;&#x4F53;&#x5916;&#x590D;&#x5236;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x5BC6;&#x5207;&#x6A21;&#x4EFF;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4F53;&#x5185;&#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x76F8;&#x4FE1;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5E94;&#x8BE5;&#x662F;&#x975E;&#x5E38;&#x6709;&#x7528;&#xFF0C;&#x5728;&#x89E3;&#x5F00;&#x590D;&#x5236;&#x8D77;&#x59CB;&#x7684;&#x673A;&#x7406;&#x53CA;&#x9632;&#x6CBB;&#x3002;

&#x91CD;&#x6784;&#x7684; F &#x56E0;&#x5B50; DNA &#x590D;&#x5236;&#x4E0E;&#x7EAF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4F53;&#x5916;&#x3002;

Jacob, Brenner, and Cuzin pioneered the development of the F plasmid as a model system to study replication control, and these investigations led to the development of the "replicon model" (Jacob, F., Brenner, S., and Cuzin, F. (1964) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28, 329-348). To elucidate further the mechanism of initiation of replication of this plasmid and its control, we have reconstituted its replication in vitro with 21 purified host-encoded proteins and the plasmid-encoded initiator RepE. The replication in vitro was specifically initiated at the F ori (oriV) and required both the bacterial initiator protein DnaA and the plasmid-encoded initiator RepE. The wild type dimeric RepE was inactive in catalyzing replication, whereas a monomeric mutant form called RepE(*) (R118P) was capable of catalyzing vigorous replication. The replication topology was mostly of the Cairns form, and the fork movement was unidirectional and mostly from right to left. The replication was dependent on the HU protein, and the structurally and functionally related DNA bending protein IHF could not efficiently substitute for HU. The priming was dependent on DnaG primase. Many of the characteristics of the in vitro replication closely mimicked those of in vivo replication. We believe that the in vitro system should be very useful in unraveling the mechanism of replication initiation and its control.

Reconstitution of F factor DNA replication in vitro with purified proteins.

Jacob, Brenner et Cuzin pionnier du d&eacute;veloppement du plasmide F comme syst&egrave;me mod&egrave;le pour &eacute;tudier le contr&ocirc;le de la r&eacute;plication, et ces enqu&ecirc;tes ont men&eacute; &agrave; l&#39;&eacute;laboration du &laquo; mod&egrave;le r&eacute;plicon &raquo; (Jacob, F., Brenner, S. et Cuzin, F. (1964) Cold Spring Harbor Symp. Quantit&eacute; Biol. 28, 329-348). Afin d&#39;&eacute;lucider davantage le m&eacute;canisme d&#39;initiation de la r&eacute;plication de ce plasmide et son contr&ocirc;le, nous avons reconstitu&eacute; la r&eacute;plication in vitro avec 21 prot&eacute;ines purifi&eacute;es cod&eacute;e par l&#39;h&ocirc;te et l&#39;initiateur plasmidique RepE. La r&eacute;plication in vitro visait sp&eacute;cifiquement &agrave; l&#39;ori F (oriV) et obligatoire de la prot&eacute;ine bact&eacute;rienne initiateur DnaA et l&#39;initiateur plasmidique RepE. Le type sauvage RepE dim&egrave;re a &eacute;t&eacute; inactif dans la catalyse de la r&eacute;plication, alors qu&#39;une forme mutante monom&egrave;re appel&eacute;e RepE(*) (R118P) a &eacute;t&eacute; capable de catalyser la r&eacute;plication vigoureuse. La topologie de r&eacute;plication a &eacute;t&eacute; principalement de la forme de Cairns et le mouvement de la fourche est unidirectionnel et surtout de droite &agrave; gauche. La r&eacute;plication a &eacute;t&eacute; d&eacute;pendante de la prot&eacute;ine HU et l&#39;ADN structurellement et fonctionnellement li&eacute;e pliage de prot&eacute;ine QU&#39;IHF ne pouvait substituer efficacement pour HU. L&#39;amor&ccedil;age a &eacute;t&eacute; d&eacute;pendant de la primase DnaG. Bon nombre des caract&eacute;ristiques de la r&eacute;plication in vitro a imit&eacute; &eacute;troitement &agrave; ceux de r&eacute;plication in vivo. Nous croyons que le syst&egrave;me in vitro devrait &ecirc;tre tr&egrave;s utile pour comprendre le m&eacute;canisme d&#39;initiation de la r&eacute;plication et son contr&ocirc;le.

Reconstitution de la r&eacute;plication de l&#39;ADN F factor in vitro avec des prot&eacute;ines purifi&eacute;es.

Die Rekonstitution der F-Faktor der DNA-Replikation in vitro mit gereinigten Proteinen.

Jacob, Brenner e Cuzin inizi&ograve; lo sviluppo del plasmide F come un sistema modello per lo studio di controllo replica, e queste indagini ha condotto allo sviluppo del &quot;modello replicone&quot; (Jacob, F., Brennero, S. e Cuzin, F. (1964) Cold Spring Harbor Symp. Quantit&agrave; Biol 28, 329-348). Per chiarire ulteriormente il meccanismo di apertura di replica di questo plasmide e relativo controllo, noi abbiamo ricostituito la replica in vitro con 21 proteine purificate con codifica host e l&#39;iniziatore del plasmide codifica-RepE. La replicazione in vitro in particolare &egrave; stata avviata presso la F ori (oriV) e necessaria sia la proteina batterica iniziatore DnaA e iniziatore del plasmide codifica RepE. Wild type RepE dimerica era inattivo nel catalizzare la replica, mentre una forma monomerica mutante chiamata RepE(*) (R118P) era in grado di catalizzare replica vigorosa. La topologia di replica &egrave; stata per lo pi&ugrave; di forma Cairns, e il movimento della forcella era unidirezionale e principalmente da destra a sinistra. La replica &egrave; stata dipendente della proteina HU e il DNA strutturalmente e funzionalmente correlato, piegatura della proteina che IHF non pu&ograve; sostituire in modo efficiente per HU. L&#39;innesco era dipendente da DnaG primasi. Molte delle caratteristiche della replicazione in vitro imitato molto attentamente quelli di replicazione in vivo. Noi crediamo che il sistema in vitro dovr&agrave; essere molto utile nel dipanare il meccanismo di apertura di replica e il suo controllo.

Ricostituzione della replica del DNA fattore F in vitro con le proteine purificate.

&#x30B8;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D6; &#x30FB; &#x30D6;&#x30EC;&#x30F3;&#x30CA;&#x30FC; Cuzin &#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5236;&#x5FA1;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E; F &#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x5148;&#x99C6;&#x8005;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x5C0E;&#x3044;&#x305F;&#x300C;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B3;&#x30F3; &#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x300D;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B; &#xFF08;&#x30B8;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D6; F. &#x30D6;&#x30EC;&#x30F3;&#x30CA;&#x30FC;&#x3001;s.&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Cuzin F. (1964) &#x5BD2;&#x3044;&#x6625;&#x6E2F;&#x6816;&#x539F;&#x3002;Quant. &#x751F;&#x7269;&#x5B66; 28, 329 348)&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x767A;&#x751F;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3092;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30DB;&#x30B9;&#x30C8; &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9; 21 &#x6D44;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x958B;&#x59CB;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; RepE &#x4F53;&#x5916;&#x3092;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;In vitro &#x3067;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x7279;&#x306B; F ori (oriV) &#x3067;&#x958B;&#x59CB;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x7D30;&#x83CC;&#x30A4;&#x30CB;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF; DnaA &#x3068;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x958B;&#x59CB;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; RepE &#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; RepE(*) (R118P) &#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057; RepE &#x4E8C;&#x91CF;&#x4F53;&#x306F;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3001;&#x89E6;&#x5A92;&#x3067;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30C8;&#x30DD;&#x30ED;&#x30B8;&#x306F;&#x4E3B;&#x306B;&#x30B1;&#x30A2;&#x30F3;&#x30BA;&#x5F62;&#x306E;&#x3055;&#x308C;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x306F;&#x4E00;&#x65B9;&#x5411;&#x3068;&#x53F3;&#x304B;&#x3089;&#x5DE6;&#x3078;&#x306E;&#x4E3B;&#x304B;&#x3089;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F; HU &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068; IHF &#x304C;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x80E1;&#x3092;&#x7F6E;&#x304D;&#x63DB;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x306A;&#x3044;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x66F2;&#x3052;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x95A2;&#x9023;&#x306E; DNA &#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B0; DnaG &#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;In vitro &#x3067;&#x306E;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x306F;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x771F;&#x4F3C;&#x3002;In vitro &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x304C;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x767A;&#x751F;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x89E3;&#x660E;&#x306B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x3079;&#x304D;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x4FE1;&#x3058;&#x308B;&#x3002;

F &#x30D5;&#x30A1;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC; DNA &#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x6D44;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3067;&#x751F;&#x4F53;&#x5916;&#x306E;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;

&#xC57C; &#xACF1;, &#xBE0C; &#xB808;&#xB108;, &#xBC0F; Cuzin &#xBCF5;&#xC81C; &#xC81C;&#xC5B4; &#xACF5;&#xBD80;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC73C;&#xB85C; F &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xAC1C;&#xCC99; &#xD558; &#xACE0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC870;&#xC0AC; &quot;replicon &#xBAA8;&#xB378;&quot;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xC8FC;&#xB3C4; (&#xC57C; &#xACF1;, F., &#xBE0C; &#xB808;&#xB108;, &#xBBF8;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; Cuzin, F. (1964) &#xCF5C;&#xB4DC; &#xC2A4;&#xD504;&#xB9C1; &#xD558;&#xBC84; Symp. Quant. Biol. 28, 329-348). &#xC774; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xBC0F; &#xADF8; &#xC81C;&#xC5B4;&#xC758; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xB354;&#xC6B1; &#xBA85;&#xB8CC;, &#xD558; &#xC6B0;&#xB9AC; 21 &#xC21C;&#xD654; &#xB41C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB85C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xAE30;&#xC5B5;&#xB825; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB97C; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCCB4; &#xC678; &#xBCF5;&#xC81C; F &#xC624; &#xB77C; (oriV)&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xC791; &#xB41C; &#xBC0F; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; DnaA &#xBC0F; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB85C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; &#xCD08;&#xAE30;&#xC790; &#xAE30;&#xC5B5;&#xB825;. &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785; RepE(*) (R118P) &#xB77C;&#xB294; monomeric &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xB294; &#xD65C;&#xBC1C; &#xD55C; &#xBCF5;&#xC81C; catalyzing &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBC18;&#xBA74; dimeric &#xAE30;&#xC5B5;&#xB825;&#xC740; &#xBCF5;&#xC81C;, catalyzing&#xC5D0; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xC9C0;. &#xBCF5;&#xC81C; &#xD1A0;&#xD3F4;&#xB85C;&#xC9C0; &#xCF00;&#xC5B8;&#xC988; &#xC591;&#xC2DD;&#xC758; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; &#xC774;&#xC5C8;&#xACE0; &#xD3EC;&#xD06C; &#xBB34;&#xBE0C;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC29;&#xD5A5;&#xACFC; &#xC67C;&#xCABD; &#xC624;&#xB978;&#xCABD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;. &#xBCF5;&#xC81C; HU &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; HU IHF &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB300;&#xCCB4;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xBCA4;&#xB529; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; DNA&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBABB;&#xC4F0;&#xAC8C; DnaG primase&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xB2E4;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCCB4; &#xC678; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC758; &#xB9CE;&#xC740; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xADF8; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBCF5;&#xC81C; &#xC720;&#xC0AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xBC0F; &#xADF8; &#xC81C;&#xC5B4;&#xB97C; &#xBD84;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC720;&#xC6A9; &#xD558; &#xAC8C; &#xD574;&#xC57C;&#xD55C;&#xB2E4; &#xACE0; &#xC0DD;&#xAC01;.

