high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Imperial College London 

RNA &#xD3F4; (RNAPs)&#xB294; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; transcriptional &#xAE30;&#xACC4;&#xC758; &#xD575;&#xC2EC; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;. &#xC9C4; &#xD575; Rnaps&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xC9C4;&#xD589; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC0AC;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xB294; &#xC544;&#xC9C1; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xC131; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB97C; &#xC870;&#xB9BD; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD560;. Archaeal RNAPs &#xAE30;&#xBCF8; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; homology &#xBE44;&#xBC00;&#xC774; &#xAD6C;&#xC870; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4; &#xD575; RNAPII&#xB97C; &#xC9C1;&#xC811; &#xBE44;&#xAD50;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; archaeal RNAP &#xC815;&#xD654; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xB9BD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC804;&#xC0AC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558; &#xACE0; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; &#xC804;&#xC0AC;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB450; &#xAE30;&#xC800; &#xC694;&#xC778; &#xC874;&#xC7AC; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xC804;&#xCCB4; RNAP &#xD65C;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; subunits&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xAE30;&#xC5EC;&#xC5D0; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xC740; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD588;&#xB2E4;.

&#xC7AC;&#xC870;&#xD569; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; II &#xAC19;&#xC740; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; &#xC804;&#xC0AC;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;.

ARN polimerasas (RNAPs) son componentes de la base de la maquinaria transcripcional celular. Avances en estudios funcionales de eucariotas RNAPs ha sido retrasada por el hecho de que no lo ha hecho todav&iacute;a podido montar enzimas activas de subunidades individuales. RNAPs archaeal son directamente comparables a RNAPII eucariota en cuanto a estructura de secuencia primaria homolog&iacute;a y cuaternario. Aqu&iacute; divulgamos la exitosa Asamblea in vitro de un recombinante archaeal RNAP de subunidades purificadas. La enzima recombinante muestra actividad en ensayos de transcripci&oacute;n y es capaz, en presencia de dos otros factores basales, de la transcripci&oacute;n del promotor espec&iacute;fico. La Asamblea de las enzimas del mutante produjo varias penetraciones inesperados en las contribuciones estructurales y funcionales de varias subunidades hacia la actividad general de descubrimiento.

Un recombinante ARN polimerasa II-como enzima capaz de transcripci&oacute;n promotor espec&iacute;fico.

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x662F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5F55;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x3002;&#x771F;&#x6838; RNAPs &#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5DF2;&#x88AB;&#x63A8;&#x8FDF;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E00;&#x4E8B;&#x5B9E;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4ECD;&#x7136;&#x4E0D;&#x5C1A;&#x65E0;&#x53EF;&#x80FD;&#x6765;&#x7EC4;&#x5408;&#x6765;&#x81EA;&#x5404;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x9176;&#x3002;&#x53E4;&#x83CC; RNAPs &#x53EF;&#x76F4;&#x63A5;&#x5AB2;&#x7F8E;&#x771F;&#x6838; RNAPII &#x4E3B;&#x5E8F;&#x5217;&#x540C;&#x6E90;&#x6027;&#x4E0E;&#x7B2C;&#x56DB;&#x7EAA;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x6210;&#x529F;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x91CD;&#x7EC4;&#x53E4;&#x83CC; RNAP &#x4ECE;&#x7EAF;&#x51C0;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7EC4;&#x88C5;&#x3002;&#x91CD;&#x7EC4;&#x9176;&#x8F6C;&#x5F55;&#x5316;&#x9A8C;&#x663E;&#x793A;&#x5145;&#x5206;&#x6D3B;&#x52A8;&#x548C;&#x6709;&#x80FD;&#x529B;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x5B58;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57FA;&#x672C;&#x56E0;&#x7D20;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x3002;&#x5927;&#x4F1A;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x9176;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x51E0;&#x4E2A;&#x610F;&#x5916;&#x8D70;&#x5411;&#x6574;&#x4F53; RNAP &#x6D3B;&#x52A8;&#x5404;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x8D21;&#x732E;&#x3002;

&#x91CD;&#x7EC4;&#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; II &#x6837;&#x9176;&#x80FD;&#x591F;&#x7279;&#x5B9A;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x3002;

RNA polymerases (RNAPs) are core components of the cellular transcriptional machinery. Progress with functional studies of eukaryotic RNAPs has been delayed by the fact that it has not yet been possible to assemble active enzymes from individual subunits. Archaeal RNAPs are directly comparable to eukaryotic RNAPII in terms of primary sequence homology and quaternary structure. Here we report the successful in vitro assembly of a recombinant archaeal RNAP from purified subunits. The recombinant enzyme displays full activity in transcription assays and is capable, in the presence of two other basal factors, of promoter-specific transcription. The assembly of mutant enzymes yielded several unexpected insights into the structural and functional contributions of various subunits toward overall RNAP activity.

A recombinant RNA polymerase II-like enzyme capable of promoter-specific transcription.

ARN polym&eacute;rases (RNAPs) sont des &eacute;l&eacute;ments essentiels de la machinerie transcriptionnelle cellulaire. Progr&egrave;s avec des &eacute;tudes fonctionnelles des eucaryotes RNAPs ont &eacute;t&eacute; retard&eacute;e par le fait qu&#39;elle n&#39;a pas encore &eacute;t&eacute; possible d&#39;assembler des enzymes actives de sous-unit&eacute;s individuelles. RNAPs d&#39;Archaea sont directement comparables aux eucaryote RNAPII en termes de structure quaternaire et de l&#39;homologie de s&eacute;quence primaire. Nous pr&eacute;sentons l&#39;Assembl&eacute;e in vitro avec succ&egrave;s d&#39;une recombinaison Archaea RNAP de sous-unit&eacute;s purifi&eacute;es. L&#39;enzyme recombinante pr&eacute;sente une activit&eacute; compl&egrave;te dans des essais de transcription et est capable, en pr&eacute;sence de deux autres facteurs basales de la transcription du promoteur sp&eacute;cifique. L&#39;Assembl&eacute;e des enzymes mutantes ont donn&eacute; plusieurs aper&ccedil;us inattendus de contributions structurales et fonctionnelles des sous-unit&eacute;s diff&eacute;rentes vers l&#39;activit&eacute; globale de la carte.

Une enzyme de type II recombinante ARN polym&eacute;rase capable de transcription promoteur sp&eacute;cifique.

RNA-Polymerasen (RNAPs) sind Kernelemente der zellul&auml;ren transkriptionelle Maschinerie. Fortschritt mit Funktionsstudien von eukaryotischen RNAPs wurde durch die Tatsache, dass es nicht verz&ouml;gert noch aktive Enzyme aus einzelnen Untereinheiten sammeln m&ouml;glich gewesen. Reitenden RNAPs sind direkt vergleichbar mit eukaryotischen RNAPII in Bezug auf die prim&auml;re Sequenz-Homologie und Quatern&auml;re Struktur. Hier berichten wir &uuml;ber die erfolgreiche in-vitro-Montage eine rekombinante Archaea Name aus gereinigtem Untereinheiten. Das rekombinante Enzym zeigt die volle Aktivit&auml;t in Transkription Untersuchungen und ist in der Lage, in Anwesenheit von zwei anderen basalen Faktoren, der Promotor-spezifische Transkription. Die Montage des mutierten Enzyme hat einige unerwartete Einblicke in die strukturellen und funktionellen Beitr&auml;ge der verschiedenen Untereinheiten in Richtung Name Gesamtaktivit&auml;t ergeben.

Eine rekombinante RNS-Polymerase II-wie Enzym der Promotor-spezifische Transkription.

RNA polimerasi (RNAPs) sono componenti core del macchinario trascrizionale cellulare. Progresso con studi funzionali di eucarioti RNAPs ritardata dal fatto che non &egrave; ancora stato possibile assemblare enzimi attivi da singole subunit&agrave;. RNAPs di Archaeal sono direttamente paragonabili a eucarioti RNAPII in termini di struttura di omologia e quaternario sequenza primaria. Qui riportiamo il successo assieme in vitro di un ricombinante archaeal RNAP da subunit&agrave; purificata. L&#39;enzima ricombinante Visualizza attivit&agrave; completa trascrizione dosaggi ed &egrave; in grado, in presenza di due altri fattori basali della trascrizione specifici del promotore. L&#39;Assemblea degli enzimi mutanti ha reso parecchi imprevisti intuizioni contributi strutturali e funzionali delle varie subunit&agrave; verso attivit&agrave; RNAP complessiva.

Un ricombinante RNA polimerasi II-come enzima capace di trascrizione specifici del promotore.

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;RNAPs&#xFF09; &#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x6A5F;&#x68B0;&#x88C5;&#x7F6E;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2; &#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNAPs &#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3068;&#x9032;&#x6B69;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5EF6;&#x671F;&#x307E;&#x3060;&#x6D3B;&#x6027;&#x9175;&#x7D20;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC; RNAPs &#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x76F8;&#x540C;&#x6027;&#x3068;&#x7B2C;&#x56DB;&#x7D00;&#x5C64;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x9762;&#x3067;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNAPII &#x3068;&#x76F4;&#x63A5;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F; in vitro &#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30A2; RNAP &#x7CBE;&#x88FD;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x5B8C;&#x5168;&#x306A;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8A66;&#x91D1;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067; 2 &#x3064;&#x4ED6;&#x57FA;&#x5E95;&#x8981;&#x56E0;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x8EE2;&#x5199;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5909;&#x7570;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x5168;&#x4F53; RNAP &#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x69D8;&#x3005; &#x306A;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x8CA2;&#x732E;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x4E88;&#x671F;&#x305B;&#x306C;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x304C;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; II &#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x3002;

&#x53E4;&#x83CC;&#x8F6C;&#x5F55;&#x4EEA;&#x5668;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x76F8;&#x4F3C;&#x7684;&#x771F;&#x6838; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; II&#xFF0C;&#x800C; dna &#x8F6C;&#x5F55;&#x8C03;&#x8282;&#x4E3B;&#x8981;&#x662F;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7C7B;&#x578B;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x79EF;&#x6781;&#x7BA1;&#x63A7;&#x53E4;&#x83CC;&#x8F6C;&#x5F55;&#x5B8C;&#x5168;&#x91CD;&#x7EC4;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x6784;&#x5EFA;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x7701;&#x7565;&#x5404;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#x6216;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x4F53;&#x5916;&#x5927;&#x4F1A; 12 &#x4E9A;&#x57FA; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; II &#x6837;&#x9176;&#x548C;&#x5176;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50; TFE&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5242; Ptr2 &#x529F;&#x80FD;&#x5256;&#x6790;&#x3002;

&#x4F9D;&#x8D56;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5242;&#x7684;&#x53E4;&#x83CC;&#x8F6C;&#x5F55;&#x5B8C;&#x5168;&#x91CD;&#x7EC4;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;

The core components of the archaeal transcription apparatus closely resemble those of eukaryotic RNA polymerase II, while the DNA-binding transcriptional regulators are predominantly of bacterial type. Here we report the construction of an entirely recombinant system for positively regulated archaeal transcription. By omitting individual subunits, or sets of subunits, from the in vitro assembly of the 12-subunit RNA polymerase from the hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii, we describe a functional dissection of this RNA polymerase II-like enzyme, and its interactions with the general transcription factor TFE, as well as with the transcriptional activator Ptr2.

A fully recombinant system for activator-dependent archaeal transcription.

Les principaux composants de l&#39;appareil de transcription d&#39;Archaea ressemblent &eacute;troitement &agrave; celles des eucaryote ARN polym&eacute;rase II, tandis que les r&eacute;gulateurs transcriptionnels de liaison &agrave; l&#39;ADN sont principalement de type bact&eacute;rien. Nous rapportons ici la construction d&#39;un syst&egrave;me enti&egrave;rement recombinante pour la transcription d&#39;Archaea r&eacute;gul&eacute;e positivement. En omettant des sous-unit&eacute;s individuelles, ou des ensembles de sous-unit&eacute;s, de l&#39;assemblage in vitro de la 12 / sous-unit&eacute; ARN polym&eacute;rase de l&#39;organisme thermophile Methanocaldococcus jannaschii, nous d&eacute;crivons une dissection fonctionnelle de cette enzyme de type II de l&#39;ARN polym&eacute;rase et ses interactions avec le facteur de transcription g&eacute;n&eacute;rales TFE, ainsi qu&#39;avec l&#39;activateur de la transcription Ptr2.

Un syst&egrave;me enti&egrave;rement recombinant d&#39;Archaea d&eacute;pendant de l&#39;activateur de transcription.

Die Kernkomponenten des reitenden Transkription Apparats &auml;hneln denen von eukaryotischen RNA-Polymerase II, eng, w&auml;hrend die DNA-bindenen transkriptionelle Regulatoren &uuml;berwiegend bakterielle Typ sind. Hier berichten wir &uuml;ber den Bau eines vollst&auml;ndig rekombinante Systems positiv geregelten Archaea Transkription. Durch den Verzicht auf einzelne Untereinheiten oder Sets-Untereinheiten, die in-vitro-Versammlung des 12-Untereinheit der RNS-Polymerase von der thermophil Methanocaldococcus Jannaschii, beschreiben wir eine funktionale Pr&auml;paration der dieses RNS-Polymerase II-&auml;hnliches Enzym und seine Wechselwirkung mit den allgemeinen Transkriptionsfaktors TFE sowie das transcriptional Activator Ptr2.

Voll rekombinante System zur Aktivierung-abh&auml;ngige Archaea Transkription.

I componenti principali dell&#39;apparato di trascrizione archaeal assomigliano quelle eucariotica RNA polimerasi II, mentre i regolatori trascrizionali DNA-binding sono prevalentemente di tipo batterico. Qui riportiamo la costruzione di un sistema interamente ricombinante per trascrizione archaeal positivamente regolamentato. Omettendo le singole subunit&agrave;, o insiemi di subunit&agrave;, dall&#39;assemblaggio in vitro della 12-subunit&agrave; RNA polimerasi dal hyperthermophile Methanococcus jannaschii, descriviamo una dissezione funzionale dell&#39;enzima RNA polimerasi II-like e le relative interazioni con il fattore di trascrizione generale TFE, nonch&eacute; con l&#39;attivatore trascrizionale Ptr2.

Un sistema completamente ricombinante per trascrizione archaeal attivatore-dipendente.

DNA &#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x4E3B;&#x306B;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x4E00;&#x7A2E;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x7531;&#x6765;&#x8EE2;&#x5199;&#x88C5;&#x7F6E;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2; &#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x306F;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; II &#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306B;&#x4F3C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306B;&#x898F;&#x5236;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x7531;&#x6765;&#x8EE2;&#x5199;&#x7528;&#x5B8C;&#x5168;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; 12 &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x8D85;&#x597D;&#x71B1;&#x83CC; Methanocaldococcus jannaschii &#x304B;&#x3089;&#x306E; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7701;&#x7565;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3053;&#x306E; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; II &#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50; TFE&#x3001;&#x306A;&#x3089;&#x3073;&#x306B;&#x8EE2;&#x5199;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; Ptr2 &#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x5256;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x56E0;&#x5B50;&#x4F9D;&#x5B58;&#x8EE2;&#x5199;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3002;

DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; transcriptional &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130;&#xB294; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; archaeal &#xB179;&#xC74C; &#xC7A5;&#xCE58;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD575;&#xC2EC; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xB294; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xADF8; &#xC9C4; &#xD575; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; II, &#xB2EE;&#xC740;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC804;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774;&#xD2B8; &#xB41C; archaeal &#xC804;&#xC0AC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xAC74;&#xC124;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC1C;&#xBCC4; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; &#xB610;&#xB294; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii&#xC5D0;&#xC11C; 12-&#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xB9BD;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC9D1;&#xD569;&#xC744; &#xC0DD;&#xB7B5; &#xD558; &#xC5EC; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; II &#xAC19;&#xC740; &#xD6A8;&#xC18C;&#xAC00; &#xACE0; transcriptional &#xD65C;&#xC131;&#xAE30; Ptr2 &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC77C;&#xBC18; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; TFE&#xC640; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xD574; &#xBD80; &#xC124;&#xBA85;.

&#xD65C;&#xC131; &#xC81C;&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; archaeal &#xC804;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC644;&#xBCBD; &#xD558; &#xAC8C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;.

Los componentes b&aacute;sicos de los aparatos de la transcripci&oacute;n de archaeal asemejan los de eucariota ARN polimerasa II, mientras que los reguladores transcripcionales de ADN son predominantemente de tipo bacteriano. Aqu&iacute; divulgamos la construcci&oacute;n de un sistema totalmente recombinante para la transcripci&oacute;n de archaeal regulada positivamente. Omitiendo las subunidades individuales o conjuntos de subunidades, de la Asamblea in vitro de la polimerasa del RNA 12-subunidad de la hyperthermophile Methanococcus Methanococcus, describimos una disecci&oacute;n funcional de esta enzima de la ARN polimerasa II-como y sus interacciones con el factor de transcripci&oacute;n general TFE, as&iacute; como con el activador transcripcional Ptr2.

Un sistema totalmente recombinante para la transcripci&oacute;n dependiente de activador archaeal.