F &#xC778;&#xC790; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xAD00;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC21C;&#xD654; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131;.

Jacob, Brenner y Cuzin fue pionera en el desarrollo del pl&aacute;smido F como sistema modelo para estudiar el control de la replicaci&oacute;n, y estas investigaciones condujeron al desarrollo del &quot;modelo replic&oacute;n&quot; (Jacob, f el., Brenner, S. y Cuzin, f el. (1964) Cold Spring Harbor Symp. Cantidad Biol 28, 329-348). Para aclarar a&uacute;n m&aacute;s el mecanismo de iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n de este pl&aacute;smido y su control, nosotros hemos reconstituido su replicaci&oacute;n in vitro con 21 prote&iacute;nas purificadas codificada en host y el iniciador plasm&iacute;dico RepE. La replicaci&oacute;n in vitro espec&iacute;ficamente se inici&oacute; en la ori F (oriV) y requiere tanto la prote&iacute;na bacteriana iniciador DnaA y el iniciador plasm&iacute;dico RepE. El tipo salvaje dim&eacute;rico RepE fue inactivo en la cat&aacute;lisis de replicaci&oacute;n, mientras que una forma mutante monom&eacute;rica llamada RepE(*) (R118P) fue capaz de catalizar la replicaci&oacute;n vigorosa. La topolog&iacute;a de replicaci&oacute;n era sobre todo de la forma de Cairns, y el movimiento de la horquilla era unidireccional y sobre todo de derecha a izquierda. La replicaci&oacute;n depend&iacute;a de la prote&iacute;na HU y el ADN estructural y funcionalmente relacionados con flexi&oacute;n prote&iacute;nas que IHF no podr&iacute;a sustituir eficientemente HU. El oscurecimiento depend&iacute;a de primase DnaG. Muchas de las caracter&iacute;sticas de la replicaci&oacute;n in vitro estrechamente m&iacute;mico los de replicaci&oacute;n in vivo. Creemos que el sistema in vitro debe ser muy &uacute;til en el mecanismo de iniciaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n y su control.

Reconstituci&oacute;n de la replicaci&oacute;n del ADN de factor F in vitro con las prote&iacute;nas purificadas.

&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x5206;&#x5316;&#x548C;&#x53D1;&#x5C55;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;&#x5728;&#x7CBE;&#x5B50;&#x53D1;&#x751F;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x671F;&#x95F4;&#x7684;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x6570;&#x91CF;&#x8868;&#x793A;&#x5728;&#x786E;&#x5207;&#x7684;&#x65F6;&#x7A7A;&#x987A;&#x5E8F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57FA;&#x56E0;&#x5982;&#x4F55;&#x4FDD;&#x6301;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7684;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x4E0D;&#x662F;&#x5F88;&#x4E86;&#x89E3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x5B66;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x8F6E;&#x7CBE;&#x7279;&#x5B9A;&#x9F20;&#x6807; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x7801;&#x7684;&#x9876;&#x4F53;&#x9176;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x63ED;&#x793A;&#x5176;&#x8FD1;&#x4FA7;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x533A;&#x5145;&#x5F53;&#x7EDD;&#x7F18;&#x4F53;&#x548C;&#x9632;&#x6B62;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x7EDD;&#x7F18;&#x4F53; tethers SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x5BF9;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x6838;&#x57FA;&#x8D28;&#x87AF;&#x5408;&#x6838;&#x5FC3;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#xFF0C;&#x5728;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x9632;&#x6B62;&#x8F6C;&#x5F55;&#x3002;&#x8868;&#x793A;&#x7684;&#x662F; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x5706;&#x5F62;&#x7CBE;&#x5B50;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5728;&#x516C;&#x5E03;&#x6B64;&#x4E2D;&#x7EE7;&#x3002;&#x7126;&#x6CB9; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x7684; 43 kDa (TDP-43&#xFF09;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x524D;&#x6240;&#x793A; SP 10 &#x7EDD;&#x7F18;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4EA4;&#x4E92;&#x662F;&#x53D1;&#x73B0;&#x5728; 2 m &#x6C2F;&#x5316;&#x94A0;&#x6EB6;&#x6838;&#x57FA;&#x8D28;&#x5206;&#x6570;&#x4E2D;&#x3002;TDP 43 &#x963B;&#x6B62;&#x5242;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x65F6;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x62DB;&#x52DF;&#x7531; Gal4 &#x6218;&#x7565;&#x4E24;&#x8005;&#x4E4B;&#x95F4;&#x3002;&#x2477; TDP 43 &#x4F7F;&#x7528;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x5E72;&#x6270; RNA &#x91CA;&#x653E;&#x5242;&#x963B;&#x6B62; SP 10 &#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x5728;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x6A21;&#x578B;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;TDP 43 &#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x5E9F;&#x9664;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;SP 10 &#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC; TDP 43 &#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#xFF0C;50 bp subfragment &#x5145;&#x5F53;&#x5728;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4E2D;&#x7684;&#x6700;&#x5C0F;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x548C;&#x538B;&#x5236;&#x53E6;&#x6709; ectopically &#x8868;&#x793A;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x3002;SP 10 &#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x4E2D;&#x592E;&#x4EBA;&#x6C11;&#x653F;&#x5E9C; dinucleotides &#x6216; ctcf &#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x65B0;&#x578B;&#x810A;&#x690E;&#x52A8;&#x7269;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x5728;&#x751F;&#x7406;&#x65B9;&#x9762;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x663E;&#x793A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x5982;&#x4F55;&#x538B;&#x5236;&#x3002;

&#x65B0;&#x578B;&#x4E2D;&#x592E;&#x4EBA;&#x6C11;&#x653F;&#x5E9C;&#x65E0;&#x810A;&#x690E;&#x52A8;&#x7269;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x9759;&#x97F3;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5B9A; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF1A; TDP 43 &#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x51FD;&#x6570;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

Regulation of cell type-specific gene transcription is central to cellular differentiation and development. During spermatogenesis, a number of testis-specific genes are expressed in a precise spatiotemporal order. How these genes remain silent in the somatic tissues is not well understood. Our previous studies using the round spermatid-specific mouse SP-10 gene, which codes for an acrosomal protein, revealed that its proximal promoter acts as an insulator and prevents expression in the somatic tissues. Here we report that the insulator tethers the SP-10 gene to the nuclear matrix in somatic tissues, sequestering the core promoter in the process, thus preventing transcription. In round spermatids where the SP-10 gene is expressed, this tethering is released. TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), previously shown to interact with the SP-10 insulator, was found to be in the 2 m NaCl-insoluble nuclear matrix fraction. TDP-43 prevented enhancer-promoter interactions when artificially recruited between the two by Gal4 strategy. Knockdown of TDP-43 using small interfering RNA released the enhancer-blocking effect of the SP-10 insulator in a stable cell culture model. Mutation of TDP-43 binding sites abolished this effect. Finally, a 50-bp subfragment of the SP-10 insulator, which includes TDP-43 binding sites, functioned as a minimal insulator in transgenic mice and silenced an otherwise ectopically expressed transgene in somatic tissues. The SP-10 insulator lacks CpG dinucleotides or CTCF binding sites. Thus, the present study characterized a novel vertebrate insulator in a physiological context and showed for the first time how a testis-specific gene is silenced in the somatic tissues by an insulator.

A novel CpG-free vertebrate insulator silences the testis-specific SP-10 gene in somatic tissues: role for TDP-43 in insulator function.

R&eacute;gulation de la transcription de g&egrave;nes sp&eacute;cifiques au type de cellule est essentielle pour le d&eacute;veloppement et la diff&eacute;renciation cellulaire. Au cours de la spermatogen&egrave;se, un certain nombre de g&egrave;nes sp&eacute;cifiques aux testicules est exprim&eacute; dans un ordre pr&eacute;cis spatio-temporelle. Comment ces g&egrave;nes sont taire dans les tissus somatiques n&#39;est pas bien comprise. Nos &eacute;tudes pr&eacute;c&eacute;dentes en utilisant le round spermatid-sp&eacute;cifiques souris SP-10 g&egrave;ne, qui code pour une prot&eacute;ine de l&#39;acrosome, a r&eacute;v&eacute;l&eacute; que son promoteur proximale agit comme un isolant et emp&ecirc;che l&#39;expression dans les tissus somatiques. Nous rapportons ici que l&#39;isolateur longes le g&egrave;ne SP-10 &agrave; la matrice nucl&eacute;aire dans les tissus somatiques, s&eacute;questrant le promoteur de base dans le processus, emp&ecirc;chant ainsi la transcription. Spermatides ronds o&ugrave; le g&egrave;ne SP-10 est exprim&eacute;, il est lib&eacute;r&eacute; de cet attachement. Prot&eacute;ine de liaison &agrave; l&#39;ADN TAR de 43 kDa (TDP-43), pr&eacute;c&eacute;demment montr&eacute; pour interagir avec l&#39;isolant SP-10, s&#39;est av&eacute;r&eacute; dans la fraction de la matrice nucl&eacute;aire 2 m insoluble dans le NaCl. TDP-43 a emp&ecirc;ch&eacute; les interactions enhancer-promoteur lors de l&#39;embauche artificiellement entre les deux par la strat&eacute;gie de Gal4. Knockdown de TDP-43, &agrave; l&#39;aide de petits ARN interf&eacute;rents lib&eacute;r&eacute; de l&#39;effet de blocage de renforceur de l&#39;isolateur SP-10 dans un mod&egrave;le de culture cellulaire stable. Mutation du TDP-43 sites de liaison aboli cet effet. Enfin, un sous-fragment 50 PB de l&#39;isolateur SP-10, qui comprend des sites de fixation de TDP-43, fonctionnait comme un isolant minimal chez les souris transg&eacute;niques et r&eacute;duits au silence par ailleurs exprim&eacute; fa&ccedil;on ectopique transg&egrave;ne dans les tissus somatiques. L&#39;isolateur SP-10 manque de dinucl&eacute;otides ou accepteurs CTCF. Ainsi, la pr&eacute;sente &eacute;tude caract&eacute;rise un nouvel isolant vert&eacute;br&eacute; dans un contexte physiologique et a montr&eacute; pour la premi&egrave;re fois comment un g&egrave;ne sp&eacute;cifique des testicules est r&eacute;duit au silence dans les tissus somatiques par un isolant.

Un isolateur de vert&eacute;br&eacute;s nouveaux CpG-libre fait taire le g&egrave;ne SP-10 de testicule sp&eacute;cifiques dans les tissus somatiques : r&ocirc;le de TDP-43 en fonction de l&#39;isolant.

Regelung der Zelle Typ-spezifische gen-Transkription ist zentral f&uuml;r die zellul&auml;re Differenzierung und Entwicklung. W&auml;hrend der Spermatogenese sind eine Reihe von Hoden-spezifische Gene in einer bestimmten Reihenfolge der raumzeitliche ge&auml;u&szlig;ert. Wie sich diese Gene in den somatischen Geweben Schweigen ist nicht gut verstanden. Unsere fr&uuml;heren Studien &uuml;ber das Runde Spermatide-spezifische Maus SP-10 gen, welche Codes f&uuml;r ein acrosomal Protein, ergab, dass seine proximalen Projekttr&auml;ger fungiert als Isolator und verhindert Ausdruck in den somatischen Geweben. Hier berichten wir, dass der Isolator das SP-10-gen auf die nukleare Matrix in somatischen Geweben festbindet absondern des Kern-Projekttr&auml;gers im Prozess, und verhindert so die Transkription. Runde Spermatids wo das SP-10-gen ausgedr&uuml;ckt wird, ist diese Anbindehaltung ver&ouml;ffentlicht. TAR DNA-bindenden Protein von 43 kDa (TDP-43), zuvor gezeigt, Interaktion mit der SP-10-Isolator, erwies sich in den 2 m NaCl-unl&ouml;slich Nuklear Matrix Bruch. TDP-43 verhindert Vergr&ouml;&szlig;erer-Projekttr&auml;ger Interaktionen bei der Einstellung k&uuml;nstlich zwischen den beiden Gal4-Strategie. Niederschlag von TDP-43 mit small interfering RNA ver&ouml;ffentlicht die Enhancer-blockierende Wirkung von der SP-10-Isolator in einem stabilen Zelle-Kultur-Modell. Mutation der TDP-43-Bindungsstellen abgeschafft diesen Effekt. Schlie&szlig;lich eine 50-bp-Subfragment von der SP-10-Isolator, die TDP-43-Bindungsstellen einschlie&szlig;t, fungierte als eine minimale Isolator in transgenen M&auml;usen und zum Schweigen gebracht ein ansonsten ectopically Transgen in somatischen Geweben ausgedr&uuml;ckt. Der SP-10-Isolator fehlt CpG Dinucleotides oder CTCF-Bindungsstellen. Daher die vorliegende Studie charakterisiert einen neuartigen Vertebraten Isolator in einem physiologischen Kontext und zeigte zum ersten Mal wie ein Hoden-spezifische gen in den somatischen Geweben durch ein Isolator stummgeschaltet wird.

Ein neuartiger CpG-freie vertebrate Isolator regimekritische Hoden-spezifische SP-10 gen in somatischen Geweben: Rolle f&uuml;r TDP-43 in Isolator-Funktion.

Regolazione della trascrizione del gene specifico del tipo di cella &egrave; centrale per lo sviluppo e la differenziazione cellulare. Durante la spermatogenesi, un certo numero di geni specifici del testicolo &egrave; espressi in un preciso ordine spatiotemporal. Come tacciono questi geni nei tessuti somatici non &egrave; ben compreso. I nostri studi precedenti utilizzando il gene di SP-10 round spermatid specifico del mouse, che codifica per una proteina acrosomale, ha rivelato che il suo promotore prossimale funge da isolante e impedisce l&#39;espressione nei tessuti somatici. Qui riportiamo che l&#39;isolante attacchi del gene di SP-10 alla matrice nucleare nei tessuti somatici, sequestrante del promotore di nucleo nel processo, impedendo la trascrizione. In spermatidi rotondi dove viene espresso il gene di SP-10, questo tethering &egrave; rilasciato. TAR DNA-binding protein di 43 kDa (TDP-43), in precedenza mostrato di interagire con l&#39;isolante SP-10, &egrave; stato trovato per essere nella frazione insolubile in NaCl 2m matrice nucleare. TDP-43 impedito interazioni enhancer-promotore quando artificialmente reclutati tra i due da Gal4 strategia. Atterramento di TDP-43 utilizzando piccolo RNA interferente rilasciato l&#39;effetto bloccante enhancer dell&#39;isolante SP-10 in un modello di cultura cellulare stabile. Mutazione di TDP-43 siti leganti abolito questo effetto. Infine, un subfragment di 50 bp dell&#39;isolante SP-10, che comprende i siti di legame TDP-43, ha funzionato come un isolante minimo in topi transgenici e tacere un&#39;altrimenti ectopically espresso transgene nei tessuti somatici. L&#39;isolante di SP-10 manca di dinucleotidi o siti di legame CTCF. Cos&igrave;, lo studio presente ha caratterizzato un romanzo vertebrato isolante in un contesto fisiologico e ha mostrato per la prima volta come un gene specifico del testicolo &egrave; tacere nei tessuti somatici da un isolante.

Un romanzo privo di CpG vertebrato isolante zittisce il gene di SP-10 testicolo specifici nei tessuti somatici: ruolo per TDP-43 in funzione isolante.

&#x7D30;&#x80DE;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x5199;&#x5236;&#x5FA1;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5206;&#x5316;&#x3068;&#x767A;&#x5C55;&#x306B;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x7684;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7CBE;&#x5B50;&#x5F62;&#x6210;&#x4E2D;&#x306B;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6570;&#x306F;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x6642;&#x7A7A;&#x9593;&#x306E;&#x9806;&#x5E8F;&#x3067;&#x8868;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x9ED9;&#x79D8;&#x306F;&#x3088;&#x304F;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;Spermatid &#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5148;&#x884C;&#x7814;&#x7A76;&#x5148;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x8FD1;&#x4F4D;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x3001;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x3067;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306B;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x6838;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x30C6;&#x30B6;&#x30FC;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x30B3;&#x30A2; &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9694;&#x96E2;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304C;&#x8868;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5186;&#x5F62;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x30C6;&#x30B6;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x89E3;&#x653E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E; SP 10 &#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x3068;&#x306E;&#x5BFE;&#x8A71;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x30BF;&#x30FC;&#x30EB; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E; 43 kDa (TDP-43&#xFF09;&#x3001;2 m NaCl &#x4E0D;&#x6EB6;&#x6027;&#x6838;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x753B;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;TDP-43 Gal4 &#x6226;&#x7565;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; 2 &#x3064;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7684;&#x306B;&#x52DF;&#x96C6;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x304D;&#x30A8;&#x30F3;&#x30CF;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC; &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3; tdp-43 &#x4F4E;&#x5206;&#x5B50;&#x5E72;&#x6E09; RNA &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x57F9;&#x990A;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; SP 10 &#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30CF;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x963B;&#x5BB3;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;TDP-43 &#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;50 bp &#x30B5;&#x30D6;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8; TDP-43 &#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x542B;&#x3080; SP 10 &#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306E;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x4EE5;&#x5916;&#x306F;&#x6C88;&#x9ED9; transgene &#x306E;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x57F9;&#x990A;&#x3092;&#x8868;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;SP 10 &#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306F; CpG &#x306E;&#x30B8;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x307E;&#x305F;&#x306F; CTCF &#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x6B20;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x810A;&#x690E;&#x52D5;&#x7269;&#x4FC2;&#x3089;&#x305A;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x3001;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x7279;&#x7570;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7D76;&#x7E01;&#x6C88;&#x9ED9;&#x3067;&#x3059;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x521D;&#x3081;&#x3066;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x5C0F;&#x8AAC;&#x7121;&#x6599;&#x306E; CpG &#x306E;&#x810A;&#x690E;&#x52D5;&#x7269;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x56FA;&#x6709; SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x6C88;&#x9ED9;&#x3055;&#x305B;&#x308B;: TDP-43 &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3067;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x95A2;&#x6570;&#x3002;

&#xC140; &#xC720;&#xD615;&#xBCC4; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC0AC; &#xC870;&#xC808; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xD654; &#xBC0F; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xC911;&#xC2EC; &#xC774;&#xB2E4;. Spermatogenesis, &#xC911; &#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC218;&#xB294; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; spatiotemporal &#xC21C;&#xC11C;&#xB85C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C;&#xC774; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xAC00; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xBB35; &#xC798; &#xC774;&#xD574; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Acrosomal &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCF54;&#xB4DC; &#xACF5;&#xAC1C;&#xC758; &#xADFC; &#xC704; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558; &#xACE0; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xC2DD; &#xBC29;&#xC9C0; &#xB77C;&#xC6B4;&#xB4DC; spermatid &#xD2B9;&#xC815; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; tethers &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD575; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC0AC; &#xBC29;&#xC9C0; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD575;&#xC2EC; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC744; &#xBD09;&#xC1C4;. &#xB77C;&#xC6B4;&#xB4DC; spermatids SP 10 &#xC9C4; &#xD45C;&#xD604; &#xB41C;&#xB2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD9C;&#xC2DC;&#xC774; &#xBC27;&#xC904;&#xB85C; &#xB9E4;&#xAE30;. &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; SP 10 &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xC640; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; 43 kDa (TDP-43)&#xC758; &#xD0C0;&#xB974; DNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 2 m NaCl &#xBD88;&#xC6A9; &#xC131; &#xD575; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xBD84;&#xC218;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. TDP-43 &#xC99D;&#xAC15; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; Gal4 &#xC804;&#xB7B5;&#xC73C;&#xB85C; &#xB458; &#xC0AC;&#xC774; &#xC778;&#xC704;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xCC44;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xC218; &#xC5C6;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. TDP-43 &#xC791;&#xC740; &#xAC04;&#xC12D; RNA&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCD5C;&#xC800; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC140; &#xBB38;&#xD654; &#xBAA8;&#xB378;&#xC5D0;&#xC11C; SP 10 &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xC758; &#xC99D;&#xAC15;&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD6A8;&#xACFC;&#xB97C; &#xBC1C;&#xD45C; &#xD588;&#xB2E4;. TDP-43 &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD3D0;&#xC9C0;&#xC774; &#xD6A8;&#xACFC;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; TDP 43 &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; SP 10 &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xC758; 50 bp subfragment &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &#xC0DD;&#xC950;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C;&#xC758; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xB85C; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xC785; &#xB9C9; &#xC74C;&#xC744; &#xB2E4;&#xB974;&#xAC8C; ectopically transgene &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD45C;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4;. SP 10 &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; CpG &#xADF8; &#xB610;&#xB294; CTCF &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xAC00; &#xC5C6;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC0DD;&#xB9AC; &#xC801; &#xB9E5;&#xB77D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xCC99;&#xCD94; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xB97C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xD558; &#xACE0; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB294; &#xCE68;&#xBB35; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xCC98;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;.