&#x53E4;&#x83CC; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x88AB;&#x5F81;&#x8058;&#x5230;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E09;&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x8054;&#x5408;&#x884C;&#x52A8;&#x7684;&#x53D1;&#x8D77;&#x4EBA;&#xFF1A; &#x5854;&#x5854;&#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4; (&#x53E4;&#x83CC;&#x540C;&#x6E90;&#x7684; TFIIB) &#x548C; TFE (&#x53E4;&#x83CC;&#x540C;&#x6E90;&#x7684; TFIIE&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x548C; TFE &#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x65B0;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x3002;(i) N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x950C;&#x7684;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x529F;&#x80FD;&#x533A;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x53E4;&#x83CC;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#x7684;&#x5197;&#x4F59;&#x914D;&#x7F6E;&#xFF0C;RNAP &#x8F6C;&#x5F55;&#x8D77;&#x59CB;&#x671F;&#x95F4;&#x62DB;&#x52DF;&#x7684;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x5403;&#x60CA;&#x3002;(&#x901A;&#x8FC7;&#x523A;&#x6FC0;&#x6D41;&#x4EA7;&#x548C;&#x751F;&#x4EA7;&#x6027;&#x8F6C;&#x5F55;&#x5728;&#x62DB;&#x8058;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x4E8C;) B &#x624B;&#x6307;&#x57DF;&#x53C2;&#x4E0E;&#x8F6C;&#x5F55;&#x542F;&#x52A8;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x3002;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x56E0;&#x6B64;&#x7ED3;&#x5408;&#x7269;&#x7406;&#x62DB;&#x8058; RNAP RNAP &#x50AC;&#x5316;&#x6027;&#x80FD;&#x5F71;&#x54CD;&#x5728;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x79EF;&#x6781;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;(&#x4E09;) &#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x7A81;&#x53D8; TFE&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x56E0;&#x7D20;&#x5728;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x534F;&#x540C;&#x884C;&#x52A8;&#x7684;&#x8865;&#x5145;&#x3002;(iv) &#x7684; TFE &#x7684;&#x9644;&#x52A0;&#x529F;&#x80FD;&#x662F;&#x52A8;&#x6001;&#x7A33;&#x5B9A;&#x542F;&#x52A8;&#x590D;&#x6742;&#x548C;&#x7834;&#x574F;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x4F38;&#x957F;&#x7387;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x901A;&#x8FC7;&#x6539;&#x53D8; RNAP &#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5C5E;&#x6027;&#x3002;

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6838;&#x5FC3;&#x804C;&#x80FD;&#x7531;&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x8C03;&#x5236;&#x3002;

Archaeal RNA polymerases (RNAPs) are recruited to promoters through the joint action of three basal transcription factors: TATA-binding protein, TFB (archaeal homolog of TFIIB), and TFE (archaeal homolog of TFIIE). Our results demonstrate several new insights into the mechanisms of TFB and TFE during the transcription cycle. (i) The N-terminal Zn ribbon of TFB displays a surprising degree of redundancy for the recruitment of RNAP during transcription initiation in the archaeal system. (ii) The B-finger domain of TFB participates in transcription initiation events by stimulating abortive and productive transcription in a recruitment-independent function. TFB thus combines physical recruitment of the RNAP with an active role in influencing the catalytic properties of RNAP during transcription initiation. (iii) TFB mutations are complemented by TFE, thereby demonstrating that both factors act synergistically during transcription initiation. (iv) An additional function of TFE is to dynamically alter the nucleic acid-binding properties of RNAP by stabilizing the initiation complex and destabilizing elongation complexes.

Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.

Des ARN polym&eacute;rases (RNAPs) sont recrut&eacute;s aux promoteurs par l&#39;action conjointe de trois facteurs de transcription basale : prot&eacute;ine liant le TATA, TFB (archaeal homologue de TFIIB) et TFE (archaeal homologue de TFIIE). Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent plusieurs nouvelles connaissances sur les m&eacute;canismes de TFB et TFE pendant le cycle de la transcription. (i) le ruban Zn N-terminale de TFB affiche un &eacute;tonnant degr&eacute; de redondance pour le recrutement de RNAP au cours de l&#39;initiation de la transcription dans le syst&egrave;me des arch&eacute;obact&eacute;ries. (ii) le domaine B-doigt de TFB participe aux &eacute;v&eacute;nements de d&eacute;but de transcription par stimulante transcription avort&eacute;e et productif dans une fonction de recrutement ind&eacute;pendante. TFB combine ainsi le recrutement physique de la carte avec un r&ocirc;le actif en influant sur les propri&eacute;t&eacute;s catalytiques des RNAP au cours de l&#39;initiation de la transcription. (iii) des mutations de TFB sont accompagn&eacute;es de TFE, montrant par l&agrave; que ces deux facteurs agissent en synergie pendant l&#39;initiation de la transcription. (iv) une fonction suppl&eacute;mentaire de TFE est de modifier dynamiquement les propri&eacute;t&eacute;s de liaison de l&#39;acide nucl&eacute;ique de RNAP en stabilisant la complexe d&#39;initiation et de d&eacute;stabiliser les complexes de l&#39;&eacute;longation.

Modulation directe des fonctions essentielles de l&#39;ARN polym&eacute;rase de facteurs de transcription basale.

Archaea RNA-Polymerasen (RNAPs) werden Promotoren durch die gemeinsame Aktion der drei basalen Transkriptionsfaktoren rekrutiert: TATA-verbindliches Protein, TFB (Archaea Homolog der TFIIB) und TFE (Archaea Homolog der TFIIE). Unsere Ergebnisse zeigen mehrere neue Einblicke in die Mechanismen der TFB und TFE w&auml;hrend des Zyklus Transkription. (i) die N-terminalen Zn Multifunktionsleiste TFB zeigt einen &uuml;berraschenden Grad an Redundanz f&uuml;r die Einstellung von Name Transkription zu Beginn des im System lokalisiert. (Ii) die B-Finger-Dom&auml;ne des TFB beteiligt sich an Transkription Einleitung Ereignisse durch anregende abortive und produktive Transkription in einer Rekrutierung-unabh&auml;ngige Funktion. TFB verbindet somit physische Einstellung von der Name mit eine aktive Rolle bei der Beeinflussung der katalytischen Eigenschaftendes von Name w&auml;hrend der Transkription Einleitung. (Iii) TFB Mutationen werden von TFE, dadurch demonstrieren, dass beide Faktoren synergistisch Transkription zu Beginn des handeln erg&auml;nzt. (iv) eine zus&auml;tzliche Funktion des TFE ist die Nukleins&auml;ure-Bindungseigenschaften der Name dynamisch &auml;ndern, indem die komplexe Initiation zu stabilisieren und destabilisieren Dehnung-komplexe.

Direkte Beeinflussung der RNS-Polymerase Kernfunktionen von basalen Transkriptionsfaktoren.

Polimerasi del RNA di Archaeal (RNAPs) vengono reclutate ai promotori attraverso l&#39;azione congiunta di tre fattori di trascrizione basali: TATA-binding protein, TFB (archaeal omologo di TFIIB) e TFE (archaeal omologo di TFIIE). I nostri risultati dimostrano diverse nuove intuizioni dei meccanismi di TFB e TFE durante il ciclo di trascrizione. (i) il nastro Zn N-terminale di TFB indica un sorprendente grado di ridondanza per il reclutamento di RNAP durante l&#39;iniziazione della trascrizione nel sistema di archaeal. (ii) il dominio B-dito di TFB partecipa a eventi di iniziazione trascrizione da stimolante trascrizione abortiva e produttivo in una funzione indipendente dall&#39;assunzione. TFB combina cos&igrave; fisiche assunzione delle RNAP con un ruolo attivo nell&#39;influenzare le propriet&agrave; catalitiche di RNAP durante l&#39;iniziazione della trascrizione. (iii) mutazioni TFB sono integrate da TFE, dimostrando quindi che entrambi i fattori agiscono in sinergia durante l&#39;iniziazione della trascrizione. (iv) una funzione aggiuntiva di TFE &egrave; di alterare dinamicamente le propriet&agrave; dell&#39;acido nucleico-associazione di RNAP stabilizzando l&#39;iniziazione complesso e destabilizzante complessi di allungamento.

Modulazione diretta delle funzioni core polimerasi del RNA da fattori di trascrizione basali.

&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x7531;&#x6765; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (RNAPs) &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066; 3 &#x3064;&#x306E;&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x5171;&#x540C;&#x884C;&#x52D5;&#x3092;&#x63A1;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#xFF1A; &#x30BF;&#x30BF;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;TFB (TFIIB &#x306E;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x76F8;&#x540C;&#xFF09; &#x3068; TFE &#xFF08;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x76F8;&#x540C;&#x4F53; TFIIE &#x306E;&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C; TFB &#x3068; TFE &#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306B;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x8EE2;&#x5199;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x4E2D;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;(i)&#x3001;N &#x672B;&#x7AEF; Zn &#x30EA;&#x30DC;&#x30F3; TFB &#x306E;&#x5197;&#x9577;&#x6027; RNAP &#x306E;&#x52DF;&#x96C6;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9A5A;&#x304F;&#x3079;&#x304D;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;(ii) B &#x6307;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; TFB &#x306E;&#x52DF;&#x96C6;-&#x72EC;&#x7ACB;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x3067;&#x306E;&#x523A;&#x6FC0;&#x7684;&#x306A;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x3068;&#x751F;&#x7523;&#x7684;&#x306A;&#x8EE2;&#x5199;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x53C2;&#x52A0;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;TFB &#x306F;&#x3053;&#x3046;&#x3057;&#x3066;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306B; rna &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x7279;&#x6027;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x306B;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092; RNAP&#xFF09; &#x7269;&#x7406;&#x7684;&#x306A;&#x52DF;&#x96C6;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;(iii) TFB &#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4E21;&#x65B9;&#x8981;&#x56E0;&#x76F8;&#x4E57;&#x7684;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306B;&#x884C;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059; TFE &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x88DC;&#x5B8C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;(iv) TFE &#x306E;&#x4ED8;&#x52A0;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306F;&#x958B;&#x59CB;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3068;&#x4F38;&#x9577;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x308B; rna &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6838;&#x9178;&#x7D50;&#x5408;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x52D5;&#x7684;&#x306B;&#x5909;&#x66F4;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x76F4;&#x63A5;&#x5909;&#x8ABF;&#x57FA;&#x5E95;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x306B;&#x3088;&#x308B; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B3;&#x30A2;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3002;

3 &#xAE30;&#xC800; &#xB179;&#xC74C; &#xBC29;&#xC1A1; &#xC694;&#xC778;&#xC758; &#xACF5;&#xB3D9; &#xD589;&#xB3D9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC744; &#xBAA8;&#xC9D1; Archaeal RNA &#xD3F4; (RNAPs): &#xD0C0; &#xD0C0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, TFB (archaeal &#xCCB4; TFIIB), &#xBC0F; TFE (archaeal &#xCCB4; TFIIE&#xC758;). &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC804;&#xC0AC; &#xC8FC;&#xAE30; &#xB3D9;&#xC548; TFB &#xBC0F; TFE &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. (i) TFB&#xC758; N &#xB2E8;&#xC790; Zn &#xB9AC;&#xBCF8; archaeal &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B4; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; RNAP&#xC758; &#xCC44;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xBCF5; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. (TFB&#xC758; B &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; 2 &#xCC28;) &#xBAA8;&#xC9D1;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xD568;&#xC218;&#xC5D0; &#xC790;&#xADF9; &#xC870;&#xC0B0; &#xD558; &#xACE0; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC801;&#xC778; &#xC804;&#xC0AC; &#xD558; &#xC5EC; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xCC38;&#xC5EC;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. TFB &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; RNAP&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC18D;&#xC131;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xB3D9;&#xC548;&#xC5D0; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC740; RNAP&#xC758; &#xBB3C;&#xB9AC;&#xC801; &#xBAA8;&#xC9D1;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xB418;&#xC5B4;&#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. (iii) TFB &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; TFE, &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xB450; &#xC694;&#xC778; synergistically &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xC911; &#xD589;&#xB3D9;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; &#xC758;&#xD574; &#xBCF4;&#xC644; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. (TFE&#xC758; &#xCD94;&#xAC00; &#xAE30;&#xB2A5; iv) &#xB3D9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xB97C; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xD558; &#xACE0; &#xC5F0;&#xC2E0; &#xC728; &#xB2E8;&#xC9C0; &#xBD88;&#xC548;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; RNAP&#xC758; &#xD575; &#xC0B0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;.

&#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD575;&#xC2EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xBCC0;&#xC870;.

Archaeal ARN polimerasas (RNAPs) son reclutados a los promotores a trav&eacute;s de la acci&oacute;n conjunta de tres factores de transcripci&oacute;n basal: prote&iacute;na de uni&oacute;n a TATA, TFB (archaeal hom&oacute;logo de TFIIB) y TFE (archaeal hom&oacute;logo de TFIIE). Nuestros resultados demuestran varios nuevos conocimientos sobre los mecanismos de TFB y TFE durante el ciclo de la transcripci&oacute;n. (i) la cinta de Zn N-terminal de TFB muestra un sorprendente grado de redundancia para la contrataci&oacute;n de descubrimiento durante la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n en el sistema de archaeal. (ii) el dominio B-dedo de TFB participa en eventos de inicio de transcripci&oacute;n por estimular la transcripci&oacute;n abortiva y productiva en una funci&oacute;n independiente de reclutamiento. TFB as&iacute; combina f&iacute;sica reclutamiento de la RNAP con un papel activo en influir en las propiedades catal&iacute;ticas de descubrimiento durante la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. (iii) las mutaciones TFB se complementan de TFE, demostrando que ambos factores act&uacute;an de forma sin&eacute;rgica durante la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. (iv) una funci&oacute;n adicional de TFE es modificar din&aacute;micamente las propiedades de uni&oacute;n a &aacute;cidos nucleicos de RNAP estabilizando el complejo de iniciaci&oacute;n y desestabilizar complejos de alargamiento.

Modulaci&oacute;n directa de funciones b&aacute;sicas de ARN polimerasa por factores de transcripci&oacute;n basal.

&#x53E4;&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x673A;&#x68B0;&#x5305;&#x62EC; TBP (TATA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;)&#x3001; &#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4; (&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50; B &#xFF1B; &#x540C;&#x7CFB;&#x7269;&#x7684;&#x771F;&#x6838; TFIIB) &#x548C;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0A;&#x975E;&#x5E38;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x4E8E;&#x771F;&#x6838; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; II &#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3002;&#x6B64;&#x661F;&#x5EA7;&#x7684;&#x56E0;&#x7D20;&#x662F;&#x8DB3;&#x591F;&#x5177;&#x4F53;&#x4E0A;&#x5854;&#x5854;&#x6846;&#x5305;&#x542B;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x88C5;&#x914D;&#x5E76;&#x542F;&#x52A8;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x5F00;&#x59CB;&#x5730;&#x70B9;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x6765;&#x7814;&#x7A76;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x57FA;&#x5E95;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x548C; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#xFF0C;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#x7684; post-recruitment &#x529F;&#x80FD;&#x7279;&#x522B;&#x5F3A;&#x8C03;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7ED3;&#x6784;&#x7ECF;&#x5386;&#x8FC5;&#x901F;&#x548C;&#x660E;&#x663E;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x6F14;&#x5316;&#x53E4;&#x83CC;&#x548C;&#x771F;&#x6838;&#x7684;&#x8FDB;&#x5316;&#x57DF;&#x4E2D; B-&#x624B;&#x6307;&#x7684;&#x53E4;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;&#xFF0C;&#x5E76;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86; TFIIB &#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x4FE1;&#x606F;&#x5B66;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x66F4;&#x6539;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x548C;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x5176;&#x53EF;&#x80FD;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x4EA7;&#x751F;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6838;&#x5FC3;&#x804C;&#x80FD;&#x7531;&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#x6E05;&#x7406;&#x73AF;&#x5883;&#x4E13;&#x8D23;&#x7EC4;/TFIIB &#x8C03;&#x5236;&#x3002;

The archaeal basal transcriptional machinery consists of TBP (TATA-binding protein), TFB (transcription factor B; a homologue of eukaryotic TFIIB) and an RNA polymerase that is structurally very similar to eukaryotic RNA polymerase II. This constellation of factors is sufficient to assemble specifically on a TATA box-containing promoter and to initiate transcription at a specific start site. We have used this system to study the functional interaction between basal transcription factors and RNA polymerase, with special emphasis on the post-recruitment function of TFB. A bioinformatics analysis of the B-finger of archaeal TFB and eukaryotic TFIIB reveals that this structure undergoes rapid and apparently systematic evolution in archaeal and eukaryotic evolutionary domains. We provide a detailed analysis of these changes and discuss their possible functional implications.

Modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factor TFB/TFIIB.

La machinerie transcriptionnelle basale d&#39;archaea se compose de TBP (prot&eacute;ine liant le TATA), TFB (facteur de transcription B; un homologue des eucaryote TFIIB) et une ARN polym&eacute;rase qui est structurellement tr&egrave;s similaire &agrave; l&#39;ARN polym&eacute;rase II eucaryote. Cette constellation de facteurs ne suffit pas d&#39;assembler plus pr&eacute;cis&eacute;ment sur un promoteur de bo&icirc;te contenant TATA et d&#39;initier la transcription sur un site de d&eacute;marrage sp&eacute;cifique. Nous avons utilis&eacute; ce syst&egrave;me pour &eacute;tudier les interactions fonctionnelles entre les facteurs de transcription basale et l&#39;ARN polym&eacute;rase, avec un accent particulier sur la fonction dispens&eacute;e de TFB. Une analyse bioinformatique du B-doigt d&#39;archaeal TFB et eucaryotes TFIIB r&eacute;v&egrave;le que cette structure subit une &eacute;volution rapide et apparemment syst&eacute;matique des arch&eacute;obact&eacute;ries et eucaryotes domaines &eacute;volutionnaires. Nous fournir une analyse d&eacute;taill&eacute;e de ces changements et discuter de leurs possibles implications fonctionnelles.