&#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; CpG &#xBB34;&#xB8CC; &#xCC99;&#xCD94; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xC870;&#xC6A9; &#xD558; &#xAC8C; &#xB9CC;&#xB4E0;&#xB2E4; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790;: &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xD568;&#xC218;&#xC5D0; TDP-43&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;.

Regulaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n de genes espec&iacute;ficos del tipo de c&eacute;lula es fundamental para el desarrollo y diferenciaci&oacute;n celular. Durante la espermatog&eacute;nesis, un n&uacute;mero de genes espec&iacute;ficos de test&iacute;culo se expresa en un orden preciso de espacio-temporal. &iquest;C&oacute;mo permanecen en silenciosos en los tejidos som&aacute;ticos estos genes no se comprende bien. Nuestros estudios previos con el gen de SP-10 ronda spermatid espec&iacute;fico del rat&oacute;n, que codifica para una prote&iacute;na acros&oacute;mica, revel&oacute; que su promotor proximal act&uacute;a como aislante y evita la expresi&oacute;n en los tejidos som&aacute;ticos. Aqu&iacute; se reporta que el aislador anclar el gen de la SP-10 a la matriz nuclear en tejidos som&aacute;ticos, secuestrar el promotor de la base en el proceso, evitando as&iacute; la transcripci&oacute;n. En esperm&aacute;tidas redondas donde se expresa el gen de la SP-10, esta inmovilizaci&oacute;n se libera. Prote&iacute;na de uni&oacute;n a DNA de alquitr&aacute;n de 43 kDa (TDP-43), demostrada previamente para interactuar con el aislador de SP-10, se encontr&oacute; que en la fracci&oacute;n de la matriz nuclear de 2 m de NaCl-insoluble. TDP-43 prevenir interacciones potenciador-promotor artificialmente reclutados entre los dos por estrategia Gal4. Ca&iacute;da de TDP-43 utilizando ARN interferente peque&ntilde;o hab&iacute;a lanzado el efecto potenciador del bloqueo del aislador SP-10 en un modelo de cultura de c&eacute;lula estable. Mutaci&oacute;n de sitios de uni&oacute;n de TDP-43 suprimi&oacute; este efecto. Finalmente, un subfragment de 50-bp del aislador SP-10, que incluye sitios de uni&oacute;n de TDP-43, funcion&oacute; como un aislante m&iacute;nimo en ratones transg&eacute;nicos y silenciados por otro lado expres&oacute; ect&oacute;picamente transg&eacute;n en tejidos som&aacute;ticos. El aislador de SP-10 carece de dinucle&oacute;tidos CpG o sitios de uni&oacute;n de CTCF. As&iacute;, el presente estudio caracteriza un aislador vertebrado novela en un contexto fisiol&oacute;gico y demostr&oacute; por primera vez c&oacute;mo un gen espec&iacute;fico de test&iacute;culo est&aacute; silenciado en los tejidos som&aacute;ticos por un aislador.

Un aislante de vertebrados novela libre de CpG silencia el gen de la SP-10 de test&iacute;culo espec&iacute;ficos en tejidos som&aacute;ticos: papel para TDP-43 en funci&oacute;n del aislador.

&#x5728;&#x8FD9;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F83;&#x77ED;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8FD1;&#x7AEF;&#x5BA3;&#x4F20;&#x5458;&#x5DF2;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x80FD;&#x6307;&#x5BFC;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7C7B;&#x578B;-&#x7279;&#x5B9A;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x5C0F;&#x9F20;&#x7684;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x90FD;&#x662F;&#x552F;&#x4E00;&#x7684;&#x3002;&#x8FD9;&#x7C7B;&#x5C0F;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x788E;&#x7247;&#x5982;&#x4F55;&#x6267;&#x884C;&#x7EF4;&#x62A4;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x548C;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x777E;&#x4E38;&#x4E2D;&#x7684;&#x6B63;&#x786E;&#x751F;&#x6B96;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x53CC;&#x91CD;&#x529F;&#x80FD;&#x4ECD;&#x7136;&#x77E5;&#x4E4B;&#x751A;&#x5C11;&#x3002;&#x4ECE;&#x6211;&#x4EEC;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4F7F;&#x7528;&#x5706;&#x7CBE;&#x7279;&#x5B9A; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x52A8;&#x7269;&#x6A21;&#x578B;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E9B;&#x89C1;&#x89E3;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x5B83;&#x88AB;&#x53D1;&#x73B0;&#x8FD1;&#x7AEF;&#x57FA;&#x56E0;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684; SP 10 &#x4F5C;&#x4E3A;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x6216;&#x8FB9;&#x754C;&#x5143;&#x7D20;&#xFF0C;&#x5E76;&#x53EF;&#x9632;&#x6B62; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5F55;&#x3002;&#x5706;&#x5F62;&#x7CBE;&#x5B50;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x51CF;&#x8F7B;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4FC3;&#x8FDB; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5F55;&#x3002;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5F3A;&#x5316;&#x5242;&#x53D7;&#x4F53;&#x963B;&#x6EDE;&#x5242;&#x548C; &#xFF08;&#x6216;&#xFF09; &#x5F02;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x4FDD;&#x62A4;&#x7F16;&#x7A0B;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x969C;&#x788D;&#x3002;&#x901A;&#x5E38;&#xFF0C;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x662F;&#x5206;&#x5F00;&#x5BA3;&#x4F20;&#x5458;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5728; SP 10 &#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x7EDD;&#x7F18;&#x4F53;&#x91CD;&#x53E0;&#x63A8;&#x9500;&#x5546;&#x548C;&#x517C;&#x6027;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x8FD0;&#x4F5C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63A8;&#x6D4B;&#x4E00;&#x4E9B;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8FD1;&#x7AEF;&#x5021;&#x5BFC;&#x8005;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x9002;&#x5E94;&#x8981;&#x4FDD;&#x6301;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7684;&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x51FD;&#x6570;&#x3002;

&#x7EDD;&#x7F18;&#x5B50;&#x5728;&#x777E;&#x4E38;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

Testis-specific promoters are unique in that relatively short proximal promoters of several genes have been shown to be capable of directing tissue- and cell-type-specific expression in transgenic mice. How such small promoter fragments perform the dual functions of maintaining a silenced state in somatic tissues and activating gene expression in the correct germ-cell type in testis remains poorly understood. Studies from our laboratory using the round spermatid-specific SP-10 gene as an experimental model have provided some insights into the mechanisms involved. It was found that the proximal promoter of the SP-10 gene acts as a chromatin insulator or boundary element in somatic tissues and prevents transcription of the SP-10 gene. In round spermatids, the insulator function is relieved, thus facilitating the SP-10 gene transcription. Insulators act as enhancer blockers and/or barriers to heterochromatin to protect the programmed expression of a gene. Typically, insulators are separable from promoters. In the case of the SP-10 gene, however, the insulator overlaps the promoter and operates in a facultative manner. We hypothesize that the proximal promoters of some testis-specific genes have adapted the insulator function to maintain transcriptional silence in the somatic tissues.

Role of an insulator in testis-specific gene transcription.

Promoteurs sp&eacute;cifiques des testicules sont uniques, car les promoteurs proximales relativement courtes de plusieurs g&egrave;nes ont d&eacute;montr&eacute; d&#39;&ecirc;tre capables de diriger des tissus et cellules-type-expression sp&eacute;cifique chez les souris transg&eacute;niques. Comment ces fragments de petits promoteur exercent les fonctions dual de maintenir un &eacute;tat de silence dans les tissus somatiques et l&#39;activation de l&#39;expression des g&egrave;nes dans le type de cellules germinales correcte dans le testicule reste mal comprise. &Eacute;tudes effectu&eacute;es dans notre laboratoire &agrave; l&#39;aide du g&egrave;ne de SP-10 round spermatid-sp&eacute;cifiques comme mod&egrave;le exp&eacute;rimental ont fourni des id&eacute;es sur les m&eacute;canismes impliqu&eacute;s. Il a &eacute;t&eacute; constat&eacute; que le promoteur proximal du g&egrave;ne SP-10 agit comme un &eacute;l&eacute;ment isolant ou la limite de la chromatine dans les tissus somatiques et emp&ecirc;che la transcription du g&egrave;ne SP-10. Les spermatides ronds, la fonction d&#39;isolant est relev&eacute;e, ce qui facilite la transcription du g&egrave;ne SP-10. Isolateurs agissent comme des bloqueurs de renforceur et/ou des barri&egrave;res &agrave; l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine pour prot&eacute;ger l&#39;expression programm&eacute;e d&#39;un g&egrave;ne. En g&eacute;n&eacute;ral, les isolateurs sont s&eacute;parables des promoteurs. Toutefois, dans le cas du g&egrave;ne SP-10, l&#39;isolateur chevauche le promoteur et fonctionne de mani&egrave;re facultative. Nous &eacute;mettons l&#39;hypoth&egrave;se que les promoteurs proximales de certains g&egrave;nes sp&eacute;cifiques aux testicules sont adapt&eacute;s &agrave; la fonction d&#39;isolant pour garder le silence transcriptionnel dans les tissus somatiques.

R&ocirc;le de l&#39;isolant dans la transcription de g&egrave;nes sp&eacute;cifiques des testicules.

Hoden-spezifische Promotoren sind einzigartig in diesem relativ kurze proximale Promotoren der mehrere Gene gezeigt worden sind, Regie von Gewebe und Zellen-Typ-spezifische Ausdruck in transgenen M&auml;usen werden kann. Wie solche kleinen Projekttr&auml;ger Fragmente dual erhalten einen zum Schweigen gebrachten Zustand in somatischen Geweben und Aktivierung der Genexpression in der richtigen Keimzelltumoren-Typ in Hoden Aufgaben bleibt weitgehend unverstanden. Studien aus unserem Labor mit das Runde Spermatide-spezifische SP-10-gen als ein experimentelles Modell haben einige Einblicke in die Mechanismen zur Verf&uuml;gung gestellt. Es wurde festgestellt, dass der proximale Projekttr&auml;ger im SP-10-gen als Chromatin Isolator oder Begrenzung Element in somatischen Geweben fungiert und verhindert die Transkription des Gens SP-10. In Runde Spermatids ist die Isolator-Funktion erleichtert, und erleichtert so die SP-10 gen-Transkription. Isolatoren dienen als Enhancer-Blocker und/oder Handelshemmnisse Heterochromatin, die programmierte Expression eines Gens zu sch&uuml;tzen. In der Regel sind die Isolatoren von Promotoren. Bei der SP-10 gen jedoch der Isolator &uuml;berlappt den Projekttr&auml;ger und operiert in gewissem Sinne fakultativ. Wir vermuten, dass die proximalen Promotoren der einige Hoden-spezifische Gene die Isolator-Funktion, um in den somatischen Geweben transkriptionelle Stillschweigen angepasst haben.

Rolle der Isolator in der Hoden-spezifische gen-Transkription.

Testicolo specifici promotori sono unici in quanto relativamente breve prossimale promotori di diversi geni sono stati indicati per essere in grado di dirigere l&#39;espressione tessuto e cellula-tipo-specifiche in topi transgenici. Come tali frammenti piccoli promotore svolgono le funzioni duale di mantenere uno stato silenziato nei tessuti somatici e l&#39;attivazione di espressione genica nel tipo corretto di cellule germinali nel testicolo rimane scarsamente comprensibile. Gli studi dal nostro laboratorio usando il gene di SP-10 round spermatid specifici come un modello sperimentale hanno fornito alcuni spunti i meccanismi coinvolti. Si &egrave; accertato che il promotore prossimale del gene SP-10 agisce come elemento di isolante o limite di cromatina nei tessuti somatici e impedisce la trascrizione del gene della SP-10. In spermatidi rotondi, la funzione isolante &egrave; sollevata, facilitando cos&igrave; la trascrizione del gene SP-10. Isolatori agiscono come bloccanti enhancer e/o barriere a eterocromatina per proteggere l&#39;espressione di un gene programmato. In genere, gli isolanti sono separabili dai promotori. Nel caso del gene di SP-10, tuttavia, l&#39;isolante si sovrappone il promotore e opera in maniera facoltativa. Si ipotizza che i promotori prossimali di alcuni geni specifici del testicolo hanno adattato la funzione isolante per mantenere silenzio transcriptional nei tessuti somatici.

Ruolo di un isolante nella trascrizione del gene specifico del testicolo.

&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x77ED;&#x3044;&#x8FD1;&#x4F4D;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x7D44;&#x7E54;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x306A;&#x767A;&#x73FE;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3067;&#x6307;&#x793A;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3067;&#x306F;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x56FA;&#x6709;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x65AD;&#x7247;&#x304C;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x6C88;&#x9ED9;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x3001;&#x6B63;&#x3057;&#x3044;&#x80DA;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x3067;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x306F;&#x3088;&#x304F;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x30C9; spermatid &#x56FA;&#x6709; SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x304B;&#x3089;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x3001;SP-10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8FD1;&#x4F4D;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x5185;&#x306E;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5883;&#x754C;&#x8981;&#x7D20;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x3001;SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x9632;&#x304E;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E38;&#x3044;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x3053;&#x3046;&#x3057;&#x3066; SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x7D76;&#x7E01;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304C;&#x5B89;&#x5FC3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30CF;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x306E;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AB;&#x30FC;&#x3084;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F0F;&#x3092;&#x4FDD;&#x8B77;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D8;&#x30C6;&#x30ED;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x306E;&#x969C;&#x58C1;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x901A;&#x5E38;&#x3001;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x4E0D;&#x53EF;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;SP 10 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5834;&#x5408;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x91CD;&#x306A;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x901A;&#x6027;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x52D5;&#x4F5C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8FD1;&#x4F4D;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x8EE2;&#x5199;&#x6C88;&#x9ED9;&#x306E;&#x4E2D;&#x3067;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x95A2;&#x6570;&#x3092;&#x9069;&#x5FDC;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7D76;&#x7E01;&#x4F53;&#x306E;&#x7CBE;&#x5DE3;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x5199;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3002;

&#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC740; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC9E7;&#xC740; &#xADFC; &#xC704; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC870;&#xC9C1;-&#xC140; &#xC720;&#xD615;&#xBCC4; &#xC2DD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &#xC950;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xAC10;&#xB3C5;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC774; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC791;&#xC740; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC870;&#xAC01; &#xAC19;&#xC740; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xC785; &#xB9C9; &#xC74C;&#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0; &#xC62C;&#xBC14;&#xB978; &#xC138;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xC785;&#xB825; &#xACE0;&#xD658;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC758; &#xB4C0;&#xC5BC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xC774;&#xD574; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB77C;&#xC6B4;&#xB4DC; spermatid &#xD2B9;&#xC815; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBAA8;&#xB378;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC800;&#xD76C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xCC38;&#xC5EC; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD588;&#xB2E4;. SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xADFC; &#xC704; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; chromatin &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xB610;&#xB294; &#xACBD;&#xACC4; &#xC694;&#xC18C;&#xC640; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC804;&#xC0AC;&#xB97C; &#xBC29;&#xC9C0; &#xAC83;&#xC774; &#xBC1D;&#xD600;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xB77C;&#xC6B4;&#xB4DC; spermatids&#xC5D0;&#xC11C; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC0AC; &#xCD09;&#xC9C4; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xD568;&#xC218; &#xC548;&#xC2EC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xC99D;&#xAC15; &#xCC28;&#xB2E8;&#xC81C; &#xBC0F;/&#xB610;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xB41C; &#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xD638; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC12C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC7A5;&#xBCBD; &#xC5ED;&#xD560;. &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xB9AC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; SP 10 &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xACBD;&#xC6B0;, &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC911;&#xBCF5; &#xBC0F; &#xC758;&#xC0AC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC791;&#xB3D9;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC77C;&#xBD80; &#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xADFC; &#xC704; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1; transcriptional &#xCE68;&#xBB35;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4; &#xD568;&#xC218; &#xC801;&#xC751; &#xD588;&#xB2E4; &#xAC00;&#xC124;.

&#xACE0;&#xD658; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xB179;&#xC74C; &#xBC29;&#xC1A1;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC808;&#xC5F0;&#xCCB4;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;.

Promotores espec&iacute;ficos de test&iacute;culo son &uacute;nicos en eso relativamente cortos proximales promotores de varios genes han demostrado ser capaces de dirigir la expresi&oacute;n espec&iacute;fica de tejido y c&eacute;lulas tipo en ratones transg&eacute;nicos. &iquest;C&oacute;mo dichos fragmentos peque&ntilde;os promotor realizan las funciones duales de mantener un estado silenciado en tejidos som&aacute;ticos y activaci&oacute;n de la expresi&oacute;n g&eacute;nica en el tipo correcto de la c&eacute;lula de germen en test&iacute;culo sigue siendo mal entendida. Estudios de nuestro laboratorio utilizando el gen de SP-10 ronda spermatid espec&iacute;ficos como modelo experimental han proporcionado algunas ideas sobre los mecanismos implicados. Se encontr&oacute; que el promotor proximal del gen SP-10 act&uacute;a como un elemento aislante o l&iacute;mite de cromatina en tejidos som&aacute;ticos y previene la transcripci&oacute;n del gen SP-10. En las esperm&aacute;tidas redondas, se alivia la funci&oacute;n aislante, facilitando as&iacute; la transcripci&oacute;n del gen de SP-10. Aisladores act&uacute;an como bloqueadores de reforzador o barreras para proteger la expresi&oacute;n programada de un gen de la heterocromatina. T&iacute;picamente, los aisladores son separables de promotores. En el caso del gen de la SP-10, sin embargo, el aislador superpone el promotor y opera de manera facultativa. Presumimos que los promotores proximales de algunos genes espec&iacute;ficos de test&iacute;culo han adaptado a la funci&oacute;n de aislante para mantener silencio transcripcional en los tejidos som&aacute;ticos.

Funci&oacute;n de un aislador en la transcripci&oacute;n de genes espec&iacute;ficos de test&iacute;culo.

&#x5355;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x514B;&#x9686;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x662F;&#x4EBA;&#x4F53;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x5BFC;&#x81F4;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x6027;&#x75E2;&#x75BE;&#x548C;&#x809D;&#x8113;&#x80BF;&#x3002;&#x8C03;&#x5236;&#x7684;&#x80A0;&#x9053;&#x5B9A;&#x690D;&#x548C;&#x5165;&#x4FB5;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x5168;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5206;&#x6790;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E0A;&#x8C03;&#x8C08;&#x8BDD;&#x5185;&#x5BB9;&#x7F16;&#x7801;&#x4E00;&#x79CD;&#x63A8;&#x5B9A;&#x9AD8;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7387;&#x65CF;&#x6846; (&#x86CB;&#x767D;) &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;EhHMGB1&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x4E86;&#x5982;&#x679C; EhHMGB1 &#x7F16;&#x7801;&#x529F;&#x80FD;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x786E;&#x5B9A;&#x5176;&#x5728;&#x63A7;&#x5236;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x91CD;&#x7EC4; EhHMGB1 &#x5F97;&#x4EE5;&#x5F2F;&#x66F2; DNA &#x4F53;&#x5916;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x6838;&#x5FC3;&#x5B88;&#x6052;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x5F2F;&#x66F2;&#x6D3B;&#x52A8;&#x4E2D;&#x5176;&#x4ED6;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684; DNA &#x7A81;&#x53D8;&#x5206;&#x6790;&#x662F;&#x5FC5;&#x4E0D;&#x53EF;&#x5C11;&#x7684; EhHMGB1 &#x6D3B;&#x52A8;&#x7684;&#x6F14;&#x793A;&#x4E86;&#x3002;EhHMGB1 &#x4E5F;&#x80FD;&#x63D0;&#x9AD8;&#x5230;&#x4F53;&#x5916;&#xFF0C;&#x5176;&#x540C;&#x6E90; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B; p53 &#x9884;&#x8BA1; HMGB1 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x5171;&#x805A;&#x7126;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x3001; &#x6297;&#x4F53;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x5176;&#x6838;&#x7684;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x3002;EhHMGB1 HM1:IMSS &#x6ECB;&#x517B;&#x4E2D;&#x7684;&#x8FC7;&#x91CF;&#x8868;&#x8FBE;&#x5BFC;&#x81F4; 33 &#x8A8A;&#x672C;&#x53C2;&#x4E0E;&#x591A;&#x79CD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5176;&#x4E2D;&#xFF0C;20 &#x4E5F;&#x88AB;&#x8C03;&#x5236;&#x5728;&#x7B2C; 1 &#x5929;&#x6216;&#x8005;&#x4E00;&#x5929; 29 &#x5728;&#x80A0;&#x9053;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x6A21;&#x578B;&#x3002;&#x503C;&#x5F97;&#x6CE8;&#x610F;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x56DB;&#x4E2A;&#x6210;&#x7EE9;&#x5355;&#x4E0E;&#x5DF2;&#x77E5;&#x89D2;&#x8272;&#x7684;&#x6BD2;&#x529B;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7F16;&#x7801; Gal/&#x591A;&#x51DD;&#x96C6;&#x7D20;&#x8F7B;&#x94FE;&#xFF0C;&#x88AB;&#x8C03;&#x5236;&#x54CD;&#x5E94; EhHMGB1 &#x9AD8;&#x6548;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BA4;&#x4E3A; EhHMGB1 &#x662F;&#x5584;&#x610F;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x4E0E;&#x590D;&#x8FF0;&#x90E8;&#x5206;&#x4E3B;&#x673A;&#x80A0;&#x9053;&#x9002;&#x5E94;&#x671F;&#x95F4;&#x770B;&#x5230;&#x7684;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x8C03;&#x63A7;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;

&#x8868;&#x5F81;&#x7684;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x6846;&#x9AD8;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7387;&#x65CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x671F;&#x95F4;&#x80A0;&#x9053;&#x611F;&#x67D3;&#x3002;

The unicellular eukaryote Entamoeba histolytica is a human parasite that causes amebic dysentery and liver abscess. A genome-wide analysis of gene expression modulated by intestinal colonization and invasion identified an upregulated transcript that encoded a putative high-mobility-group box (HMGB) protein, EhHMGB1. We tested if EhHMGB1 encoded a functional HMGB protein and determined its role in control of parasite gene expression. Recombinant EhHMGB1 was able to bend DNA in vitro, a characteristic of HMGB proteins. Core conserved residues required for DNA bending activity in other HMGB proteins were demonstrated by mutational analysis to be essential for EhHMGB1 activity. EhHMGB1 was also able to enhance the binding of human p53 to its cognate DNA sequence in vitro, which is expected for an HMGB1 protein. Confocal microscopy, using antibodies against the recombinant protein, confirmed its nuclear localization. Overexpression of EhHMGB1 in HM1:IMSS trophozoites led to modulation of 33 transcripts involved in a variety of cellular functions. Of these, 20 were also modulated at either day 1 or day 29 in the mouse model of intestinal amebiasis. Notably, four transcripts with known roles in virulence, including two encoding Gal/GalNAc lectin light chains, were modulated in response to EhHMGB1 overexpression. We concluded that EhHMGB1 was a bona fide HMGB protein with the capacity to recapitulate part of the modulation of parasite gene expression seen during adaptation to the host intestine.