Modulation des fonctions essentielles de l&#39;ARN polym&eacute;rase de facteur de transcription basale TFB/TFIIB.

Die reitenden basale transkriptionelle Maschinen besteht aus TBP (TATA-verbindliches Protein), TFB (&Uuml;bertragungfaktor B; ein Homolog von eukaryotischen TFIIB) und eine RNS-Polymerase, die eukaryotischen RNA-Polymerase II strukturell sehr &auml;hnlich ist. Diese Konstellation Faktoren gen&uuml;gt, speziell &uuml;ber TATA Kasten-haltigen F&ouml;rderer zusammenstellen und Transkription an einem bestimmten anfangs-Standort einzuleiten. Wir haben dieses System benutzt, um die funktionelle Interaktion zwischen basalen Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase, mit besonderem Schwerpunkt auf die post-recruitment Funktion des TFB zu studieren. Eine Bioinformatik Analyse des B-fingers der reitenden TFB und eukaryotischen TFIIB zeigt, dass diese Struktur schnell und anscheinend systematische Evolution in Archaea und eukaryotischen evolution&auml;ren Dom&auml;nen durchl&auml;uft. Wir bieten eine detaillierte Analyse dieser Ver&auml;nderungen und deren m&ouml;glichen funktionellen Auswirkungen zu diskutieren.

Modulation der RNS-Polymerase Kernfunktionen von basalen &Uuml;bertragungfaktor TFB/TFIIB.

Il macchinario trascrizionale basale archaeal consiste di TBP (TATA-binding protein), TFB (fattore di trascrizione B; un omologo dell&#39;eucariota TFIIB) e una RNA polimerasi che &egrave; strutturalmente molto simile a eucariota RNA polimerasi II. Questa costellazione di fattori &egrave; sufficiente assemblare in particolare su un promotore TATA box contenenti e per iniziare la trascrizione presso un sito specifico iniziale. Abbiamo usato questo sistema per studiare l&#39;interazione funzionale tra fattori di trascrizione basali e RNA polimerasi, con speciale enfasi sulla funzione post-recruitment di TFB. Un&#39;analisi bioinformatica del B-dito di archaeal TFB ed eucariotica TFIIB rivela che questa struttura subisce evoluzione rapida e apparentemente sistematica in archaeal e domini evolutivi eucariotiche. Forniamo una dettagliata analisi di questi cambiamenti e discutere le loro possibili implicazioni funzionali.

Modulazione delle funzioni core polimerasi del RNA di fattore di trascrizione basale TFB/TFIIB.

&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x57FA;&#x5E95;&#x8EE2;&#x5199;&#x30DE;&#x30B7;&#x30CA;&#x30EA;&#x30FC; TBP (&#x30BF;&#x30BF;&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;)&#x3001;TFB &#xFF08;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50; B; &#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; TFIIB &#x306E;&#x76F8;&#x540C;&#xFF09;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; II &#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x306B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x4F3C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3001;RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x661F;&#x5EA7;&#x306E;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306F;&#x30BF;&#x30BF; &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3092;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3057;&#x3066;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x958B;&#x59CB;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x306F;&#x5341;&#x5206;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x56E0;&#x5B50;&#x3001;RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9593;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x7279;&#x5225;&#x306A;&#x91CD;&#x70B9; TFB &#x306E; post-recruitment &#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x4F53;&#x306F;&#x6025;&#x901F;&#x3067;&#x3069;&#x3046;&#x3084;&#x3089;&#x7CFB;&#x7D71;&#x7684;&#x9032;&#x5316;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x3068;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x9032;&#x5316;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x7D4C;&#x308B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30DE;&#x30C6;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#x89E3;&#x6790; B &#x6307; TFB &#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x3084;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; TFIIB &#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x610F;&#x7FA9;&#x3092;&#x8B70;&#x8AD6;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0; TFB/TFIIB &#x306B;&#x3088;&#x308B; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B3;&#x30A2;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x3002;

Archaeal &#xAE30;&#xC800; transcriptional &#xAE30;&#xACC4; TBP (&#xD0C0; &#xD0C0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;), TFB (&#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; B, &#xC9C4; &#xD575; TFIIB homologue)&#xACFC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC720;&#xC0AC;&#xD55C; &#xC9C4; &#xD575; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; II&#xB294; RNA &#xC911; &#xD569;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC838; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC694;&#xC778;&#xC758;&#xC774; &#xBCC4;&#xC790;&#xB9AC;&#xB294; TATA &#xC0C1;&#xC790; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC5D0; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC870;&#xB9BD; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xC815; &#xD55C; &#xC2DC;&#xC791; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB179;&#xC74C;&#xC744; &#xC2DC;&#xC791;&#xC744; &#xCDA9;&#xBD84; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; TFB&#xC758; post-recruitment &#xD568;&#xC218;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xBCC4; &#xD55C; &#xAC15;&#xC870;&#xC640; &#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790;&#xC640; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;, &#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC774;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC0DD;&#xBB3C; &#xC815;&#xBCF4;&#xD559; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; archaeal TFB &#xBC0F; &#xC9C4; &#xD575; TFIIB &#xBC1D;&#xD600; B &#xC190;&#xAC00;&#xB77D;&#xC758;&#xC774; &#xAD6C;&#xC870; archaeal &#xBC0F; &#xC9C4; &#xD575; &#xC9C4;&#xD654; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xACE0; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xBA85;&#xD788; &#xC9C4;&#xD654;&#xB97C; &#xACAA; &#xC2B5;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCC0;&#xACBD;&#xC758; &#xC0C1;&#xC138;&#xD55C; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801;&#xC778; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C; &#xB17C;&#xC758;.

&#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; TFB/TFIIB&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD575;&#xC2EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870;.

La maquinaria transcripcional basal archaeal consta de TBP (prote&iacute;na de uni&oacute;n a TATA), TFB (factor de transcripci&oacute;n B; un hom&oacute;logo de TFIIB eucariota) y un ARN polimerasa que es estructuralmente muy similar a eucariota ARN polimerasa II. Esta constelaci&oacute;n de factores es suficiente para montar espec&iacute;ficamente en un promotor de que contienen caja TATA e iniciar la transcripci&oacute;n en un sitio de inicio determinada. Hemos utilizado este sistema para estudiar la interacci&oacute;n funcional entre los factores de transcripci&oacute;n basal y RNA polimerasa, con especial &eacute;nfasis en la funci&oacute;n juveniles de TFB. Un an&aacute;lisis de Bioinform&aacute;tica del B-dedo de archaeal TFB y eucariota TFIIB revela que esta estructura sufre evoluci&oacute;n r&aacute;pida y aparentemente sistem&aacute;tica en arqueobacterias y dominios evolutivos eucariotas. Ofrecemos un an&aacute;lisis detallado de estos cambios y discutir sus posibles implicaciones funcionales.

Modulaci&oacute;n de las funciones b&aacute;sicas de ARN polimerasa por el factor de transcripci&oacute;n basal TFB/TFIIB.

&#x6DF1;&#x5165;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;/&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x6790;&#x5927;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x5982; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs)&#xFF0C;&#x8981;&#x6C42;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x80FD;&#x591F;&#x4EE5;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x5B9A;&#x4E49;&#x4F53;&#x5916;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7EC4;&#x88C5;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x5728;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7B80;&#x5316;&#x548C;&#x96C6;&#x6210;&#x88C5;&#x914D;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF; 96 &#x4E95;&#x683C;&#x5F0F;&#x91CD;&#x7EC4;&#x53E4;&#x83CC; RNAPs &#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x5305;&#x62EC;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x65B9;&#x9762;&#x91CD;&#x65B0;&#x90FD;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x8868;&#x8FBE;&#x8D28;&#x7C92;&#x3001; &#x53D1;&#x5C55;&#x81EA;&#x52A8;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x63D0;&#x53D6;/&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x7EC4;&#x88C5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x548C;&#x6D3B;&#x6027;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x662F;&#x5177;&#x4F53;&#x9488;&#x5BF9;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x5E73;&#x53F0;&#x4E0A;&#x6267;&#x884C;&#x3002;&#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x7B56;&#x7565;&#x5141;&#x8BB8; 96 &#x91CD;&#x7EC4; RNAPs &#xFF08;&#x5305;&#x62EC;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x53CA;&#x7A81;&#x53D8;&#x578B;&#x53D8;&#x79CD;&#xFF09;&#xFF0C;&#x5F88;&#x5C11;&#x6216;&#x6CA1;&#x6709;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x5E72;&#x9884;&#x5728; 24 &#x5C0F;&#x65F6;&#x5185;&#x5E76;&#x884C;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x53CA;&#x5176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x901A;&#x8FC7;&#x8BC4;&#x4F30;&#x4F7F;&#x7528;&#x9971;&#x548C;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684; RNAP &#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x7EBF;&#x7684;&#x5355;&#x4E00;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x4FA7;&#x94FE;&#x8981;&#x6C42;&#x8868;&#x660E;&#x6B64;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x6F5C;&#x529B;&#x3002;

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x5382;&#xFF1A; &#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x751F;&#x4EA7;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#x7684;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x4F53;&#x5916;&#x88C5;&#x914D;&#x5E73;&#x53F0;&#x3002;

The in-depth structure/function analysis of large protein complexes, such as RNA polymerases (RNAPs), requires an experimental platform capable of assembling variants of such enzymes in large numbers in a reproducible manner under defined in vitro conditions. Here we describe a streamlined and integrated protocol for assembling recombinant archaeal RNAPs in a high-throughput 96-well format. All aspects of the procedure including construction of redesigned expression plasmids, development of automated protein extraction/in vitro assembly methods and activity assays were specifically adapted for implementation on robotic platforms. The optimized strategy allows the parallel assembly and activity assay of 96 recombinant RNAPs (including wild-type and mutant variants) with little or no human intervention within 24 h. We demonstrate the high-throughput potential of this system by evaluating the side-chain requirements of a single amino acid position of the RNAP Bridge Helix using saturation mutagenesis.

The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.

L&#39;analyse approfondie de structure/fonction des complexes de prot&eacute;ine importante, comme les ARN polym&eacute;rases (RNAPs), n&eacute;cessite une plateforme exp&eacute;rimentale capable d&#39;assembler des variantes de ces enzymes dans un grand nombre de mani&egrave;re reproductible dans des conditions d&eacute;finies d&#39;in vitro. Ici, les auteurs d&eacute;crivent un protocole simplifi&eacute; et int&eacute;gr&eacute; pour assembler archaeal recombinant RNAPs dans un format de 96 puits de haut d&eacute;bit. Tous les aspects de la proc&eacute;dure, y compris la construction de redessin&eacute;e plasmides d&#39;expression, d&eacute;veloppement de prot&eacute;ine automatis&eacute;e extraction/en vitro modes d&#39;assemblage et les tests d&#39;activit&eacute; &eacute;taient sp&eacute;cifiquement adapt&eacute;s pour la mise en &oelig;uvre sur les plates-formes robotiques. La strat&eacute;gie optimis&eacute;e permet le dosage de l&#39;Assembl&eacute;e et de l&#39;activit&eacute; parall&egrave;le de 96 RNAPs recombinantes (y compris les variantes de type sauvage et mutantes) avec peu ou pas d&#39;intervention humaine dans les 24h. Nous d&eacute;montrer le potentiel de haut d&eacute;bit de ce syst&egrave;me par l&#39;&eacute;valuation des exigences de la cha&icirc;ne lat&eacute;rale d&#39;une position de seul acide amin&eacute; de la spirale de pont RNAP utilisant la mutagen&egrave;se de saturation.

L&#39;usine de l&#39;ARN polym&eacute;rase : une plate-forme robotique assemblage in vitro pour la production de haut d&eacute;bit des complexes de prot&eacute;ine recombinante.

Die detaillierte Struktur/Funktions-Analyse der gro&szlig;e Proteinkomplexe, z. B. RNA-Polymerasen (RNAPs), erfordert experimentelle Plattform f&auml;hig Montage-Varianten der Enzyme in gro&szlig;er Zahl in reproduzierbarer Form unter definierten in-vitro-Bedingungen. Hier beschreiben wir eine optimierte und integrierte Protokoll zur Montage von rekombinanten reitenden RNAPs im Hochdurchsatz-96-Well-Format. Alle Aspekte des Verfahrens einschlie&szlig;lich der Bau neu gestaltet Ausdruck Plasmide, Entwicklung von automatisierten Protein Extraktion/in Vitro Fertigungsmethoden und Aktivit&auml;t-Assays wurden speziell f&uuml;r die Umsetzung auf Roboter-Plattformen. Die optimierte Strategie erm&ouml;glicht die parallele Assembly und Aktivit&auml;t Probe der 96 rekombinante RNAPs (einschlie&szlig;lich Wildtyp und Mutante-Varianten) mit wenig oder ohne menschlichen Eingriff innerhalb von 24 Stunden. Wir demonstrieren das Hochdurchsatz-Potenzial dieses Systems durch die Sidechain-Anforderungen einer einzigen Aminos&auml;ure-Stellung der Name Br&uuml;cke Helix mit S&auml;ttigung Mutagenese auswerten.

Die RNA-Polymerase-Fabrik: ein Roboter in-vitro-Montage-Plattform f&uuml;r Hochdurchsatz-Herstellung von rekombinanten Protein-komplexen.

L&#39;analisi approfondita di struttura/funzione dei grandi complessi della proteina, come polimerasi del RNA (RNAPs), richiede una piattaforma sperimentale in grado di assemblare varianti di tali enzimi in gran numero in modo riproducibile in condizioni definite in vitro. Qui descriviamo un protocollo semplificato ed integrato per il montaggio di archaeal ricombinante RNAPs in un formato di 96 pozzetti di alto-rendimento. Tutti gli aspetti della procedura, compresa la costruzione di riprogettato plasmidi di espressione, lo sviluppo della proteina automatizzato estrazione/in vitro assembly metodi e dosaggi di attivit&agrave; erano specificamente adattati per implementazione su piattaforme robotiche. La strategia ottimizzata consente il dosaggio assieme e attivit&agrave; parallelo di 96 RNAPs ricombinante (incluse varianti wild-type e mutanti) con poco o nessun intervento umano entro 24 h. Noi dimostrare il potenziale di alto-rendimento di questo sistema di valutare i requisiti di catena laterale di un singolo amminoacido posizione dell&#39;elica RNAP ponte mediante mutagenesi di saturazione.

La fabbrica di RNA polimerasi: una piattaforma di assemblaggio robotizzato in vitro per la produzione di alto-rendimento dei complessi della proteina ricombinante.

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;RNAPs&#xFF09; &#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x30FB;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x5B9A;&#x7FA9; in vitro &#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x518D;&#x73FE;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x5927;&#x91CF;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; 96 &#x30A6;&#x30A7;&#x30EB; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC; RNAPs &#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x3067;&#x7D71;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x5EFA;&#x8A2D;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E3;&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x5074;&#x9762;&#x3092;&#x4E00;&#x65B0;&#x3001;&#x958B;&#x767A;&#x81EA;&#x52D5;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x62BD;&#x51FA;/&#x3067; in vitro &#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA; &#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6D3B;&#x6027;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x9069;&#x5FDC;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x4E0A;&#x306E;&#x5B9F;&#x88C5;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x6226;&#x7565;&#x4E26;&#x5217;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3068;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4; &#xFF08;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x3068;&#x5909;&#x7570;&#x578B;&#x306E;&#x5909;&#x7A2E;&#x3092;&#x542B;&#x3081;&#x3066;) 96 &#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048; RNAPs &#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x3001;&#x3042;&#x308B;&#x3044;&#x306F;&#x307E;&#x3063;&#x305F;&#x304F;&#x4EBA;&#x9593;&#x4ECB;&#x5165;&#x306F; 24 &#x6642;&#x9593;&#x4EE5;&#x5185;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x98FD;&#x548C;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x305F; RNAP &#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306E;&#x5074;&#x9396;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3092;&#x30C7;&#x30E2;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x5DE5;&#x5834;: &#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x751F;&#x7523;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E; in vitro &#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA; &#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3002;

RNA &#xD3F4; (RNAPs) &#xAC19;&#xC740; &#xB300;&#xD615; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C;&#xC758; &#xC2EC;&#xCE35; &#xAD6C;&#xC870;/&#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xC815;&#xC758; &#xCCB4; &#xC678; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xD604; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4; &#xC218;&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xBCC0;&#xC885; &#xC870;&#xB9BD; &#xB2A5;&#xB825;&#xC774; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; 96-&#xC798; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; archaeal RNAPs &#xC870;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC04;&#xC18C; &#xD558; &#xACE0; &#xD1B5;&#xD569; &#xB41C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xCE21;&#xBA74;&#xC758; &#xAC74;&#xC124;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xC808;&#xCC28;&#xC758; &#xC7AC;&#xC124;&#xACC4; &#xC2DD; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;, &#xC790;&#xB3D9;&#xD654; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD94;&#xCD9C;/&#xC2DC;&#xD5D8;&#xAD00; &#xC870;&#xB9BD; &#xBC29;&#xBC95; &#xBC0F; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD2B9;&#xD788; &#xB85C;&#xBD07; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC5D0; &#xAD6C;&#xD604;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xC751;. &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xC804;&#xB7B5; 96 &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; RNAPs (&#xC57C;&#xC0DD; &#xD615; &#xBC0F; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCC0;&#xD615; &#xD3EC;&#xD568;) 24 &#xC2DC;&#xAC04; &#xC774;&#xB0B4;&#xC5D0; &#xAC70;&#xC758; &#xB610;&#xB294; &#xC804;&#xD600; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAC1C;&#xC785;&#xC758; &#xBCD1;&#xB82C; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xB97C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCC44;&#xB3C4; mutagenesis&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; RNAP &#xBE0C;&#xB9AC;&#xC9C0; &#xB098;&#xC120;&#xD615;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC704;&#xCE58;&#xC758; &#xCE21;&#xBA74; &#xCCB4;&#xC778; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC774; &#xB192;&#xC740; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xACF5;&#xC7A5;: &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC2A4;&#xB8E8;&#xD48B; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB85C;&#xBD07;&#xC744; &#xC774;&#xC6A9;&#xD55C; &#xCCB4; &#xC678; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;.

El an&aacute;lisis detallado de la estructura/funci&oacute;n de complejos de prote&iacute;nas grandes, como Polimerasas del RNA (RNAPs), requiere una plataforma experimental capaz de ensamblar variantes de estas enzimas en grandes cantidades en forma reproducible definida en condiciones in vitro. Aqu&iacute; describimos un protocolo optimizado e integrado para montaje RNAPs archaeal recombinante en un formato de 96 pocillos de alto rendimiento. Todos los aspectos del procedimiento incluyendo la construcci&oacute;n de redise&ntilde;aron pl&aacute;smidos de expresi&oacute;n, desarrollo de prote&iacute;na automatizada extracci&oacute;n/in vitro Asamblea m&eacute;todos y ensayos de actividad fueron adaptados para aplicaci&oacute;n en plataformas rob&oacute;ticas. La estrategia optimizada permite el an&aacute;lisis paralelo de Asamblea y actividad de 96 RNAPs recombinantes (incluyendo variantes de tipo salvaje y mutantes) con poca o ninguna intervenci&oacute;n humana dentro de 24 h. Demostramos el potencial de alto rendimiento de este sistema mediante la evaluaci&oacute;n de los requisitos de la cadena lateral de un solo amino&aacute;cido en posici&oacute;n de la h&eacute;lice de puente RNAP mediante mutag&eacute;nesis de saturaci&oacute;n.

La f&aacute;brica de la ARN polimerasa: una plataforma rob&oacute;tica Asamblea in vitro para la producci&oacute;n de alto rendimiento de complejos de prote&iacute;nas recombinantes.

&#x7ECF;&#x8FC7;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#xFF0C;&#x534F;&#x8C03;&#x5904;&#x7406;&#x901A;&#x8FC7;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x9AD8;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x9176;&#x7EC6;&#x80DE; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3002;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57DF;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#xFF0C;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x548C;&#x89E6;&#x53D1;&#x5668;&#x5FAA;&#x73AF;&#xFF0C;&#x53D1;&#x6325;&#x5173;&#x952E;&#x4F5C;&#x7528;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E00;&#x673A;&#x5236;&#x6240;&#x91C7;&#x7528;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6784;&#x8C61;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x52A0;&#x5468;&#x671F;&#x7684;&#x5404;&#x4E2A;&#x9636;&#x6BB5;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x6784;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x76F8;&#x5173;&#x6027;&#x4E00;&#x76F4;&#x96BE;&#x4EE5;&#x8BC4;&#x4F30;&#x4ECE;&#x9759;&#x6001;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x5F53;&#x524D;&#x53EF;&#x7528;&#x7684;&#x6570;&#x91CF;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F83;&#x5C0F;&#x3002;

&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x548C;&#x89E6;&#x53D1;&#x5668;&#x5FAA;&#x73AF;&#x6270;&#x52A8;&#x751F;&#x6210; superactive &#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x3002;

Cellular RNA polymerases are highly conserved enzymes that undergo complex conformational changes to coordinate the processing of nucleic acid substrates through the active site. Two domains in particular, the bridge helix and the trigger loop, play a key role in this mechanism by adopting different conformations at various stages of the nucleotide addition cycle. The functional relevance of these structural changes has been difficult to assess from the relatively small number of static crystal structures currently available.

Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.

ARN-polym&eacute;rases cellulaires sont des enzymes hautement conserv&eacute;es qui subissent des changements conformationnels complexes afin de coordonner le traitement des substrats acides nucl&eacute;iques par le biais du site actif. Deux domaines en particulier, l&#39;h&eacute;lice de pont et de la boucle de la g&acirc;chette, jouer un r&ocirc;le dans ce m&eacute;canisme par adoptent des conformations diff&eacute;rentes &agrave; diff&eacute;rents stades du cycle d&#39;addition de nucl&eacute;otides. La pertinence fonctionnelle de ces changements structurels a &eacute;t&eacute; difficile d&#39;&eacute;valuer le nombre relativement faible des structures statiques cristal actuellement disponibles.

Pont helix et d&eacute;clencheur boucle perturbations g&eacute;n&egrave;rent une ARN polym&eacute;rases.

Zellul&auml;re RNA-Polymerasen sind stark konservierten Enzyme, die komplexe Konformationsver&auml;nderungen um die Verarbeitung von Nukleins&auml;ure-Substraten durch die aktiv-Seite koordinieren zu unterziehen. Zwei Dom&auml;nen insbesondere die Br&uuml;cke-Helix und der Trigger-Schleife eine Schl&uuml;sselrolle in diesem Mechanismus durch Annahme verschiedenen Konformationen in verschiedenen Phasen des Zyklus zus&auml;tzlich Nukleotid. Die funktionelle Relevanz dieser strukturellen Ver&auml;nderungen war schwierig aus der relativ kleinen Anzahl von statischen Kristallstrukturen derzeit verf&uuml;gbaren beurteilen.

Br&uuml;cke Helix und Trigger Schleife Perturbationen generieren superaktiven RNA-Polymerasen.

Polimerasi del RNA cellulare sono enzimi altamente conservati che subiscono cambiamenti conformazionali complessi per coordinare l&#39;elaborazione di substrati acidi nucleici attraverso il sito attivo. Due domini in particolare, elica del ponte e il ciclo di trigger, un ruolo chiave in questo meccanismo di adottare conformazioni diverse nelle varie fasi del ciclo di aggiunta del nucleotide. La rilevanza di questi cambiamenti strutturali funzionale &egrave; stata difficile da valutare dal numero relativamente piccolo di cristallo statico strutture attualmente disponibili.

Ponte helix e trigger loop perturbazioni generano superactive polimerasi del RNA.

&#x7D30;&#x80DE;&#x306E; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6838;&#x9178;&#x57FA;&#x677F;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3092;&#x901A;&#x3058;&#x3066;&#x306E;&#x51E6;&#x7406;&#x3092;&#x8ABF;&#x6574;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x308B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x7BC0;&#x7D04;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;2 &#x3064;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30B8; &#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x30FC; &#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x518D;&#x751F;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3053;&#x306E;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3067;&#x306F;&#x63A1;&#x7528;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7ACB;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x6DFB;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x95A2;&#x9023;&#x6027;&#x73FE;&#x5728;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x9759;&#x7684;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x6570;&#x304B;&#x3089;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x6A4B;&#x306E;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x30FC; &#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x6442;&#x52D5; superactive RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; RNA &#xD3F4; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xC131; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xD575; &#xC0B0; &#xAE30;&#xD310; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC870;&#xC815; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD2B9;&#xD788; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xBC0F; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xAC70; &#xB8E8;&#xD504; &#xD575;&#xC2EC;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xB2F4;&#xB2F9;&#xD560;&#xC774; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xC785; &#xB2E4;&#xB978; conformations &#xC5EC; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC8FC;&#xAE30;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC870; &#xBCC0;&#xD654;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xAD00;&#xB828;&#xC131;&#xC740; &#xD604;&#xC7AC; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC815;&#xC801; &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC801;&#xC740; &#xC218;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6E0;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBE0C;&#xB9AC;&#xC9C0; &#xB098;&#xC120; &#xBC0F; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xAC70; &#xB8E8;&#xD504; &#xBB3C;&#xACB0; &#xC0DD;&#xC131; superactive RNA &#xD3F4;.

Celulares ARN polimerasas son enzimas altamente conservadas que sufren cambios conformacionales complejos para coordinar el proceso de sustratos &aacute;cidos nucleicos a trav&eacute;s del sitio activo. Dos dominios en particular, la h&eacute;lice del puente y el bucle de gatillo, juega un papel clave en este mecanismo por adoptantes conformaciones diferentes en distintas etapas del ciclo de la adici&oacute;n de nucle&oacute;tidos. La importancia funcional de estos cambios estructurales ha sido dif&iacute;cil evaluar desde el n&uacute;mero relativamente peque&ntilde;o de estructuras est&aacute;ticas de cristal disponibles en la actualidad.

Puente de h&eacute;lice y gatillo de perturbaciones lazo generan superactive Polimerasas del RNA.

RNAPs (RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#xFF09; &#x662F;&#x5305;&#x542B;&#x8BE5;&#x7EDF;&#x7B79;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x548C;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x57FA;&#x677F;&#x901A;&#x8FC7;&#x50AC;&#x5316;&#x7F51;&#x7AD9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5668;&#x3002;X &#x5C04;&#x7EBF;&#x56FE;&#x50CF;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x3001; &#x53E4;&#x83CC;&#x548C;&#x771F;&#x6838; RNAPs &#x8FC7;&#x53BB;&#x5341;&#x5E74;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x7EC6;&#x8282;&#xFF0C;&#x4F46;&#x8BB8;&#x591A;&#x673A;&#x68B0;&#x529F;&#x80FD;&#x53EF;&#x4EE5;&#x53EA;&#x6709;&#x6D3E;&#x751F;&#x95F4;&#x63A5;&#x5730;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x5B9E;&#x65BD;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0E;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x81EA;&#x52A8;&#x751F;&#x6210;&#x57FA;&#x4E8E;&#x4E0E;&#x5B9A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x53E4; RNAP Methanocaldococcus jannaschii &#x4ECE;&#x51E0;&#x5341;&#x4E07;&#x7684;&#x542B;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x6587;&#x4EF6;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x96C6;&#x4E2D;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x6700;&#x8FD1;&#x4ECE;&#x5230;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x57DF;&#x5E94;&#x7528;&#x6B64;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7684;&#x7B56;&#x7565;&#x83B7;&#x5F97;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6F14;&#x793A;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x7ECF;&#x5386;&#x72ED;&#x9698;&#x5C01;&#x95ED;&#x533A;&#x57DF;&#x5185;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316; &#xFF08;mjA&#39; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) &#x6DFB;&#x52A0;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684;&#x5468;&#x671F;&#x3002;&#x5929;&#x7136;&#x690D;&#x7269; RNAP &#x56DB;&#x3001; &#x6FC0;&#x8FDB;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x53D8;&#x5316;&#x4E0E; V &#x9176;&#x5BF9;&#x8FD9;&#x4E00;&#x5730;&#x533A;&#x7684;&#x5730;&#x56FE;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E00;&#x9886;&#x57DF;&#x5185;&#x7684;&#x8BB8;&#x591A;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4; RNAP &#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027; (&#39;superactivity&#39;) &#x5EFA;&#x8BAE; RNAP &#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9; conformationally &#x53D7;&#x5230;&#x5927;&#x91CF;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;

&#x7EB3;&#x7C73;&#x529B;&#x5B66;&#x7EA6;&#x675F;&#x884C;&#x4E8B;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x50AC;&#x5316;&#x7684;&#x7F51;&#x7AD9;&#x4E0A;&#x3002;

RNAPs (RNA polymerases) are complex molecular machines containing structural domains that co-ordinate the movement of nucleic acid and nucleotide substrates through the catalytic site. X-ray images of bacterial, archaeal and eukaryotic RNAPs have provided a wealth of structural detail over the last decade, but many mechanistic features can only be derived indirectly from such structures. We have therefore implemented a robotic high-throughput structure-function experimental system based on the automatic generation and assaying of hundreds of site-directed mutants in the archaeal RNAP from Methanocaldococcus jannaschii. In the present paper, I focus on recent insights obtained from applying this experimental strategy to the bridge-helix domain. Our work demonstrates that the bridge-helix undergoes substantial conformational changes within a narrowly confined region (mjA' Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) during the nucleotide-addition cycle. Naturally occurring radical sequence variations in plant RNAP IV and V enzymes map to this region. In addition, many mutations within this domain cause a substantial increase in the RNAP catalytic activity ('superactivity'), suggesting that the RNAP active site is conformationally constrained.

Nanomechanical constraints acting on the catalytic site of cellular RNA polymerases.

RNAPs (ARN polym&eacute;rases) sont des machines mol&eacute;culaires complexes contenant des domaines structuraux qui coordonnent le mouvement des acides nucl&eacute;iques et des substrats de nucl&eacute;otides &agrave; travers le site catalytique. Radiographies des bact&eacute;ries, arch&eacute;es et eucaryotes RNAPs ont fourni une profusion de d&eacute;tails structurels au cours de la derni&egrave;re d&eacute;cennie, mais beaucoup de caract&eacute;ristiques m&eacute;caniques ne peut &ecirc;tre d&eacute;duit indirectement de telles structures. Nous avons donc mis en place un syst&egrave;me exp&eacute;rimental de structure-fonction de robotique haut d&eacute;bit bas&eacute;e sur la g&eacute;n&eacute;ration automatique et analyse de centaines de mutants dirig&eacute;e dans l&#39;archaea RNAP de Methanocaldococcus jannaschii. Dans le pr&eacute;sent document, je me concentre sur les aper&ccedil;us r&eacute;cents obtenus d&#39;appliquer cette strat&eacute;gie exp&eacute;rimentale du domaine de pont-h&eacute;lice. Notre travail montre que la pont-h&eacute;lice subit des changements conformationnels substantielles dans une r&eacute;gion &eacute;troitement confin&eacute;e (mjA&#39; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) pendant le cycle de nucl&eacute;otide-addition. Naturellement des variations de s&eacute;quence radical en usine RNAP IV et carte d&#39;enzymes V dans cette r&eacute;gion. De plus, plusieurs mutations dans ce domaine provoquent une augmentation substantielle de l&#39;activit&eacute; catalytique RNAP (&laquo; maladie &raquo;), ce qui sugg&egrave;re que le site actif RNAP est conformationnellement contraints.

Nanom&eacute;canique contraintes agissant sur le site catalytique de l&#39;ARN-polym&eacute;rases cellulaires.

RNAPs (RNA-Polymerasen) sind komplexe molekulare Maschinen, die mit strukturellen Dom&auml;nen die Koordinate der Bewegung von Nukleins&auml;ure und Nukleotid-Substraten durch die katalytische Site. R&ouml;ntgenbilder von Bakterien, Archaea und eukaryotischen RNAPs haben eine F&uuml;lle von strukturellen Details zur Verf&uuml;gung gestellt, in den letzten zehn Jahren, aber viele mechanistische Eigenschaften k&ouml;nnen nur indirekt von solcher Strukturen abgeleitet werden. Wir haben daher ein Roboter Hochdurchsatz-Struktur-Funktions-Experimentalsystem basierend auf die automatische Generierung und Pr&uuml;fung von Hunderten von Site-verwiesene Mutanten in der reitenden Name von Methanocaldococcus Jannaschii umgesetzt. In dem vorliegenden Papier konzentriere ich mich auf aktuelle Erkenntnisse aus der Anwendung dieser experimentellen Strategie auf der Br&uuml;cke-Helix-Dom&auml;ne abgerufen. Unsere Arbeit zeigt, dass die Br&uuml;cke-Helix erhebliche Konformationsver&auml;nderungen innerhalb einer eng begrenzten Region erf&auml;hrt (MjA&#39; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) w&auml;hrend der Nukleotid-Zusatz-Zyklus. Nat&uuml;rlich vorkommende radikale Sequenz Variationen im Werk Name IV und V Enzyme Karte in diese Region. Dar&uuml;ber hinaus verursachen viele Mutationen innerhalb dieser Dom&auml;ne einen erheblichen Anstieg der Name katalytische Aktivit&auml;t (&Uuml;beraktivit&auml;t), was darauf hindeutet, dass der Name aktiven Site konformationsgehinderten eingeschr&auml;nkt ist.

Nanomechanischen Einschr&auml;nkungen, die auf der katalytischen Website der zellul&auml;ren RNA-Polymerasen.