Characterization of an Entamoeba histolytica high-mobility-group box protein induced during intestinal infection.

Le histolytica d&#39;Entamoeba unicellulaire eucaryote est un parasite humain qui provoque la dysenterie amibienne et abc&egrave;s du foie. Une analyse du g&eacute;nome de l&#39;expression g&eacute;nique, modul&eacute;e par l&#39;invasion et la colonisation de l&#39;intestin a identifi&eacute; une transcription surexprim&eacute;s codant une prot&eacute;ine de la zone de haute-mobilit&eacute;-Groupe putatif (BHGM), EhHMGB1. Nous avons test&eacute; si EhHMGB1 cod&eacute; une prot&eacute;ine BHGM fonctionnelle et d&eacute;terminer son r&ocirc;le dans le contr&ocirc;le de l&#39;expression g&eacute;nique de parasite. EhHMGB1 recombinante a &eacute;t&eacute; capable de plier l&#39;ADN in vitro, une caract&eacute;ristique des prot&eacute;ines BHGM. R&eacute;sidus de base conserv&eacute; requis pour ADN flexion activit&eacute; dans d&#39;autres prot&eacute;ines BHGM ont &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute;s par une analyse mutationnelle sont indispensables pour l&#39;activit&eacute; EhHMGB1. EhHMGB1 est &eacute;galement en mesure d&#39;am&eacute;liorer la fixation de la p53 humaine &agrave; ses apparent&eacute; s&eacute;quence d&#39;ADN in vitro, qui est attendu pour une prot&eacute;ine HMGB1. Microscopie confocale, utilisant des anticorps contre la prot&eacute;ine recombinante, a confirm&eacute; sa localisation nucl&eacute;aire. Surexpression de la EhHMGB1 en HM1:IMSS de trophozo&iuml;tes conduit &agrave; modulation de 33 transcriptions impliqu&eacute;es dans une vari&eacute;t&eacute; de fonctions cellulaires. Parmi eux, 20 ont &eacute;t&eacute; &eacute;galement modul&eacute; au 1er jour ou jour 29 dans le mod&egrave;le murin d&#39;amibiase intestinale. Notamment, les quatre transcriptions avec des r&ocirc;les connus dans la virulence, dont deux encodage des cha&icirc;nes l&eacute;g&egrave;res de Gal/GalNAc lectine, ont &eacute;t&eacute; modul&eacute;es en r&eacute;ponse &agrave; une surexpression de EhHMGB1. Nous avons conclu que EhHMGB1 &eacute;tait une prot&eacute;ine BHGM justifi&eacute;e pour pouvoir r&eacute;capituler le cadre de la modulation de l&#39;expression g&eacute;nique de parasite vue durant l&#39;adaptation &agrave; l&#39;intestin de l&#39;h&ocirc;te.

Caract&eacute;risation d&#39;une prot&eacute;ine de haut-mobilit&eacute;-Groupe bo&icirc;te Entamoeba histolytica induites au cours de l&#39;infection intestinale.

Die einzelligen Eukaryoten Entamoeba Histolytica ist ein menschlicher Parasit, der Amebic Ruhr und Leber Abszess verursacht. Eine genomweiten Analyse der Genexpression moduliert durch intestinale Kolonisation und Invasion identifiziert eine herraufreguliert Abschrift, die ein mutma&szlig;liches im hoch-Mobilit&auml;t-Gruppe (HMGB)-Protein, EhHMGB1 codiert. Wir getestet, ob EhHMGB1 eine funktionelle HMGB-Protein codiert und seine Rolle bei der Kontrolle der Genexpression von Parasiten bestimmt. Rekombinante EhHMGB1 konnte DNA in vitro ein Merkmal der HMGB Proteine zu biegen. Kern konserviert R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;r DNA Biegung T&auml;tigkeit in anderen HMGB Proteinen erforderlich wurden von mutagenen Analyse ist notwendig f&uuml;r EhHMGB1 T&auml;tigkeit demonstriert. EhHMGB1 konnte auch die Bindung von menschlichen p53 zu seinen Verwandten DNA-Sequenz, die in vitro zu erh&ouml;hen, wodurch f&uuml;r eine HMGB1-Protein erwartet wird. Confocal Mikroskopie, unter Verwendung der Antik&ouml;rper gegen das rekombinante Protein, best&auml;tigt seine nukleare Lokalisierung. Eine &Uuml;berexpression von EhHMGB1 in HM1:IMSS Trophozoiten f&uuml;hrte zur Modulation der 33 Abschriften verschiedener Zellfunktionen beteiligt. Von diesen waren 20 auch am Tag 1 oder Tag 29 im Mausmodell der intestinale Am&ouml;biasis moduliert. Insbesondere wurden vier Abschriften mit bekannten Rollen in Virulenz, darunter zwei Codierung Gal/GalNAc Lektin helle Ketten, als Reaktion auf EhHMGB1 eine &Uuml;berexpression moduliert. Wir festgestellt, dass EhHMGB1 ein gutgl&auml;ubiger HMGB Protein mit einer Kapazit&auml;t von rekapitulieren Teil der Modulation der Parasit Genexpression w&auml;hrend der Anpassung an den Host-Darm gesehen wurde.

Charakterisierung eines Entamoeba Histolytica hoch-Mobilit&auml;t-Gruppenfeld Proteins induziert w&auml;hrend Darm-Infektion.

L&#39;eucariote unicellulare Entamoeba histolytica &egrave; un parassita umano che provoca dissenteria amebica e ascesso epatico. Un&#39;analisi genome-wide di espressione genica modulata dall&#39;invasione e colonizzazione intestinale identificato una trascrizione sovraregolati che codifica una proteina putativa high-mobility-gruppo casella (HMGB), EhHMGB1. Abbiamo testato se EhHMGB1 con codifica una proteina funzionale HMGB e determinato il suo ruolo nel controllo dell&#39;espressione genica parassita. EhHMGB1 ricombinante &egrave; stato in grado di piegare il DNA in vitro, una caratteristica delle proteine HMGB. Residui di nucleo conservato necessarie per attivit&agrave; di piegatura in altre proteine HMGB DNA sono state dimostrate da analisi mutazionale di essere essenziale per l&#39;attivit&agrave; di EhHMGB1. EhHMGB1 &egrave; stato anche in grado di rafforzare il legame di p53 umana al suo cognata sequenza di DNA in vitro, che &egrave; previsto per una proteina HMGB1. Microscopia confocale, usando gli anticorpi contro la proteina ricombinante, ha confermato la sua localizzazione nucleare. Sovraespressione di EhHMGB1 in HM1:IMSS trofozoiti port&ograve; alla modulazione delle 33 trascrizioni coinvolte in una variet&agrave; di funzioni cellulari. Di questi, 20 erano anche modulato al giorno 1 o giorno 29 nel modello del mouse di amebiasi intestinale. In particolare, quattro trascrizioni con ruoli noti nella virulenza, incluse due codifica Gal/GalNAc catene lectina, erano modulate in risposta a EhHMGB1 sovraespressione. Abbiamo concluso che il EhHMGB1 era una bona fide proteine HMGB con la capacit&agrave; di riassumere parte della modulazione dell&#39;espressione genica parassita visto durante l&#39;adattamento per l&#39;intestino dell&#39;ospite.

Caratterizzazione di una proteina di alto-mobilit&agrave;-gruppo casella Entamoeba histolytica indotta durante l&#39;infezione intestinale.

&#x5358;&#x7D30;&#x80DE;&#x771E;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x8D64;&#x75E2;&#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0; &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x6027;&#x8D64;&#x75E2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x809D;&#x81BF;&#x760D;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3059;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5909;&#x8ABF;&#x8178;&#x7BA1;&#x5B9A;&#x7740;&#x3068;&#x4FB5;&#x7565;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x89E3;&#x6790;&#x63A8;&#x5B9A;&#x306E;&#x9AD8;&#x30E2;&#x30D3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3; &#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7; &#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; (HMGB) &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3001;EhHMGB1 &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x767A;&#x73FE;&#x4EA2;&#x9032;&#x8B04;&#x672C;&#x8B58;&#x5225;&#x3002;EhHMGB1 &#x6A5F;&#x80FD;&#x7684; HMGB &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x5236;&#x5FA1;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x305D;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3068;&#x5224;&#x65AD;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x6211;&#x3005; &#x304C;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3002;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048; EhHMGB1 DNA in vitro HMGB &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3092;&#x66F2;&#x3052;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x66F2;&#x3052;&#x4ED6; HMGB &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E; DNA &#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30A2;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x6B8B;&#x57FA; EhHMGB1 &#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;EhHMGB1 &#x306F;&#x307E;&#x305F; HMGB1 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x671F;&#x5F85;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; p53 &#x3092;&#x305D;&#x306E;&#x540C;&#x65CF;&#x306E; DNA &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x5171;&#x7126;&#x70B9;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3001;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x305D;&#x306E;&#x6838;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;HM1:IMSS &#x6804;&#x990A;&#x578B;&#x3067; EhHMGB1 &#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306F; 33 &#x306E;&#x6210;&#x7E3E;&#x8A3C;&#x660E;&#x66F8;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E; 20 &#x306F;&#x307E;&#x305F; 1 &#x65E5;&#x307E;&#x305F;&#x306F; 1 &#x65E5; 29 &#x8178;&#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x75C7;&#x306E;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3067;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x6BD2;&#x6027;&#x3001;&#x30AE;&#x30E3;&#x30EB;/GalNAc &#x30EC;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x8EFD;&#x9396;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; 2 &#x540D;&#x3092;&#x542B;&#x3080; 4 &#x6210;&#x7E3E;&#x8A3C;&#x660E;&#x66F8; EhHMGB1 &#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x3078;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3067;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; EhHMGB1 &#x5584;&#x610F; HMGB &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x8178;&#x7BA1;&#x3078;&#x306E;&#x9069;&#x5FDC;&#x306E;&#x4E2D;&#x306B;&#x898B;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3092;&#x8981;&#x7D04;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x7D50;&#x8AD6;&#x306B;&#x9054;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x4E2D;&#x8178;&#x306E;&#x611F;&#x67D3;&#x8A98;&#x5C0E;&#x8D64;&#x75E2;&#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x306E;&#x9AD8;&#x30E2;&#x30D3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3; &#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7; &#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x3002;