RNAPs (polimerasi del RNA) sono complesse macchine molecolari contenenti domini strutturali che coordinano il movimento dell&#39;acido nucleico e nucleotide substrati attraverso il sito catalitico. Immagini a raggi x di batterico, archaeal e RNAPs eucarioti hanno fornito una ricchezza di dettagli strutturali nell&#39;ultimo decennio, ma molte caratteristiche meccanicistiche solo possono essere derivate indirettamente da tali strutture. Pertanto abbiamo implementato un sistema sperimentale di robotica ad alta velocit&agrave; struttura-funzione basata sulla generazione automatica e dosaggio di centinaia di mutanti sito-regia di archaeal RNAP da Methanococcus jannaschii. Nel presente documento, mi concentro su intuizioni recenti ottenuti dall&#39;applicazione di questa strategia sperimentale al dominio ponte-elica. Il nostro lavoro dimostra che il ponte-elica subisce sostanziali cambiamenti conformazionali all&#39;interno di una regione strettamente confinata (mjA&#39; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) durante il ciclo di nucleotide-aggiunta. Naturalmente, che si verificano variazioni di sequenza radicale in pianta RNAP IV e V enzimi cartina di questa regione. Inoltre, molte mutazioni all&#39;interno di questo dominio causano un notevole aumento dell&#39;attivit&agrave; catalitica di RNAP (iperattivita &#39; della&#39;), suggerendo che il sito attivo RNAP conformazionalmente &egrave; vincolato.

Vincoli nanomeccanici agendo sul sito catalitico della polimerasi del RNA cellulare.

RNAPs &#xFF08;RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF09; &#x69CB;&#x9020;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x305D;&#x306E;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30CD;&#x30FC;&#x30C8;&#x6838;&#x9178;&#x3001;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x57FA;&#x677F;&#x89E6;&#x5A92;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x30DE;&#x30B7;&#x30F3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x83CC;&#x3001;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x3084;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNAPs &#x306E; x &#x7DDA;&#x50CF;&#x306F;&#x6700;&#x5F8C;&#x306E;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B1;&#x30A4;&#x30C9;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x7D30;&#x90E8;&#x306E;&#x5BCC;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x6A5F;&#x68B0;&#x7684;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x307F;&#x76F4;&#x63A5;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x304B;&#x3089;&#x6D3E;&#x751F;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x81EA;&#x52D5;&#x751F;&#x6210;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x3057;&#x3001;RNAP &#x53E4;&#x7D30;&#x83CC; Methanocaldococcus jannaschii &#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x6307;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x4F55;&#x767E;&#x3082;&#x306E;&#x8A66;&#x91D1;&#x306E;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x95A2;&#x6570;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x5B9F;&#x88C5;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x8AD6;&#x6587;&#x3067;&#x306F;, &#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304B;&#x3089;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x529B;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30B8; &#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x72ED;&#x304F;&#x9650;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x9818;&#x57DF;&#x5185;&#x306E;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x7D4C;&#x308B;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x4ED5;&#x4E8B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059; (mjA&#39; &#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x4ED8;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x4E2D;&#x306B; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824))&#x3002;&#x81EA;&#x7136;&#x690D;&#x7269; RNAP IV &#x306E;&#x6025;&#x9032;&#x7684;&#x306A;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x5909;&#x5316;&#x3068; V &#x9175;&#x7D20;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3053;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x306B;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x5909;&#x7570; RNAP &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3092;&#x30A8;&#x30D4;&#x30AC;&#x30ED;&#x30AB;&#x30C6;&#x30AD;&#x30F3;&#x793A;&#x5506; RNAP &#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027; (&#39;superactivity&#39;) &#x306E;&#x5927;&#x5E45;&#x306A;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30CA;&#x30CE;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30AB;&#x30EB;&#x5236;&#x7D04;&#x7D30;&#x80DE; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNAPs (RNA &#xD3F4;)&#xB294; &#xADF8; &#xACF5;&#xB3D9; &#xD575; &#xC0B0; &#xBC0F; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD1B5;&#xD574; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xAD6C;&#xC870; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xAE30;&#xACC4;. &#xC138;&#xADE0;, archaeal &#xC9C4; &#xD575; Rnaps&#xC758; x-&#xC120; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xC9C0;&#xB09C; 10 &#xB144;&#xAC04; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xAD6C;&#xC870; &#xC138;&#xBD80; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB9CE;&#xC740; &#xAE30;&#xACC4; &#xAE30;&#xB2A5;&#xB9CC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB420; &#xC218; &#xC5C6;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC9C1;&#xC811; &#xADF8;&#xB7F0; &#xAD6C;&#xC870;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8;&#xB7EC;&#xBBC0;&#xB85C; &#xB192;&#xC740;-&#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xB85C;&#xBD07; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xC790;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; &#xC218;&#xBC31; &#xAC1C;&#xC758; archaeal RNAP Methanocaldococcus jannaschii&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5;&#xC758; &#xC2DC;&#xB97C; &#xAD6C;&#xD604; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC2E0;&#xBB38;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB098; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC801;&#xC6A9;&#xC774; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC801;&#xC778; &#xC804;&#xB7B5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5BB;&#xC740; &#xCD5C;&#xADFC; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC77C; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xC881;&#xAC8C; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xACAA; &#xC2B5; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; (mjA&#39; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC8FC;&#xAE30; &#xB3D9;&#xC548; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)). &#xACF5;&#xC7A5; RNAP IV&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE09;&#xC9C4;&#xC801;&#xC778; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xBCC0;&#xD654;&#xC640; V &#xD6A8;&#xC18C; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC774; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC790;&#xC5F0;&#xC2A4;&#xB7FD; &#xAC8C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;,&#xC774; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9CE;&#xC740; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; RNAP &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; conformationally &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xC81C;&#xC548; RNAP &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9; (&#39;superactivity&#39;)&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xC6D0;&#xC778;.

Nanomechanical &#xC81C;&#xC57D; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; RNA &#xD3F4;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;.

RNAPs (Polimerasas del RNA) son m&aacute;quinas moleculares complejas que contienen dominios estructurales coordinar el movimiento de &aacute;cidos nucleicos y nucle&oacute;tidos sustratos a trav&eacute;s del sitio catal&iacute;tico. Im&aacute;genes de rayos x de bacterias, arqueobacterias y RNAPs eucariotas han proporcionado una gran cantidad de detalle estructural durante la &uacute;ltima d&eacute;cada, pero muchas caracter&iacute;sticas mec&aacute;nicas s&oacute;lo pueden derivar indirectamente de tales estructuras. Por lo tanto, hemos implementado un sistema experimental de rob&oacute;tica estructura-funci&oacute;n de alto rendimiento basado en la generaci&oacute;n autom&aacute;tica y ensayo de cientos de mutantes dirigida en el archaeal RNAP de Methanococcus Methanococcus. En el presente documento, me enfoco en penetraciones recientes obtenidos de la aplicaci&oacute;n de esta estrategia experimental el dominio puente-h&eacute;lice. Nuestro trabajo demuestra que la h&eacute;lice puente sufre importantes cambios conformacionales dentro de una regi&oacute;n estrechamente confinado (mjA&#39; Ala(822)-Gln(823)-Ser(824)) durante el ciclo de la adici&oacute;n de nucle&oacute;tidos. Naturales las variaciones de la secuencia radical en planta RNAP IV y V enzimas mapa a esta regi&oacute;n. Adem&aacute;s, muchas mutaciones dentro de este dominio provocan un aumento sustancial en la actividad catal&iacute;tica de la RNAP (&#39;superactivity&#39;), lo que sugiere que el sitio activo de descubrimiento conformationally es limitado.

Limitaciones nanomec&aacute;nicos actuando en el sitio catal&iacute;tico de Polimerasas del RNA celulares.

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x9700;&#x8981;&#x57FA;&#x5E95;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x534F;&#x52A9;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5728;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x5176;&#x4E2D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x56E0;&#x7D20;&#xFF0C;TFIIB&#xFF0C;&#x7ED3;&#x5408;&#x62DB;&#x8058; RNAP&#xFF0C;&#x7194;&#x5316;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x8BC6;&#x522B;&#x3001; &#x5F00;&#x59CB;&#x9009;&#x5740;&#x548C;&#x5404;&#x79CD; post-initiation &#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#39; TFIIB 381 &#x5B9A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x6765;&#x523A;&#x6FC0;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6709;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5730;&#x91CF;&#x5316;&#x4F7F;&#x7528;&#x72EC;&#x7ACB;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x4E8C;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6269;&#x5C55;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7FA4;&#x96C6; &#xFF08;mjTFIIB E78 R80 &#x548C; mjTFIIB R90-G94&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;)&#xFF0C;&#x662F;&#x7279;&#x522B;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x66FF;&#x6362;&#x3002;&#x4E0E;&#x6B64;&#x76F8;&#x53CD;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7FA4;&#x96C6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x77ED;&#x5E8F;&#x5217; &#xFF08;mjTFIIB A81 K89) &#x5BB9;&#x5FCD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x66FF;&#x6362; &#xFF1B;&#x77ED;&#x5220;&#x9664;&#x8BE5;&#x5730;&#x533A;&#x751A;&#x81F3;&#x9020;&#x6210;&#x523A;&#x6FC0;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8F6C;&#x5F55; (&#39;superstimulation&#39;) TFIIB &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x6709;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;Superstimulating &#x6D3B;&#x52A8;&#x505A;&#x7684;&#x90A3;&#x6837;&#xFF0C;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x6CA1;&#x6709;&#x5173;&#x8054; TFIIB/RNAP &#x590D;&#x6742;&#x589E;&#x52A0;&#x62DB;&#x8058;&#x56E0;&#x4E3A;&#x4E2D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269; (mjTFIIB K87) &#x66FF;&#x6362;&#x589E;&#x52A0;&#x62DB;&#x52DF;&#x8D85;&#x8FC7; 5 &#x500D;&#x800C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8C08;&#x8BDD;&#x523A;&#x6FC0;&#x7684;&#x901F;&#x7387;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6F14;&#x793A; TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x5185;&#x7684;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x66F4;&#x6539;&#x6709;&#x6DF1;&#x523B;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#x7684;&#x65AD;&#x5F00;&#x8FDE;&#x63A5;&#xFF0C;RNAP &#x62DB;&#x8058;&#x3001; TFIIB/RNAP &#x590D;&#x6742;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x786E;&#x5B9A; superstimulating TFIIB &#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x63ED;&#x793A;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x6700;&#x65E9;&#x9636;&#x6BB5;&#xFF0C;&#x6839;&#x636E;&#x4EE5;&#x524D;&#x672A;&#x77E5;&#x7684;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;

&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50; TFIIB &#x7684;&#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#x63A7;&#x5236;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x5F81;&#x8058;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x523A;&#x6FC0;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;

RNA polymerases (RNAPs) require basal transcription factors to assist them during transcription initiation. One of these factors, TFIIB, combines promoter recognition, recruitment of RNAP, promoter melting, start site selection and various post-initiation functions. The ability of 381 site-directed mutants in the TFIIB 'linker domain' to stimulate abortive transcription was systematically quantitated using promoter-independent dinucleotide extension assays. The results revealed two distinct clusters (mjTFIIB E78-R80 and mjTFIIB R90-G94, respectively) that were particularly sensitive to substitutions. In contrast, a short sequence (mjTFIIB A81-K89) between these two clusters tolerated radical single amino acid substitutions; short deletions in that region even caused a marked increase in the ability of TFIIB to stimulate abortive transcription ('superstimulation'). The superstimulating activity did, however, not correlate with increased recruitment of the TFIIB/RNAP complex because substitutions in a particular residue (mjTFIIB K87) increased recruitment by more than 5-fold without affecting the rate of abortive transcript stimulation. Our work demonstrates that highly localized changes within the TFIIB linker have profound, yet surprisingly disconnected, effects on RNAP recruitment, TFIIB/RNAP complex stability and the rate of transcription initiation. The identification of superstimulating TFIIB variants reveals the existence of a previously unknown rate-limiting step acting on the earliest stages of gene expression.

The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.

ARN polym&eacute;rases (RNAPs) n&eacute;cessitent des facteurs de transcription basale afin de les aider au cours de l&#39;initiation de la transcription. Un de ces facteurs, TFIIB, combine la reconnaissance de promoteur, recrutement de RNAP, promoteur de fusion, commencer la s&eacute;lection du site et des diverses fonctions post-initiation. La capacit&eacute; de 381 mutants dirig&eacute;e dans le TFIIB &laquo; domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens &raquo; pour stimuler la transcription avort&eacute;e a &eacute;t&eacute; dos&eacute;e syst&eacute;matiquement utilisant la prolongation dinucl&eacute;otide ind&eacute;pendant du promoteur. Les r&eacute;sultats ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; deux groupes distincts (mjTFIIB E78-R80 et mjTFIIB R90-G94, respectivement) qui sont particuli&egrave;rement sensibles &agrave; des substitutions. En revanche, une courte s&eacute;quence (A81-K89 mjTFIIB) entre ces deux groupes tol&eacute;r&eacute;s substitution radicalaire seul acide amin&eacute; ; destructions courtes dans cette r&eacute;gion a provoqu&eacute; une augmentation marqu&eacute;e encore la capacit&eacute; de TFIIB pour stimuler la transcription avort&eacute;e (&laquo; surstimulation &raquo;). L&#39;activit&eacute; superstimulating a fait, cependant, pas en corr&eacute;lation avec l&#39;augmentation du recrutement de la TFIIB/RNAP complexe parce que substitutions dans un r&eacute;sidu particuli&egrave;re (mjTFIIB K87) augment&eacute; de recrutement de plus de 5 fois sans affecter le taux de stimulation transcription avort&eacute;e. Notre travail montre que des modifications tr&egrave;s localis&eacute;es dans l&#39;&eacute;diteur de liens TFIIB ont des effets profonds, mais &eacute;tonnamment d&eacute;connect&eacute;es, recrutement RNAP, stabilit&eacute; complexe TFIIB/RNAP et le taux d&#39;initiation de la transcription. L&#39;identification des superstimulating TFIIB variantes r&eacute;v&egrave;le l&#39;existence d&#39;une inconnu &eacute;tape cin&eacute;tiquement limitante, agissant sur les premi&egrave;res &eacute;tapes de l&#39;expression g&eacute;nique.

Le domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens de facteur de transcription basale TFIIB contr&ocirc;le des fonctions distinctes de recrutement et de la transcription stimulation.

RNA-Polymerasen (RNAPs) erfordern basalen Transkriptionsfaktoren, ihnen zu helfen, w&auml;hrend Initiation der Transkription. Einer dieser Faktoren, TFIIB, kombiniert Projekttr&auml;ger Anerkennung, Rekrutierung von Name, Projekttr&auml;ger, die schmelzen, Standortwahl und verschiedenen post-initiation Funktionen zu starten. Die F&auml;higkeit von 381 Site-verwiesene Mutanten in der TFIIB &#39;Linker Dom&auml;ne&#39; F&ouml;rderung der erfolglosen Transkription wurde systematisch quantifiziert mit Projekttr&auml;ger-unabh&auml;ngige-dinucleotid Erweiterung Proben. Die Ergebnisse zeigten zwei verschiedene Cluster (MjTFIIB E78-R80 und MjTFIIB R90-G94, beziehungsweise), die besonders empfindlich auf Auswechslungen waren. Im Gegensatz dazu toleriert eine kurze Sequenz (MjTFIIB A81-K89) zwischen diesen zwei Clustern radikale einzelne Aminos&auml;ure Ersetzungen; kurze Deletionen in dieser Region verursacht sogar eine deutliche Zunahme in der F&auml;higkeit der TFIIB, abortive Transkription (&#39;Superstimulation&#39;) zu f&ouml;rdern. Die superstimulating Aktivit&auml;t, jedoch nicht mit verst&auml;rkte Rekrutierung von komplexen TFIIB/Name korrelieren, weil Ersetzungen in einer bestimmten R&uuml;ckstand (MjTFIIB K87) Rekrutierung von mehr als 5-fach erh&ouml;ht ohne Auswirkungen auf die Rate der erfolglosen Abschrift Stimulation. Unsere Arbeit zeigt, dass hoch lokalisierte &Auml;nderungen innerhalb der TFIIB-Linker tiefgreifende, dennoch &uuml;berraschend getrennt, auf Name Rekrutierung, TFIIB/Name Komplexstabilit&auml;t und die Rate der Initiation der Transkription auswirken. Die Identifizierung von superstimulating TFIIB Varianten zeigt die Existenz einer bisher unbekannten geschwindigkeitsbestimmende Schritt auf den fr&uuml;hesten Stadien der Genexpression.

Linker Bereich der basalen &Uuml;bertragungfaktor TFIIB steuert unterschiedliche Rekrutierung und Transkription Stimulierung-Funktionen.

Polimerasi del RNA (RNAPs) necessitano di fattori di trascrizione basali ad assisterli durante l&#39;iniziazione della trascrizione. Uno di questi fattori, TFIIB, unisce il riconoscimento del promotore, reclutamento di RNAP, promotore di fusione, inizio selezione del sito e varie funzioni di post-initiation. La capacit&agrave; di 381 mutanti sito-diretto nel TFIIB &#39;dominio linker&#39; per stimolare la trascrizione abortiva sistematicamente era quantificati utilizzando dosaggi estensione dinucleotide promotore indipendente. I risultati hanno rivelato due ammassi distinti (mjTFIIB E78-R80 e mjTFIIB G94-R90, rispettivamente) che sono stati particolarmente sensibili alle sostituzioni. Al contrario, una breve sequenza (mjTFIIB A81-K89) tra questi due ammassi tollerato radicale singolo aminoacidiche; breve delezioni in quella regione anche causato un marcato aumento nella capacit&agrave; di TFIIB per stimolare la trascrizione abortiva (&#39;superstimulation&#39;). L&#39;attivit&agrave; superstimulating, tuttavia, non correlare con aumentata assunzione del TFIIB/RNAP complesso perch&eacute; le sostituzioni in un particolare residuo (mjTFIIB K87) aumentato reclutamento di pi&ugrave; di 5-fold senza alterare la frequenza di stimolazione di trascrizione abortiva. Il nostro lavoro dimostra che modifiche altamente localizzate all&#39;interno del linker TFIIB hanno effetti profondi, eppure sorprendentemente disconnessi, sul reclutamento RNAP, TFIIB/RNAP complesso stabilit&agrave; e la velocit&agrave; di iniziazione della trascrizione. L&#39;identificazione del superstimulating TFIIB varianti rivela l&#39;esistenza di un passo di limitazione della velocit&agrave; precedentemente sconosciuto agendo sulle prime fasi dell&#39;espressione genica.

Il dominio linker del fattore di trascrizione basale TFIIB controlla funzioni distinte di stimolazione reclutamento e trascrizione.

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (RNAPs) &#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x652F;&#x63F4;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3068;&#x69D8;&#x3005; &#x306A;&#x521D;&#x671F;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3001;TFIIB&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8981;&#x56E0;&#x306E; 1 &#x3064;&#x52DF;&#x96C6; RNAP &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x878D;&#x89E3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;381 &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x6307;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x7CFB;&#x7D71; TFIIB &#39;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#39; &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x306B;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x306B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x72EC;&#x7ACB;&#x88DC;&#x9175;&#x7D20;&#x5EF6;&#x9577;&#x306E;&#x8A66;&#x91D1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC; (mjTFIIB e78 &#x3067;&#x793A;&#x3055; R80 &#x3068; mjTFIIB R90 G94 &#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;) &#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306B;&#x7279;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x9593;&#x306E;&#x77ED;&#x3044;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; (mjTFIIB A81 K89) &#x30E9;&#x30B8;&#x30AB;&#x30EB;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;&#x5BB9;&#x8A8D;;&#x305D;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x77ED;&#x3044;&#x524A;&#x9664;&#x3082;&#x8457;&#x3057;&#x3044;&#x5897;&#x52A0; TFIIB &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3067;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x8EE2;&#x5199; (&#39;superstimulation&#39;&#xFF09; &#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3059;&#x308B;&#x539F;&#x56E0;&#x3002;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x6B8B;&#x6E23; (mjTFIIB K87) &#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x52DF;&#x96C6;&#x3088;&#x308A;&#x3082; 5 &#x500D;&#x9813;&#x632B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3; &#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x523A;&#x6FC0;&#x306E;&#x7387;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305A;&#x5897;&#x52A0;&#x305F;&#x3081; superstimulating &#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x304C; TFIIB/RNAP &#x8907;&#x96D1;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x63A1;&#x7528;&#x3092;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x4ED5;&#x4E8B;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5909;&#x66F4; TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x5185; RNAP &#x52DF;&#x96C6;&#x3001;TFIIB/RNAP &#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x7387;&#x306E;&#x6DF1;&#x9060;&#x306A;&#x307E;&#x3060;&#x9A5A;&#x304F;&#x307B;&#x3069;&#x5207;&#x65AD;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F71;&#x97FF;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8B58;&#x5225; superstimulating TFIIB &#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x521D;&#x671F;&#x6BB5;&#x968E;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x672A;&#x77E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; TFIIB &#x306E;&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x52DF;&#x96C6;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x523A;&#x6FC0;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNA &#xD3F4; (RNAPs) &#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC120;&#xD0DD; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; post-initiation &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC2DC;&#xC791;, &#xD558;&#xB098; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC694;&#xC18C;, TFIIB, &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC778;&#xC2DD;, RNAP, &#xC6A9;&#xC735; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xBAA8;&#xC9D1;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD55C;&#xB2E4;. TFIIB &#39;&#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#39;&#xC5D0; 381 &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; &#xBBA4;&#xD134;&#xD2B8;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825; &#xC870;&#xC0B0;&#xC758; &#xC804;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xB294; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; quantitated &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xB514;&#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xD655;&#xC7A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. &#xACB0;&#xACFC; &#xBC1C;&#xD45C; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; (mjTFIIB E78 R80 &#xBC0F; mjTFIIB R90 G94 &#xAC01;&#xAC01;) &#xB300;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xBBFC;&#xAC10; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xBA74;, &#xC9E7;&#xC740; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; (mjTFIIB A81 K89) &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB450; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xAC04;&#xC758; &#xC6A9;&#xB0A9; &#xAE09;&#xC9C4;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4;; &#xADF8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9E7;&#xC740; &#xC0AD;&#xC81C;&#xB3C4; &#xC870;&#xC0B0; &#xC804;&#xC0AC; (&#39;superstimulation&#39;)&#xC744; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xB294; TFIIB&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xD604;&#xC800;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; superstimulating &#xD65C;&#xB3D9;, &#xAD00;&#xB828; &#xB418;&#xC9C0; &#xC99D;&#xAC00; &#xBAA8;&#xC9D1; TFIIB/RNAP &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xC794;&#xC5EC;&#xBB3C; (mjTFIIB K87)&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xCCB4; &#xC778;&#xC0C1; &#xC870;&#xC0B0; &#xC131;&#xC801; &#xC790;&#xADF9;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xC774;&#xC0C1; 5-fold&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC44;&#xC6A9; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC791;&#xC5C5; TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB0B4;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB41C; &#xBCC0;&#xACBD; RNAP &#xBAA8;&#xC9D1;, TFIIB/RNAP &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xAE4A;&#xACE0;, &#xC544;&#xC9C1;&#xC740; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B8; &#xC815;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC5F0;&#xACB0;&#xC774; &#xB04A;&#xAE34; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Id superstimulating TFIIB&#xC758; &#xBCC0;&#xC885; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC758; &#xCD08;&#xAE30; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0; &#xD589;&#xB3D9; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

&#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; TFIIB&#xC758; &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBCC4;&#xAC1C; &#xBAA8;&#xC9D1; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xC790;&#xADF9; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC81C;&#xC5B4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

ARN polimerasas (RNAPs) requieren factores de transcripci&oacute;n basal para ayudarles durante la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. Uno de estos factores, TFIIB, combina el reconocimiento del promotor, reclutamiento de descubrimiento, promotor de fusi&oacute;n, comenzar la selecci&oacute;n del sitio y varias funciones de post-initiation. La capacidad de 381 mutantes dirigida en el TFIIB &quot;dominio de vinculador&quot; estimular la transcripci&oacute;n abortiva sistem&aacute;ticamente fue cuantificado mediante ensayos de extensi&oacute;n de dinucle&oacute;tido promotor independiente. Los resultados revelaron dos distintos grupos (mjTFIIB E78-R80 y mjTFIIB R90-G94, respectivamente) que eran particularmente sensibles a las substituciones. En cambio, una secuencia corta (mjTFIIB A81-K89) entre estas dos agrupaciones toleraba sustituciones de amino&aacute;cidos individuales radical; cortos eliminaciones en esa regi&oacute;n incluso causaron un marcado aumento en la capacidad de TFIIB para estimular la transcripci&oacute;n abortivo (&#39;superstimulation&#39;). La actividad superstimulating, sin embargo, no se correlacion&oacute; con mayor contrataci&oacute;n del complejo TFIIB/descubrimiento porque sustituciones en un residuo determinado (mjTFIIB K87) creciente reclutamiento por m&aacute;s de 5 veces sin afectar la tasa de estimulaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n abortiva. Nuestro trabajo demuestra que los cambios muy localizados dentro de la m&aacute;quina para hacer chorizos TFIIB tienen efectos profundos, pero sorprendentemente desconectados, en reclutamiento ARNP, estabilidad compleja TFIIB/descubrimiento y la tasa de iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. La identificaci&oacute;n de superstimulating TFIIB variantes revela la existencia de un paso de limitaci&oacute;n de velocidad previamente desconocido actuando en las primeras etapas de la expresi&oacute;n g&eacute;nica.

El dominio de vinculador de factor de transcripci&oacute;n basal TFIIB controla distintas funciones de estimulaci&oacute;n de reclutamiento y transcripci&oacute;n.

Polimerasas del RNA celulares (RNAPs) son m&aacute;quinas moleculares complejas que combinan la cat&aacute;lisis con cambios conformacionales concertados en el centro activo. Trabajos previos demostraron que enroscarse de una regi&oacute;n bisagra cerca el c-terminal de la h&eacute;lice de la puente (BH-H(C)) juega un papel fundamental en el control de la velocidad catal&iacute;tica.

El ciclo de la adici&oacute;n de nucle&oacute;tidos de ARN polimerasa es controlado por dos bisagras moleculares en el dominio de la h&eacute;lice del puente.

Cellular RNA polymerases (RNAPs) are complex molecular machines that combine catalysis with concerted conformational changes in the active center. Previous work showed that kinking of a hinge region near the C-terminus of the Bridge Helix (BH-H(C)) plays a critical role in controlling the catalytic rate.

The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.

ARN-polym&eacute;rases cellulaires (RNAPs) sont des machines mol&eacute;culaires complexes qui allient des changements conformationnels concert&eacute;s dans le centre actif de catalyse. Des travaux ant&eacute;rieurs ont montr&eacute; que pincement d&#39;une r&eacute;gion charni&egrave;re pr&egrave;s de l&#39;extr&eacute;mit&eacute; C-terminale de la spirale du pont (BH-H(C)) joue un r&ocirc;le essentiel dans le contr&ocirc;le de la vitesse catalytique.

Le cycle d&#39;addition de nucl&eacute;otides de l&#39;ARN polym&eacute;rase est contr&ocirc;l&eacute; par deux charni&egrave;res mol&eacute;culaires dans le domaine de pont Helix.

Zellul&auml;re RNA-Polymerasen (RNAPs) sind komplexe molekulare Maschinen, die Katalyse mit aufeinander abgestimmten Konformationsver&auml;nderungen im aktiven Zentrum zu verbinden. Fr&uuml;here Arbeiten zeigten, dass Knicken einer Scharnier-Region nahe der C-Terminus der Helix-Br&uuml;cke (BH-H(C)) spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der katalytischen Rate.

Der Nukleotid-Zusatz-Zyklus der RNA-Polymerase wird durch zwei Molekulare Scharniere in der Bridge-Helix-Dom&auml;ne gesteuert.

Polimerasi del RNA cellulare (RNAPs) sono macchine molecolari complesse che combinano catalisi concertate cambiamenti conformazionali nel centro attivo. Lavori precedenti hanno mostrato che si pieghi di una regione cerniera vicino al C-terminale dell&#39;elica Bridge (BH-H(C)) gioca un ruolo fondamentale nel controllare il tasso di catalitico.

Il ciclo di aggiunta nucleotidi di RNA polimerasi &egrave; controllato da due cerniere molecolare nel dominio Helix Bridge.

&#x7D30;&#x80DE;&#x306E; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (RNAPs) &#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x306E;&#x5354;&#x8ABF;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30DE;&#x30B7;&#x30F3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x524D;&#x306E;&#x4ED5;&#x4E8B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x305D;&#x306E;&#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x8FD1;&#x304F;&#x306E;&#x30D2;&#x30F3;&#x30B8;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x5C48;&#x66F2; &#xFF08;BH-H(C)) &#x89E6;&#x5A92;&#x306E;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5236;&#x5FA1;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x6DFB;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306F; 2 &#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30D2;&#x30F3;&#x30B8;&#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5236;&#x5FA1;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; RNA &#xD3F4; (RNAPs)&#xB294; &#xACF5;&#xB3D9; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654; &#xD65C;&#xC131; &#xC911;&#xC2EC;&#xC5D0; &#xCD09;&#xB9E4;&#xB97C; &#xACB0;&#xD569; &#xD558;&#xB294; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xAE30;&#xACC4;. &#xC774;&#xC804; &#xC791;&#xD488; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; C &#xC885;&#xC810; &#xADFC;&#xCC98; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC744; &#xACBD;&#xCCA9; &#xBE44;&#xD2C0;&#xBA74; &#xADF8; (BH-H(C)) &#xCD09;&#xB9E4; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD55C;&#xB2E4;.

RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC8FC;&#xAE30; &#xB450; &#xBD84;&#xC790; &#xACBD;&#xCCA9; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC81C;&#xC5B4; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x662F;&#x50AC;&#x5316;&#x7ED3;&#x5408;&#x5728;&#x6D3B;&#x52A8;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x5171;&#x540C;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5668;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x7EBD;&#x7ED3;&#x7684;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB; C &#x603B;&#x7AD9;&#x9644;&#x8FD1;&#x7684;&#x8F6C;&#x8F74;&#x533A;&#x57DF; &#xFF08;BH-H(C)) &#x53D1;&#x6325;&#x5173;&#x952E;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x63A7;&#x5236;&#x50AC;&#x5316;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x3002;

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x52A0;&#x5468;&#x671F;&#x7531;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5206;&#x5B50;&#x94F0;&#x94FE;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x57DF;&#x4E2D;&#x63A7;&#x5236;&#x3002;

RNAPs (RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#xFF09; &#x662F;&#x5305;&#x542B;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x7AD9;&#x70B9; conformationally &#x7075;&#x6D3B;&#x57DF;&#x5305;&#x56F4;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5668;&#x3002;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x8BF1;&#x53D8;&#x5728;&#x53E4;&#x83CC;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF; Methanocaldococcus jannaschii &#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57DF;&#xFF0C;-&#x87BA;&#x65CB;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x6865;&#x4E4B;&#x4E00;&#x7684;&#x7EB3;&#x7C73;&#x529B;&#x5B66;&#x6027;&#x80FD;&#x53D1;&#x6325;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x76D1;&#x7BA1;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x7387;&#x7684; NAC &#xFF08;&#x6DFB;&#x52A0;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684;&#x5468;&#x671F;&#xFF09;&#x3002;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x6982;&#x7387;&#x548C;/&#x6216;&#x626D;&#x7ED3;&#x5F62;&#x6210;&#x7684; BH HC (&#x6865;&#x87BA;&#x65CB; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x8F6C;&#x8F74;&#xFF09; &#x7684;&#x534A;&#x8870;&#x671F;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x5E45;&#x5EA6;&#x589E;&#x52A0;&#x7279;&#x5B9A;&#x6D3B;&#x52A8; &#xFF08;&#39; superactivity&#39;) &#x4E2D;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x539F;&#x5B50;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6A21;&#x62DF;&#x7814;&#x7A76;&#x663E;&#x793A;&#x7EBD;&#x7ED3; BH-HC &#x4F3C;&#x4E4E;&#x7531;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;-&pi; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x6D89;&#x53CA;&#x6240;&#x6709;&#x539F;&#x6838;&#x548C;&#x771F;&#x6838;&#x7269;&#x79CD;&#x4E2D;&#x6781;&#x9AD8;&#x7684;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x4FA7;&#x94FE;&#x3002;

&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;-&pi; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x5206;&#x5B50;&#x94F0;&#x94FE; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x57DF;&#x4E2D;&#x7684;&#x7EBD;&#x7ED3;&#x3002;

RNAPs (RNA polymerases) are complex molecular machines that contain a highly conserved catalytic site surrounded by conformationally flexible domains. High-throughput mutagenesis in the archaeal model system Methanocaldococcus jannaschii has demonstrated that the nanomechanical properties of one of these domains, the bridge-helix, exert a key regulatory role on the rate of the NAC (nucleotide-addition cycle). Mutations that increase the probability and/or half-life of kink formation in the BH-HC (bridge-helix C-terminal hinge) cause a substantial increase in specific activity ('superactivity'). Fully atomistic molecular dynamics simulations show that kinking of the BH-HC appears to be driven by cation-Ï€ interactions and involve amino acid side chains that are exceptionally highly conserved in all prokaryotic and eukaryotic species.

Cation-Ï€ interactions induce kinking of a molecular hinge in the RNA polymerase bridge-helix domain.

RNAPs (ARN polym&eacute;rases) sont des machines mol&eacute;culaires complexes qui contiennent un site catalytique hautement conserv&eacute; entour&eacute; de domaines conformationnellement flexibles. Mutagen&egrave;se haut d&eacute;bit dans l&#39;archaea mod&egrave;le syst&egrave;me Methanocaldococcus jannaschii a d&eacute;montr&eacute; que les propri&eacute;t&eacute;s nanom&eacute;triques de l&#39;un de ces domaines, la pont-h&eacute;lice, exercent un r&ocirc;le de r&eacute;glementation sur le taux du CNA (cycle de nucl&eacute;otide-ajout). Mutations qui augmentent la probabilit&eacute; et/ou de la demi-vie de la formation de pli dans le BH-HC (charni&egrave;re C-terminal de pont-h&eacute;lice) causent une augmentation substantielle de l&#39;activit&eacute; sp&eacute;cifique (&laquo; maladie &raquo;). Simulations de dynamique mol&eacute;culaire enti&egrave;rement atomistique montrent que coudure de la BH-HC semble de pilot&eacute;e par interactions cation-&pi; et impliquent des acides amin&eacute;s des cha&icirc;nes lat&eacute;rales qui sont exceptionnellement hautement conserv&eacute;es chez toutes les esp&egrave;ces procaryotes et eucaryotes.

Interactions cation-&pi; induisent le pincement d&#39;une charni&egrave;re mol&eacute;culaire dans le domaine de pont-h&eacute;lice d&#39;ARN polym&eacute;rase.