&#xB2E8; &#xC138;&#xD3EC; &#xC9C4;&#xD575;&#xC0DD;&#xBB3C; Entamoeba histolytica amebic&#xC774; &#xC9C8; &#xC6D0;&#xC778;&#xACFC; &#xAC04; &#xB18D; &#xC591; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC7A5; &#xC2DD;&#xBBFC;&#xC9C0;&#xC640; &#xCE68;&#xB7B5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBCC0;&#xC870; &#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; &#xBD84;&#xC11D; &#xC0C1; &#xB192;&#xC740; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; &#xADF8;&#xB8F9; &#xC0C1;&#xC790; (HMGB) &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, Ehhmgb1&#xB85C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; upregulated &#xC131;&#xC801;&#xD45C;&#xB97C; &#xD655;&#xC778;. EhHMGB1 &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xAE30;&#xB2A5; HMGB &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xC81C;&#xC5B4; &#xD558;&#xB294; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xACB0;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;. &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; EhHMGB1 DNA &#xCCB4; &#xC678;, HMGB &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAD6C; &#xBD80; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xB978; HMGB &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xBCA4;&#xB529; &#xD558;&#xB294; DNA&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xD575;&#xC2EC; &#xBCF4;&#xC874; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; mutational &#xBD84;&#xC11D; EhHMGB1 &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. EhHMGB1 HMGB1 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC608;&#xC0C1; &#xB418;&#xB294; &#xCCB4; &#xC678;, &#xB3D9;&#xC871; DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; p53&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD5A5;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Confocal &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;, &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300;&#xD558;&#xC5EC; &#xD56D; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xADF8; &#xD575; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4;. HM1:IMSS trophozoites&#xC5D0;&#xC11C; Ehhmgb1&#xC758; overexpression 33 &#xC131;&#xC801;&#xD45C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xC5EC;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870;&#xB97C; &#xC774;&#xB04C;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB4E4;&#xC758; 20&#xB3C4; 1 &#xC77C; &#xB610;&#xB294; &#xD558;&#xB8E8; 29 &#xC7A5; amebiasis&#xC758; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xBAA8;&#xB378;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCC0;&#xC870; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xB3C5;&#xC131;, &#xB450; &#xC5EC;&#xC790;/GalNAc lectin &#xBE5B; &#xCCB4;&#xC778;, &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xB4F1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xC5ED;&#xD560;&#xACFC; 4 &#xC131;&#xC801; &#xC99D;&#xBA85;&#xC11C; EhHMGB1 overexpression&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCC0;&#xC870; &#xD588;&#xB2E4;. EhHMGB1 &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xCC3D; &#xC790;&#xC5D0; &#xC801;&#xC751; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBCF8; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80;&#xB97C; &#xC815;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xC6A9;&#xB7C9; &#xD0C0;&#xACE0; &#xB09C; HMGB &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; &#xACB0;&#xB860;&#xC744; &#xB0B4;&#xB838;&#xB2E4;.

&#xCC3D; &#xC790; &#xAC10;&#xC5FC; &#xC2DC; Entamoeba histolytica &#xB192;&#xC740; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; &#xADF8;&#xB8F9; &#xC0C1;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC720;&#xB3C4; &#xB41C;&#xB2E4;.

Los eucariotas unicelulares Entamoeba histolytica es un par&aacute;sito humano causante de la disenter&iacute;a amebiana y absceso hep&aacute;tico. Un an&aacute;lisis del genoma de la expresi&oacute;n g&eacute;nica modulada por la invasi&oacute;n y colonizaci&oacute;n intestinal identific&oacute; una transcripci&oacute;n de alza que codifican una prote&iacute;na supuesta alto-movilidad-grupo caja (HMGB), EhHMGB1. Probamos si EhHMGB1 codifican una prote&iacute;na funcional de HMGB y determina su papel en el control de la expresi&oacute;n g&eacute;nica de par&aacute;sito. EhHMGB1 recombinante fue capaz de doblar el ADN in vitro, una caracter&iacute;stica de las prote&iacute;nas HMGB. Residuos de n&uacute;cleo conservada necesarios para doblar la actividad en otras prote&iacute;nas HMGB de ADN fueron demostrados por el an&aacute;lisis mutacional esencial para la actividad EhHMGB1. EhHMGB1 tambi&eacute;n fue capaz de aumentar la Uni&oacute;n de p53 humana a su secuencia de ADN cognado in vitro, que se espera para una prote&iacute;na HMGB1. Microscopia confocal, usando los anticuerpos contra la prote&iacute;na recombinante, confirm&oacute; su localizaci&oacute;n nuclear. Sobreexpresi&oacute;n de EhHMGB1 en HM1:IMSS trofozoitos condujo a la modulaci&oacute;n de las 33 transcripciones implicadas en una variedad de funciones celulares. De &eacute;stos, 20 fueron tambi&eacute;n modulada en d&iacute;a 1 o el d&iacute;a 29 en el modelo murino de la amebiasis intestinal. En particular, cuatro transcripciones con papeles conocidos en virulencia, incluyendo dos cadenas ligeras de la lectina de Gal/GalNAc, de codificaci&oacute;n fueron moduladas en respuesta a la sobreexpresi&oacute;n de EhHMGB1. Llegamos a la conclusi&oacute;n que EhHMGB1 era una prote&iacute;na buena fe de HMGB con capacidad para recapitular parte de la modulaci&oacute;n de la expresi&oacute;n g&eacute;nica de par&aacute;sito huaycos adaptaci&oacute;n al intestino del hu&eacute;sped.

Caracterizaci&oacute;n de una prote&iacute;na de alta movilidad-grupo caja de Entamoeba histolytica inducida durante la infecci&oacute;n intestinal.

&#x65E9;&#x671F;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x514B;&#x9686;&#x5206;&#x652F;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x662F;&#x662F;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x6027;&#x75E2;&#x75BE;&#x548C;&#x809D;&#x8113;&#x80BF;&#x7684;&#x75C5;&#x56E0;&#x4EE3;&#x7406;&#x7684;&#x4EBA;&#x4F53;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x3002;E.&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x82AF;&#x7247;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E0E;&#x76F8;&#x7ED3;&#x5408; E.&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x5DF2;&#x5BFC;&#x81F4;&#x4E0E;&#x6BD2;&#x529B;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x8C31;&#x7684;&#x9274;&#x5B9A;&#x3002;&#x5F88;&#x591A;&#x8C03;&#x5236;&#x8A8A;&#x672C;&#x51FD;&#x6570;&#x662F;&#x672A;&#x77E5;&#x548C;&#x5176;&#x81F4;&#x75C5;&#x6027;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x5C1A;&#x4E0D;&#x6E05;&#x695A;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x4EE3;&#x8868;&#x6C60;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x53EF;&#x80FD;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x7597;&#x6CD5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x6BD2;&#x529B;&#x56E0;&#x5B50;&#x3002;&#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x548C;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x65B0;&#x7684;&#x81F4;&#x75C5;&#x76F8;&#x5173;&#x57FA;&#x56E0;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x5C06;&#x662F;&#x6709;&#x76CA;&#x7684;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x514B;&#x9686;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684; Gateway((R)) &#x6765;&#x751F;&#x6210; E.&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x591A;&#x73AF;&#x82B3;&#x70C3;-DEST &#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x82E5;&#x8981;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x6B64;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x6548;&#x7528;&#xFF0C;&#x77E2;&#x91CF;&#x7528;&#x6765;&#x6784;&#x5EFA;&#x8D28;&#x7C92;&#x91CD;&#x7EC4;&#x7248;&#x672C;&#x7684; EHI_144490&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x7F16;&#x7801;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x672A;&#x77E5;&#x51FD;&#x6570;&#x7684;&#x8F68;&#x8FF9;&#x3002;&#x6709;&#x4EBA;&#x8868;&#x793A;&#x91CD;&#x7EC4;&#x57FA;&#x56E0;&#x548C;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x662F;&#x94FE;&#x7403;&#x83CC; myc &#x6807;&#x8BB0;&#xFF0C;&#x663E;&#x793A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x7684;&#x8F6C;&#x67D3;&#x6ECB;&#x517B;&#x3002;&#x8FD9;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0E; Gateway((R)) &#x7CFB;&#x7EDF;&#x5E94;&#x4FBF;&#x5229;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; E.&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5185;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x7684;&#x8C03;&#x67E5;&#x3002;

&#x514B;&#x9686;&#x4E0E;&#x8868;&#x8FBE;&#x57FA;&#x56E0;&#x963F;&#x7C73;&#x5DF4;&#x7684;&#x7F51;&#x5173;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x5F00;&#x53D1;&#x3002;

The early branching eukaryote Entamoeba histolytica is a human parasite that is the etiologic agent of amebic dysentery and liver abscess. The sequencing of the E. histolytica genome combined with the development of an E. histolytica microarray has resulted in the identification of several distinct gene expression profiles associated with virulence. The function of many modulated transcripts is unknown and their role in pathogenicity is unclear. They however represent a pool of potential virulence factors that could be targets for the development of novel therapeutics. Efficient tools and methods to characterize these novel virulence-associated genes and proteins would be beneficial. Here we report the use of the Gateway((R)) cloning system to generate the E. histolytica expression vector pAH-DEST. To test the usefulness of this system, the vector was used to construct a plasmid containing a recombinant version of the locus EHI_144490, which encoded a protein of unknown function. The recombinant gene was expressed and the recombinant protein, which was strep-myc-tagged, showed a cytoplasmic localization in transfected trophozoites. This expression vector with the Gateway((R)) system should facilitate investigation into the functions of novel proteins in E. histolytica.

Development of the Gateway system for cloning and expressing genes in Entamoeba histolytica.