RNAPs (RNA-Polymerasen) sind komplexe molekulare Maschinen, die eine stark konservierte katalytische Website, umgeben von konformationsgehinderten flexible Dom&auml;nen enthalten. Hochdurchsatz-Mutagenese in die reitenden Modell System Methanocaldococcus Jannaschii hat gezeigt, dass die nanomechanischen Eigenschaften der eine dieser Dom&auml;nen, die Br&uuml;cke-Helix, eine wichtige regulatorische Rolle auf die Rate der NAK (Nukleotid-Zusatz-Zyklus) aus&uuml;ben. Mutationen, die Erh&ouml;hung der Wahrscheinlichkeit und/oder die Halbwertszeit von Knick-Formation in der BH-HC (Br&uuml;cke-Helix C-terminalen Scharnier) verursachen eine erhebliche Steigerung in spezifische Aktivit&auml;t (&#39;&Uuml;beraktivit&auml;t&#39;). Voll atomistische Molekulardynamik-Simulationen zeigen, dass Knicken des BH-HC scheint von kation-&pi;-Wechselwirkungen Gefahren werden und beinhalten Aminos&auml;ure-Seitenketten, die bei allen Arten von prokaryotischen und eukaryotischen au&szlig;ergew&ouml;hnlich stark konserviert sind.

Kation-&pi;-Wechselwirkungen induzieren eine molekulare Scharnier in der RNS-Polymerase-Br&uuml;cke-Helix-Dom&auml;ne Knicken.

RNAPs (polimerasi del RNA) sono macchine molecolari complesse che contengono un sito catalitico altamente conservato circondato dai domini conformazionalmente flessibile. Mutagenesi di alto-rendimento nel archaeal modello sistema Methanococcus jannaschii ha dimostrato che le propriet&agrave; nanomeccanici di uno di questi domini, il ponte-helix, esercitano un ruolo normativo sul tasso di NAC (ciclo del nucleotide-aggiunta). Mutazioni che aumentano la probabilit&agrave; e/o tempo di dimezzamento di formazione kink in BH-HC (cerniera di ponte-elica C-terminale) causano un aumento sostanza nell&#39;attivit&agrave; specifica (&#39;iperattivita &#39; della&#39;). Simulazioni di dinamica molecolare completamente atomistico mostrano che attorcigliamento del BH-HC sembra essere guidato dalle interazioni catione-&pi; e coinvolgere le catene laterali degli aminoacidi che sono eccezionalmente altamente conservate in tutte le specie di procariotiche ed eucarioti.

Le interazioni catione-&pi; inducono attorcigliamento di una cerniera molecolare nel dominio ponte-elica di RNA polimerasi.

RNAPs &#xFF08;RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF09; &#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x67D4;&#x8EDF;&#x306A;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x56F2;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x7BC0;&#x7D04;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x89E6;&#x5A92;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30DE;&#x30B7;&#x30F3;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30A2; &#x30E2;&#x30C7;&#x30EB; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0; Methanocaldococcus jannaschii &#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E; 1 &#x3064;&#x306E;&#x30CA;&#x30CE;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30AB;&#x30EB;&#x7279;&#x6027; NAC &#xFF08;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x4ED8;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;) &#x306E;&#x5272;&#x5408;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x898F;&#x5236;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x767A;&#x63EE;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x78BA;&#x7387;&#x3084; BH HC (&#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; C &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB; &#x30D2;&#x30F3;&#x30B8;) &#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AD;&#x30F3;&#x30AF;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x534A;&#x6E1B;&#x671F;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570; (&#39;superactivity&#39;) &#x3067;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x5927;&#x5E45;&#x306A;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x539F;&#x5B50;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E; BH HC &#x304D;&#x3093;&#x304F;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;-&pi; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x99C6;&#x52D5;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x539F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x3068;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x7A2E;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x6027;&#x304C;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x5074;&#x9396;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x898B;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;-&pi; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x5206;&#x5B50;&#x30D2;&#x30F3;&#x30B8; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306E;&#x306D;&#x3058;&#x308C;&#x3092;&#x8A98;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNAPs (RNA &#xD3F4;)&#xB294; &#xC720;&#xC5F0;&#xD55C; conformationally &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xB458;&#xB7EC;&#xC2F8;&#xC778; &#xB192;&#xC740; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xAE30;&#xACC4;. &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; mutagenesis archaeal &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; Methanocaldococcus jannaschii&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; nanomechanical &#xC18D;&#xC131; NAC (&#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;)&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xADDC;&#xC81C; &#xC5ED;&#xD560; &#xBC1C;&#xD718; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD655;&#xB960; &#xBC0F; &#xAF2C;&#xC784; &#xD615;&#xC131; BH HC (&#xBE0C;&#xB9AC;&#xC9C0; &#xB098;&#xC120; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xACBD;&#xCCA9;)&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC18;&#xAC10;&#xAE30;&#xB97C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC815; &#xD65C;&#xB3D9; (&#39;superactivity&#39;)&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xC6D0;&#xC778;. &#xC644;&#xC804; atomistic &#xBD84;&#xC790; &#xB3D9;&#xC5ED;&#xD559; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xC591;&#xC774;&#xC628;-&pi; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAD6C;&#xB3D9; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD558; &#xACE0; &#xBAA8;&#xB4E0; prokaryotic &#xC9C4; &#xD575; &#xC885;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC0AC;&#xC774;&#xB4DC; &#xCCB4;&#xC778;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0A9;&#xB2C8;&#xB2E4; BH hc &#xBE44;&#xD2C0;&#xBA74; &#xBCF4;&#xC5EC;.

&#xC591;&#xC774;&#xC628;-&pi; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xC790; &#xD78C;&#xC9C0;&#xC758; &#xBE44;&#xD2C0;&#xBA74; &#xC720;&#xB3C4;.

RNAPs (Polimerasas del RNA) son m&aacute;quinas moleculares complejas que contienen un sitio catal&iacute;tico altamente conservado rodeado de dominios conformationally flexibles. Mutag&eacute;nesis de alto rendimiento en el sistema de modelo de archaeal Methanococcus Methanococcus ha demostrado que las propiedades nanomec&aacute;nicos de uno de estos dominios, el puente-helix, ejercen un papel regulador clave en la tasa de la NAC (ciclo nucle&oacute;tido-adici&oacute;n). Mutaciones que aumentan la probabilidad y/o el per&iacute;odo de formaci&oacute;n de la torcedura en el BH-HC (bisagra del c-terminal del puente-h&eacute;lice) causan un incremento sustancial en la actividad espec&iacute;fica (&#39;superactivity&#39;). Simulaciones de din&aacute;mica molecular completamente atom&iacute;stica muestran que enroscarse de la BH-HC aparece ser conducido por interacciones cati&oacute;n-&pi; e involucrar a las cadenas laterales de amino&aacute;cidos que son excepcionalmente altamente conservadas en todas las especies procariotas y eucariotas.

Interacci&oacute;n cati&oacute;n-&pi; induce enroscarse de una bisagra molecular en el dominio de la puente-h&eacute;lice de ARN polimerasa.

&#x8F6C;&#x5F55;&#xFF0C;&#x4ECE; DNA &#x6A21;&#x677F;&#xFF0C;&#x6A21;&#x677F;&#x5408;&#x6210;&#x7684; RNA &#x662F;&#x7531;&#x591A;&#x80BD;&#x94FE;&#x4E2D;&#x6240;&#x6709;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x6267;&#x884C;&#x7684;&#x3002;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB; (BH) &#x662F;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x94FE; RNAPs &#x7684;&#x4E00;&#x5927;&#x7279;&#x8272;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4F7F;&#x5377;&#x5165;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x52A0;&#x5468;&#x671F;&#x548C; RNA &#x548C; DNA &#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x76F8;&#x5173;&#x79FB;&#x52A8;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x56E0;&#x4E3A; BH &#x5DF2;&#x6355;&#x83B7; RNAP&#xFF0C;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x652F;&#x6301;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E2D;&#x7684;&#x626D;&#x7ED3;&#x548C;&#x76F4;&#x6784;&#x8C61;&#x4E2D;&#x6709;&#x4EBA;&#x63D0;&#x8BAE;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6784;&#x8C61;&#x4E4B;&#x95F4;&#x5FAA;&#x73AF;&#x662F;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x52A0;&#x5468;&#x671F;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7EC4;&#x6210;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x4E3A;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x6CE2;&#x9ED1;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x6027;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x626B;&#x63CF;&#x8BF1;&#x53D8;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; RNAP BH&#xFF0C;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x5176;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7684;&#x8D21;&#x732E;&#x3002;&#x4E0E;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; RNAP &#x539F;&#x5B50;&#x6A21;&#x578B;&#x76F8;&#x7ED3;&#x5408;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE; BH (i) &#x89E6;&#x53D1;&#x5668;&#x5FAA;&#x73AF;&#x3001; (ii) &#x53C9;&#x5FAA;&#x73AF; 2 &#x53CA; (iii) &#x4EA4;&#x6362;&#x673A; 2 &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5728; RNAP &#x529F;&#x80FD;&#x5173;&#x8054;&#x7684; BH &#x53D8;&#x79CD;&#x4E00;&#x4E9B;&#x89E3;&#x91CA;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7F3A;&#x9677;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; RNAP &#x529F;&#x80FD;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x5355;&#x4E2A;&#x7684;&#x4EE5;&#x524D;&#x6CA1;&#x6709;&#x5B66;&#x8FC7;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559; &#xFF08;Lys-781) &#x5728;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x90FD;&#x4E25;&#x683C;&#x5B88;&#x6052;&#x3002;&#x770B;&#x6765;&#x76F4;&#x63A5;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x6240;&#x4F5C;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x5B88;&#x6052;&#x7279;&#x8272;&#x7684; RNAP BH &#x8FF7;&#x5931;&#x5728;&#x67D0;&#x4E9B;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x66FF;&#x4EE3;&#x53D8;&#x4F53;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63A8;&#x65AD;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5C06;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5728; RNAP &#x4FEE;&#x6539; RNAP &#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

&#x6D3B;&#x52A8;&#x56FE;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x3002;

Transcription, the synthesis of RNA from a DNA template, is performed by multisubunit RNA polymerases (RNAPs) in all cellular organisms. The bridge helix (BH) is a distinct feature of all multisubunit RNAPs and makes direct interactions with several active site-associated mobile features implicated in the nucleotide addition cycle and RNA and DNA binding. Because the BH has been captured in both kinked and straight conformations in different crystals structures of RNAP, recently supported by molecular dynamics studies, it has been proposed that cycling between these conformations is an integral part of the nucleotide addition cycle. To further evaluate the role of the BH, we conducted systematic alanine scanning mutagenesis of the Escherichia coli RNAP BH to determine its contributions to activities required for transcription. Combining our data with an atomic model of E. coli RNAP, we suggest that alterations in the interactions between the BH and (i) the trigger loop, (ii) fork loop 2, and (iii) switch 2 can help explain the observed changes in RNAP functionality associated with some of the BH variants. Additionally, we show that extensive defects in E. coli RNAP functionality depend upon a single previously not studied lysine residue (Lys-781) that is strictly conserved in all bacteria. It appears that direct interactions made by the BH with other conserved features of RNAP are lost in some of the E. coli alanine substitution variants, which we infer results in conformational changes in RNAP that modify RNAP functionality.

Activity map of the Escherichia coli RNA polymerase bridge helix.

Transcription, la synth&egrave;se de l&#39;ARN &agrave; partir d&#39;un mod&egrave;le de l&#39;ADN, est effectu&eacute;e par des sous-unit&eacute;s ARN polym&eacute;rases (RNAPs) dans tous les organismes cellulaires. L&#39;h&eacute;lice du pont (BH) est une caract&eacute;ristique particuli&egrave;re de tous les RNAPs de sous-unit&eacute;s et rend les interactions directes avec plusieurs fonctionnalit&eacute;s mobiles associ&eacute;s au site actif impliqu&eacute;es dans le cycle des nucl&eacute;otides ajout et la liaison ARN et l&#39;ADN. Parce que la BH a &eacute;t&eacute; captur&eacute;e dans les conformations fois pli&eacute;es et droites dans les structures de diff&eacute;rents cristaux de RNAP, r&eacute;cemment appuy&eacute;es par des &eacute;tudes de dynamique mol&eacute;culaire, il a &eacute;t&eacute; propos&eacute; que le cyclisme entre ces conformations fait partie int&eacute;grante du cycle addition de nucl&eacute;otides. Pour continuer &agrave; &eacute;valuer le r&ocirc;le de la BH, nous avons proc&eacute;d&eacute; syst&eacute;matique alanine num&eacute;risation mutag&eacute;n&egrave;se de l&#39;Escherichia coli RNAP BH pour d&eacute;terminer ses contributions aux activit&eacute;s n&eacute;cessaires pour la transcription. En combinant nos donn&eacute;es avec un mod&egrave;le d&#39;atome d&#39;e. coli RNAP, nous sugg&eacute;rons que des alt&eacute;rations dans les interactions entre la BH et (i) la boucle de d&eacute;clencheur, boucle de fourche (ii) 2 et (iii) l&#39;interrupteur 2 peuvent aider &agrave; expliquer les changements observ&eacute;s dans la fonctionnalit&eacute; RNAP associ&eacute;e &agrave; quelques-uns des variantes BH. En outre, nous montrons que vaste d&eacute;fauts dans la fonctionnalit&eacute; d&#39;e. coli RNAP d&eacute;pendent d&#39;un seul r&eacute;sidu lysine pas &eacute;tudi&eacute;s pr&eacute;c&eacute;demment (Lys-781) qui est strictement conserv&eacute; chez toutes les bact&eacute;ries. Il semble que les interactions directes faites par la BH avec d&#39;autres fonctionnalit&eacute;s conserv&eacute;es de RNAP disparaissent dans certaines de ces variantes de substitution alanine d&#39;e. coli, qui nous en d&eacute;duisons se traduit par des changements conformationnels dans RNAP qui modifient la fonctionnalit&eacute; RNAP.

Carte de l&#39;activit&eacute; de l&#39;h&eacute;lice de pont de l&#39;ARN polym&eacute;rase Escherichia coli.

Transkription, die Synthese von RNA anhand einer DNA-Vorlage erfolgt durch exprimierten RNA-Polymerasen (RNAPs) in allen zellul&auml;ren Organismen. Die Br&uuml;cke-Helix (BH) ist ein deutliches Merkmal aller exprimierten RNAPs und direkte Interaktionen mit mehreren aktiven Site-assoziierte Mobilfunktionen die Nukleotid-Zusatz-Zyklus und die RNA und DNA-Bindung in Verbindung gebracht. Da sowohl gerade als auch geknickten Konformationen in verschiedenen Kristallen Strukturen der Name, die vor kurzem von Molekulardynamik-Studien, unterst&uuml;tzt die BH erobert hat wurde vorgeschlagen, dass Radfahren zwischen diesen Konformationen integraler Bestandteil der Nukleotid-Zusatz-Zyklus ist. Um die Rolle der den BH weiter zu bewerten, f&uuml;hrten wir systematische Alanin Scannen Mutagenese der Escherichia coli Name BH seine Beitr&auml;ge zu Aktivit&auml;ten, die f&uuml;r die Transkription zu bestimmen. Kombinieren unsere Daten mit einem Atommodell von E. Coli Name, empfehlen wir, dass Ver&auml;nderungen in die Interaktionen zwischen den BH i die Trigger-Schleife, II Gabel Schleife 2 und (Iii)-Switch 2 die beobachteten Ver&auml;nderungen in einige der BH Varianten zugeordnete Name-Funktionalit&auml;t zu erkl&auml;ren k&ouml;nnen. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass umfangreiche M&auml;ngel in E. coli Name Funktionalit&auml;t von einzelnen zuvor nicht studiert Lysin R&uuml;ckst&auml;nde (Lys-781) abh&auml;ngen, die streng in alle Bakterien konserviert wird. Es scheint, dass in einigen der E. Coli-Alanin-Ersatz-Varianten, direkte Interaktionen seitens der BH mit anderen konservierten Funktionen der Name verloren gehen wir schlie&szlig;en, wodurch Konformationsver&auml;nderungen in Name, der Name Funktionalit&auml;t zu &auml;ndern.

Aktivit&auml;ten-Zuordnung der Escherichia coli RNS-Polymerase Br&uuml;cke Helix.

Trascrizione, la sintesi di RNA da un modello di DNA, &egrave; eseguita da questa malattia polimerasi del RNA (RNAPs) in tutti gli organismi cellulari. Elica del ponte (BH) &egrave; una caratteristica distintiva di tutti i RNAPs di questa malattia e rende le interazioni dirette con diverse funzionalit&agrave; mobile associato al sito attivo implicato nel ciclo di aggiunta di nucleotidi e RNA e DNA binding. Perch&eacute; il BH &egrave; stato catturato in conformazioni attorcigliati e dritti in strutture di diversi cristalli di RNAP, recentemente sostenuta da studi di dinamica molecolare, &egrave; stato proposto che la bici tra queste conformazioni &egrave; parte integrante del ciclo di aggiunta del nucleotide. Per valutare ulteriormente il ruolo di BH, abbiamo condotto alanina sistematica scansione mutagenesi di Escherichia coli RNAP BH per determinare i suoi contributi alle attivit&agrave; necessarie per la trascrizione. Combinando i nostri dati con un modello atomico di e. coli RNAP, suggeriamo che alterazioni nelle interazioni tra BH e (i) il grilletto, (ii) forcella ciclo 2 e (iii) interruttore 2 possono aiutare a spiegare i cambiamenti osservati nella funzionalit&agrave; RNAP associati con alcune delle varianti di BH. Inoltre, mostriamo che vasti difetti di funzionalit&agrave; di E. coli RNAP dipendono da un singolo residuo di lisina in precedenza non ha studiato (Lys-781) che &egrave; rigorosamente conservato in tutti i batteri. Sembra che interazioni dirette da BH con altre caratteristiche conservate di RNAP sono perso in alcune varianti della sostituzione di alanina e. coli, che noi dedurre si traduce in cambiamenti conformazionali in RNAP che modificano la funzionalit&agrave; RNAP.

Mappa di attivit&agrave; dell&#39;elica di ponte RNA polimerasi di Escherichia coli.

&#x8EE2;&#x5199; RNA &#x306E;&#x5408;&#x6210; DNA &#x306E;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; multisubunit RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (RNAPs) &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9F;&#x884C;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30B8; &#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; (BH) &#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E; multisubunit RNAPs &#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x6DFB;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x3068; RNA &#x3068; DNA &#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x95A2;&#x9023;&#x306E;&#x30E2;&#x30D0;&#x30A4;&#x30EB;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3068;&#x76F4;&#x63A5;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;BH &#x306F;&#x6700;&#x8FD1;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x652F;&#x6301; RNAP &#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x5C48;&#x6298;&#x3068;&#x76F4;&#x7DDA;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x9593;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x6DFB;&#x52A0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306A;&#x90E8;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;.&#x3055;&#x3089;&#x306B; BH &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; RNAP &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3078;&#x306E;&#x8CA2;&#x732E;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B; BH &#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x3092;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3092;&#x5B9F;&#x65BD;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; RNAP &#x306E;&#x539F;&#x5B50;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3068;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3001;BH &#x3068; (i)&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x30FC;&#x306E;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x3001;(ii) &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF; &#x30EB;&#x30FC;&#x30D7; 2&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; (iii) &#x30B9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1; 2 &#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x304C;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B; BH &#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B; RNAP &#x6A5F;&#x80FD;&#x3067;&#x52A9;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x3067;&#x53B3;&#x5BC6;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5358;&#x4E00;&#x4EE5;&#x524D;&#x306A;&#x3044;&#x5B66;&#x3073;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x6B8B; (Lys-781) &#x4F9D;&#x5B58;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; RNAP &#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5E83;&#x7BC4;&#x306A;&#x6B20;&#x9665;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F; BH RNAP &#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4F5C;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x306A;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304C;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x7F6E;&#x63DB;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x3092;&#x5931;&#x308F;&#x308C;&#x308B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059; RNAP &#x6A5F;&#x80FD;&#x5909;&#x66F4;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3067; RNAP &#x3067;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x3092;&#x63A8;&#x6E2C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC; RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6A4B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3; &#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3002;

&#xC804;&#xC0AC;, DNA &#xD15C;&#xD50C;&#xB81B;&#xC5D0;&#xC11C; RNA&#xC758; &#xD569;&#xC131;&#xC740; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; multisubunit RNA &#xD3F4; (RNAPs)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC218;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xB9AC; &#xD5EC;&#xB9AD;&#xC2A4; (BH) &#xBAA8;&#xB4E0; multisubunit Rnaps&#xC758; &#xACE0;&#xC720;&#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD65C;&#xC131; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074; &#xBC0F; RNA &#xBC0F; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC5F0;&#xB8E8;&#xC640; &#xC9C1;&#xC811; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558; &#xAC8C;. BH kinked &#xBC0F; &#xC9C1;&#xC120; conformations RNAP, &#xCD5C;&#xADFC; &#xBD84;&#xC790; &#xC5ED;&#xD559; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCCB4;&#xD3EC; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; conformations &#xC0AC;&#xC774; &#xC790;&#xC804;&#xAC70; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xCD94;&#xAC00; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC758; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xBD80;&#xBD84;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xB354; BH&#xC758; &#xC5ED;&#xD560; &#xD3C9;&#xAC00;, &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC804;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC5D0;&#xB294; &#xAE30;&#xC5EC;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; RNAP BH mutagenesis &#xAC80;&#xC0AC; &#xC2E4;&#xC2DC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; RNAP&#xC758; &#xC6D0;&#xC790; &#xBAA8;&#xB378;, BH (i) &#xD2B8;&#xB9AC;&#xAC70; &#xB8E8;&#xD504;, &#xB8E8;&#xD504; (2) &#xD3EC;&#xD06C; 2, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; (iii) &#xC2A4;&#xC704;&#xCE58; 2 &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBCC0;&#xACBD; BH &#xBCC0;&#xC885; &#xC911; &#xC77C;&#xBD80;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; RNAP &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC874; &#xC5C4;&#xACA9; &#xD558; &#xAC8C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xD558;&#xC9C0; &#xACF5;&#xBD80; lysine &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; (&#xB9AC;&#xC2A4;-781) &#xC758;&#xC874; E. &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; RNAP &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xACB0;&#xD568; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C1;&#xC811; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; RNAP&#xC758; &#xBCF4;&#xC874; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB2E4;&#xB978; BH&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xB300;&#xCCB4; &#xBCC0;&#xC885;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80; &#xC190;&#xC2E4; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0A9;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC720;&#xCD94; &#xD558;&#xB294; RNAP &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC218;&#xC815; &#xD558;&#xB294; RNAP&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC;.

&#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; RNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB2E4;&#xB9AC; &#xB098;&#xC120; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC9C0;&#xB3C4;.

Transcripci&oacute;n, la s&iacute;ntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN, se realiza por m&uacute;ltiples subunidades Polimerasas del RNA (RNAPs) en todos los organismos celulares. La h&eacute;lice del puente (BH) es una caracter&iacute;stica distintiva de todos los RNAPs m&uacute;ltiples subunidades e interacciones directas con varias caracter&iacute;sticas m&oacute;viles de sitio activo-asociados implicados en el ciclo de la adici&oacute;n de nucle&oacute;tidos y la Uni&oacute;n de ARN y ADN. Porque la BH ha quedado plasmada en conformaciones tanto torcidos y rectas en estructuras diferentes cristales de descubrimiento, recientemente apoyada por estudios de din&aacute;mica molecular, se ha propuesto que el ciclismo entre estas conformaciones es parte integral del ciclo de la adici&oacute;n de nucle&oacute;tidos. Para evaluar el papel de la BH, realizamos alanina sistem&aacute;tica exploraci&oacute;n mutag&eacute;nesis de la Escherichia coli RNAP BH para determinar su contribuci&oacute;n a las actividades requeridas para la transcripci&oacute;n. Combinando nuestros datos con un modelo at&oacute;mico de e. coli ARNP, sugerimos que alteraciones en las interacciones entre BH y (i) el lazo de gatillo, (ii) horquilla lazo 2 y (iii) interruptor 2 pueden ayudar a explicar los cambios observados en la funcionalidad de la RNAP asociado con algunas de las variantes de BH. Adem&aacute;s, mostramos que defectos extensos en la funcionalidad de E. coli RNAP dependen de un solo residuo previamente no estudiados de la lisina (Lys-781) que estrictamente se conserva en todas las bacterias. Parece que interacciones directas de BH con otras caracter&iacute;sticas conservadas del descubrimiento se pierden en algunas de las variantes de sustituci&oacute;n de alanina de e. coli, que inferimos da lugar a cambios conformacionales en RNAP que modifican la funcionalidad de descubrimiento.

Mapa de la actividad de la h&eacute;lice de puente de Escherichia coli ARN polimerasa.

TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#x523A;&#x6FC0;&#x53E4; RNAP &#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5B9A;&#x6027;&#x7684; super-stimulating &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x8303;&#x56F4;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x5B9A;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8D77;&#x59CB;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x6B65;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x89E3;&#x91CA;&#x7ED3;&#x6784;&#x8C03;&#x67E5;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684; RNAP TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x63A5;&#x53E3;&#x94FA;&#x5E73;&#x3002;

&#x63ED;&#x793A; TFIIB &#x7684;&#x804C;&#x80FD;&#x3002;

The TFIIB linker domain stimulates the catalytic activity of archaeal RNAP. By characterising a range of super-stimulating mutants we identified a novel rate-limiting step in transcription initiation. Our results help to interpret structural findings and pave the way towards higher-resolution structures of the RNAP-TFIIB linker interface.

Revealing the functions of TFIIB.

Le domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens TFIIB stimule l&#39;activit&eacute; catalytique d&#39;archaeal RNAP. En caract&eacute;risant une s&eacute;rie de mutants super-stimulating, nous avons identifi&eacute; une nouvelle &eacute;tape limitante dans l&#39;initiation de la transcription. Nos r&eacute;sultats aident &agrave; interpr&eacute;ter les conclusions structurales et ouvrir la voie &agrave; une r&eacute;solution sup&eacute;rieure des structures de l&#39;interface de l&#39;&eacute;diteur de liens RNAP-TFIIB.

R&eacute;v&eacute;lant les fonctions de TFIIB.

Die TFIIB-Linker-Dom&auml;ne stimuliert die katalytische Aktivit&auml;t der reitenden Name. Durch die Charakterisierung verschiedener super-stimulating Mutanten haben wir einen neuartigen geschwindigkeitsbestimmende Schritt in Transkription Einleitung identifiziert. Unsere Ergebnisse helfen, strukturelle Befunde zu interpretieren und ebnen den Weg in Richtung h&ouml;herer Aufl&ouml;sung Strukturen der Name-TFIIB Linker Schnittstelle.

Die Funktionen der TFIIB aufschlussreich.

Il dominio linker TFIIB stimola l&#39;attivit&agrave; catalitica di archaeal RNAP. Da che caratterizzano una gamma di mutanti super-stimulating abbiamo individuato un romanzo passo di limitazione della velocit&agrave; nell&#39;iniziazione della trascrizione. I nostri risultati aiutano a interpretare i risultati strutturali e spianare la strada verso strutture ad alta risoluzione dell&#39;interfaccia del linker RNAP-TFIIB.

Rivelando le funzioni di TFIIB.

TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; &#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30A2; RNAP &#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Super-stimulating &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3065;&#x3051;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5236;&#x9650;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x69CB;&#x9020;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x89E3;&#x91C8;&#x3057;&#x3001;RNAP TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x306E;&#x9053;&#x3092;&#x958B;&#x304F;&#x306B;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3061;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

TFIIB &#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; archaeal RNAP&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC790;&#xADF9;. Super-stimulating &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xBC94;&#xC704; characterising &#xC5EC; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC18C;&#xC124; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xD30C;&#xC545;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xAD6C;&#xC870; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xD574;&#xC11D; &#xBC0F; RNAP-TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC758; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD5A5;&#xD574; &#xAE38;&#xC744; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774;.

TFIIB&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El dominio de vinculador TFIIB estimula la actividad catal&iacute;tica de archaeal RNAP. Por la caracterizaci&oacute;n de una serie de mutantes Super-estimular identificamos un novela paso de limitaci&oacute;n de velocidad en la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. Nuestros resultados ayudan a interpretar los hallazgos estructurales y allanar el camino hacia estructuras de mayor resoluci&oacute;n de la interfaz de vinculador ARNP-TFIIB.

Revelando las funciones de TFIIB.

&#x4F53;&#x5916;&#x88C5;&#x914D;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x751F;&#x4EA7;&#x91CD;&#x7EC4;&#x53E4;&#x83CC; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x7684;&#x53EF;&#x7528;&#x6027;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x6700;&#x6709;&#x529B;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5DE5;&#x5177;&#x8C03;&#x67E5; RNAP &#x51FD;&#x6570;&#x7684;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x4ECD;&#x7136;&#x76F8;&#x5BF9;&#x5F88;&#x5DEE;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236;&#x4E4B;&#x4E00;&#x3002;&#x8FC7;&#x53BB;&#x51E0;&#x5E74;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x521B;&#x4E86;&#x65B0;&#x7684;&#x57FA;&#x4E8E;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x8BF1;&#x53D8;&#x529E;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x56F4;&#x7ED5;&#x50AC;&#x5316;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x7684;&#x5404;&#x79CD;&#x57DF;&#x5185;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;/&#x529F;&#x80FD;&#x5173;&#x7CFB;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x57DF;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5728;&#x4F17;&#x591A;&#x7684; x &#x5C04;&#x7EBF;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x4E3A; 35-&#x6C28;&#x57FA;-&#x9178;-&#x957F;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5;&#x87BA;&#x65CB;&#xFF0C;&#x5728;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E24;&#x4E2A;&#x79BB;&#x6563;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x94F0;&#x94FE;&#x7684;&#x7EBD;&#x7ED3;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x534F;&#x8C03;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5176;&#x4ED6;&#x57DF;&#x7684;&#x534F;&#x540C;&#x7684;&#x884C;&#x52A8;&#x3002;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F71;&#x54CD;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7EBD;&#x673A;&#x5236;&#x4EA7;&#x751F;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684; RNAP &#x548C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5728;&#x67D0;&#x4E9B;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#x6BD4;&#x5B83;&#x4E24;&#x500D;&#x591A;&#x3002;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6A21;&#x62DF;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x4E86;&#x81EA;&#x5DF1;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x63D0;&#x4F9B;&#x65B0;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x548C;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x6765;&#x89E3;&#x91CA;&#x57FA;&#x7840;&#x7ED3;&#x6784;&#x52A8;&#x4F5C;&#x683C;&#x5916;&#x6709;&#x7528;&#x3002;

&#x6865;&#x87BA;&#x65CB;&#x7684; RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E2D;&#x592E;&#x529B;&#x5B66;&#x603B;&#x673A;&#x4E3A;&#x534F;&#x8C03;&#x50AC;&#x5316;&#x548C;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x8FD0;&#x52A8;&#x3002;

The availability of in vitro assembly systems to produce recombinant archaeal RNA polymerases (RNAPs) offers one of the most powerful experimental tools for investigating the still relatively poorly understood molecular mechanisms underlying RNAP function. Over the last few years, we pioneered new robot-based high-throughput mutagenesis approaches to study structure/function relationships within various domains surrounding the catalytic center. The Bridge Helix domain, which appears in numerous X-ray structures as a 35-amino-acid-long alpha helix, coordinates the concerted movement of several other domains during catalysis through kinking of two discrete molecular hinges. Mutations affecting these kinking mechanisms have a direct effect on the specific catalytic activity of RNAP and can in some instances more than double it. Molecular dynamics simulations have established themselves as exceptionally useful for providing additional insights and detailed models to explain the underlying structural motions.

The Bridge Helix of RNA polymerase acts as a central nanomechanical switchboard for coordinating catalysis and substrate movement.

La disponibilit&eacute; des syst&egrave;mes d&#39;assemblage in vitro pour produire des recombinants archaeal RNA polym&eacute;rases (RNAPs) offre l&#39;un des plus puissants outils exp&eacute;rimentales pour &eacute;tudier les m&eacute;canismes mol&eacute;culaires encore relativement mal comprises fonction RNAP. Au cours de ces derni&egrave;res ann&eacute;es, nous a lanc&eacute; de nouvelles approches ax&eacute;es sur le robot de mutagen&egrave;se haut d&eacute;bit afin d&#39;&eacute;tudier les relations structure/fonction dans divers domaines qui entourent le centre catalytique. Le domaine de pont Helix, qui appara&icirc;t dans nombreuses structures de rayons x comme une spirale d&#39;alpha-amino-acide-long de 35, coordonne le mouvement concert&eacute; de plusieurs autres domaines au cours de la catalyse par coudure de deux charni&egrave;res mol&eacute;culaires discrets. Mutations affectant ces m&eacute;canismes de d&eacute;formation ont un effet direct sur l&#39;activit&eacute; catalytique sp&eacute;cifique de RNAP et peuvent dans certains cas plus que double. Simulations de dynamique mol&eacute;culaire sont reconnus comme particuli&egrave;rement utile pour fournir des renseignements suppl&eacute;mentaires et des mod&egrave;les d&eacute;taill&eacute;s pour expliquer les mouvements structurels sous-jacents.

L&#39;Helix pont de l&#39;ARN polym&eacute;rase agit comme un standard de nanom&eacute;canique central pour coordonner le mouvement de catalyse et de substrat.

Article	Year
A recombinant RNA polymerase II-like enzyme capable of promoter-specific transcription. Molecular cell\| PubMed ID: 12408830	2002
A fully recombinant system for activator-dependent archaeal transcription. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 15485836	2004
Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology\| PubMed ID: 16135821	2005
Modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factor TFB/TFIIB. Biochemical Society symposium\| PubMed ID: 16626286	2006
The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic acids research\| PubMed ID: 18025041	2008
Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. Journal of biology\| PubMed ID: 19055851	2008
Nanomechanical constraints acting on the catalytic site of cellular RNA polymerases. Biochemical Society transactions\| PubMed ID: 20298196	2010
The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic acids research\| PubMed ID: 20851833	2011
The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC biology\| PubMed ID: 21034443	2010
Cation-Ï€ interactions induce kinking of a molecular hinge in the RNA polymerase bridge-helix domain. Biochemical Society transactions\| PubMed ID: 21265743	2011
Activity map of the Escherichia coli RNA polymerase bridge helix. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 21357417	2011
Revealing the functions of TFIIB. Transcription\| PubMed ID: 22223047	2011
The Bridge Helix of RNA polymerase acts as a central nanomechanical switchboard for coordinating catalysis and substrate movement. Archaea (Vancouver, B.C.)\| PubMed ID: 22312317	2011

Robert O.J. Weinzierl

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