La ramification pr&eacute;coce eucaryote Entamoeba histolytica est un parasite humain qui est l&#39;agent &eacute;tiologique de la dysenterie amibienne et abc&egrave;s du foie. Le s&eacute;quen&ccedil;age du g&eacute;nome d &#39; Entamoeba histolytica combin&eacute; avec le d&eacute;veloppement d&#39;un micror&eacute;seau d&#39;Entamoeba histolytica a permis l&#39;identification de plusieurs profils d&#39;expression g&eacute;nique distincts associ&eacute;s avec virulence. La fonction de nombreuses transcriptions modul&eacute;es est inconnue et leur r&ocirc;le dans la pathog&eacute;nie n&#39;est pas clair. Cependant, ils repr&eacute;sentent un ensemble de facteurs de virulence potentiels qui pourraient &ecirc;tre des cibles pour le d&eacute;veloppement de traitements novateurs. Des outils efficaces et des m&eacute;thodes pour caract&eacute;riser ces nouveaux g&egrave;nes associ&eacute;s &agrave; la virulence et les prot&eacute;ines serait b&eacute;n&eacute;fiques. Nous rapportons ici l&#39;utilisation de la Gateway((R)) syst&egrave;me de clonage pour g&eacute;n&eacute;rer l&#39;Entamoeba histolytica expression vector HAP-DEST. Pour tester l&#39;utilit&eacute; de ce syst&egrave;me, le vecteur utilis&eacute; pour construire un plasmide contenant une version recombin&eacute;e du locus EHI_144490, cod&eacute;s d&#39;une prot&eacute;ine de fonction inconnue. Le g&egrave;ne recombinant a &eacute;t&eacute; exprim&eacute; et la prot&eacute;ine recombinante, qui &eacute;tait le strep-myc-tag, ont montr&eacute; une localisation cytoplasmique en trophozo&iuml;tes transfect&eacute;es. Ce vecteur d&#39;expression avec le syst&egrave;me de Gateway((R)) devrait faciliter l&#39;enqu&ecirc;te sur les fonctions des prot&eacute;ines nouvelles dans E. histolytica.

D&eacute;veloppement du syst&egrave;me de clonage et d&#39;exprimer des g&egrave;nes &agrave; Entamoeba histolytica Gateway.

Die fr&uuml;hen Verzweigung Eukaryote Entamoeba Histolytica ist ein menschlicher Parasit, der die &auml;tiologische Agent von Amebic Dysenterie und Leber Abszess. Die Sequenzierung des Genoms E. Histolytica kombiniert mit der Entwicklung einer E. Histolytica Microarray f&uuml;hrte die Identifizierung mehrerer unterschiedliche Gen-Ausdruck-Profile, die Virulenz zugeordnet. Die Funktion von vielen modulierten Mitschriften ist unbekannt, und ihre Rolle bei der Pathogenit&auml;t ist unklar. Sie stellen jedoch einen Pool von potenziellen Virulenzfaktoren, die Ziele f&uuml;r die Entwicklung neuartiger Therapeutika sein k&ouml;nnte. Effiziente Werkzeuge und Methoden, diese neuartige Virulenz-assoziierten Gene und Proteine zu charakterisieren w&auml;re vorteilhaft. Hier berichten wir &uuml;ber die Verwendung der Gateway((R)) System zu klonen, die E. Histolytica Ausdruck Vektor Pak-DEST zu generieren. Um die N&uuml;tzlichkeit dieses Systems zu testen, wurde der Vektor verwendet, um ein Plasmid enth&auml;lt eine rekombinante Version des Orts EHI_144490, die kodiert ein Protein unbekannter Funktion zu konstruieren. Das rekombinante gen dr&uuml;ckte und das rekombinante Protein, das Strep-Myc-Tag war, zeigte eine cytoplasmatische Lokalisierung in transfizierte Trophozoiten. Dieser Ausdruck Vektor mit dem Gateway((R))-System sollte die Untersuchung &uuml;ber die Funktionen der neuartige Proteine in E. Histolytica erleichtern.

Entwicklung des Gateway-Systems f&uuml;r das Klonen und Ausdruck der Gene in Entamoeba Histolytica.

La precoce ramificazione dell&#39;eucariota Entamoeba histolytica &egrave; un parassita umano che &egrave; l&#39;agente eziologico della dissenteria amebica e ascesso epatico. Il sequenziamento del genoma di E. histolytica combinato con lo sviluppo di un microarray E. histolytica ha portato all&#39;individuazione dei diversi profili di espressione genica distinti associati con virulenza. La funzione di molte trascrizioni modulate &egrave; sconosciuta e il loro ruolo nella patogenicit&agrave; &egrave; poco chiaro. Essi rappresentano tuttavia un pool di potenziali fattori di virulenza che potrebbero essere gli obiettivi per lo sviluppo di nuove terapie. Efficienti strumenti e metodi per caratterizzare questi nuovi geni di virulenza associati e proteine sarebbe utile. Qui riportiamo l&#39;uso di Gateway((R)) sistema di clonazione per generare l&#39;e. histolytica espressione vettoriale pAH-DEST. Per testare l&#39;utilit&agrave; di questo sistema, il vettore &egrave; stato utilizzato per costruire un plasmide contenente una versione ricombinante del locus EHI_144490, che codifica una proteina a funzione sconosciuta. Il gene ricombinante &egrave; stato espresso e la proteina ricombinante, che &egrave; stata mal-myc-tagged, ha mostrato una localizzazione citoplasmatica in trofozoiti transfected. Questo vettore di espressione con il sistema Gateway((R)) dovrebbe facilitare inchiesta le funzioni delle proteine romanzo di E. histolytica.

Sviluppo del sistema di Gateway per la clonazione e l&#39;espressione dei geni di Entamoeba histolytica.

&#x521D;&#x671F;&#x5206;&#x5C90;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x8D64;&#x75E2;&#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0; &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x6027;&#x8D64;&#x75E2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x809D;&#x81BF;&#x760D;&#x306E;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x3067;&#x3059;&#x3002;E. &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0; &#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3068;&#x76F8;&#x307E;&#x3063;&#x3066; E. &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0; &#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x75C5;&#x539F;&#x6027;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x3067;&#x8D77;&#x56E0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6210;&#x7E3E;&#x8A3C;&#x660E;&#x66F8;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306F;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x75C5;&#x539F;&#x6027;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5F79;&#x5272;&#x306F;&#x660E;&#x78BA;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x65B0;&#x898F;&#x6CBB;&#x7642;&#x85AC;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x76EE;&#x6A19;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x75C5;&#x539F;&#x56E0;&#x5B50;&#x306E;&#x30D7;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3084;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x306E;&#x75C5;&#x539F;&#x6027;&#x95A2;&#x9023;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3084;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x6709;&#x76CA;&#x3067; &#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;E. &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x5F0F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB; pAH-DEST &#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30F3;&#x4F5C;&#x6210; Gateway((R)) &#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x6709;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x6A5F;&#x80FD;&#x672A;&#x77E5;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; EHI_144490 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5EA7;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x69CB;&#x7BC9;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x9023;&#x9396;&#x7403;&#x83CC; myc &#x30BF;&#x30B0;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5C40;&#x5728; transfected &#x6804;&#x990A;&#x578B;&#x3067;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC; Gateway((R)) &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068; E. &#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x3067;&#x65B0;&#x898F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x8D64;&#x75E2;&#x30A2;&#x30E1;&#x30FC;&#x30D0;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x8868;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x30A6;&#x30A7;&#x30A4; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x958B;&#x767A;

&#xCD08;&#xBC18; &#xBD84;&#xAE30; &#xC9C4;&#xD575;&#xC0DD;&#xBB3C; Entamoeba histolytica amebic&#xC774; &#xC9C8;&#xACFC; &#xAC04; &#xB18D; &#xC591;&#xC758; etiologic &#xC5D0;&#xC774;&#xC804;&#xD2B8;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; &#xC774;&#xB2E4;. E. histolytica microarray &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; E. histolytica &#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC740; &#xB3C5;&#xC131;&#xACFC; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC2DD; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;. &#xB9CE;&#xC740; &#xBCC0;&#xC870; &#xC131;&#xC801;&#xD45C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC740; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xACE0; pathogenicity&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC740; &#xBD84;&#xBA85; &#xD558;&#xC9C0;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC81C;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1;&#xC774; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xB3C5;&#xC131; &#xC694;&#xC778;&#xC758; &#xD480;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xC640; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC18C;&#xC124; &#xB3C5;&#xC131; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC640; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB420; &#xAC83; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; E. histolytica &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130; pAH-DEST &#xC0DD;&#xC131; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xBCF5;&#xC81C; Gateway((R)) &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xC720;&#xC6A9;&#xC131;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xBCA1;&#xD130; EHI_144490 &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xD568;&#xC218; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xBD80;&#xD638;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xB85C;&#xCEE4; &#xC2A4;&#xC758; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xBC84;&#xC804;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4; &#xACE0; strep myc &#xD0DC;&#xADF8;&#xB294; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; transfected trophozoites&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. Gateway((R)) &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xC2DD;&#xC744; &#xBCA1;&#xD130; E. histolytica &#xC18C;&#xC124; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC870;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC6A9;&#xC774; &#xD574;&#xC57C;.

&#xBCF5;&#xC81C; &#xBC0F; Entamoeba histolytica&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD45C;&#xD604;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8;&#xC6E8;&#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;.

El temprano ramificaci&oacute;n eucariotas Entamoeba histolytica es un par&aacute;sito humano que es el agente etiol&oacute;gico de la disenter&iacute;a amebiana y absceso hep&aacute;tico. La secuenciaci&oacute;n del genoma de E. histolytica, combinado con el desarrollo de un microarray de E. histolytica ha dado como resultado la identificaci&oacute;n de varios perfiles de expresi&oacute;n de distintos genes asociados a virulencia. La funci&oacute;n de muchas transcripciones moduladas es desconocida y su papel en la patogenicidad est&aacute; claro. Sin embargo, representan un conjunto de factores de virulencia potenciales que podr&iacute;an ser objetivos para el desarrollo de nuevas terapias. Eficientes herramientas y m&eacute;todos para caracterizar estos nuevos genes asociados a virulencia y prote&iacute;nas ser&iacute;a beneficiosos. Aqu&iacute; divulgamos el uso de la Gateway((R)) sistema de clonaci&oacute;n para generar la E. histolytica expresi&oacute;n vector pAH-DEST. Para comprobar la utilidad de este sistema, el vector se utiliz&oacute; para la construcci&oacute;n de un pl&aacute;smido que contiene una versi&oacute;n recombinante del locus EHI_144490, que codifican una prote&iacute;na de funci&oacute;n desconocida. Se expres&oacute; el gen recombinante y la prote&iacute;na recombinante, que fue etiquetado como estreptococos-myc, demostr&oacute; una localizaci&oacute;n citopl&aacute;smica en trofozoitos transfected. Este vector de expresi&oacute;n con el sistema Gateway((R)) debe facilitar la investigaci&oacute;n sobre las funciones de nuevas prote&iacute;nas en E. histolytica.

Article	Year
Reconstitution of R6K DNA replication in vitro using 22 purified proteins. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 12970346	2003
Biochemical investigations of control of replication initiation of plasmid R6K. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 14665626	2004
Reconstitution of F factor DNA replication in vitro with purified proteins. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 14973139	2004
A novel CpG-free vertebrate insulator silences the testis-specific SP-10 gene in somatic tissues: role for TDP-43 in insulator function. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 17932037	2007
Role of an insulator in testis-specific gene transcription. Annals of the New York Academy of Sciences\| PubMed ID: 18184912	2007
Characterization of an Entamoeba histolytica high-mobility-group box protein induced during intestinal infection. Eukaryotic cell\| PubMed ID: 18658254	2008
Development of the Gateway system for cloning and expressing genes in Entamoeba histolytica. Parasitology international\| PubMed ID: 18822389	2009

Mayuresh M Abhyankar

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