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A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Emory University School of Medicine and Children's Health Care of Atlanta

We developed a general method, microarray-based genomic selection (MGS), capable of selecting and enriching targeted sequences from complex eukaryotic genomes without the repeat blocking steps necessary for bacterial artificial chromosome (BAC)-based genomic selection. We demonstrate that large human genomic regions, on the order of hundreds of kilobases, can be enriched and resequenced with resequencing arrays. MGS, when combined with a next-generation resequencing technology, can enable large-scale resequencing in single-investigator laboratories.

Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing.

Nous avons d&eacute;velopp&eacute; une m&eacute;thode g&eacute;n&eacute;rale, ax&eacute;e sur les biopuces g&eacute;nomique s&eacute;lection (MGS), capable de s&eacute;lectionner et d&#39;enrichir cibl&eacute;es de s&eacute;quences de g&eacute;nomes eucaryotes complexes sans la r&eacute;p&eacute;tition bloquant les &eacute;tapes n&eacute;cessaires pour les chromosomes artificiels bact&eacute;riens (BAC)-fonction s&eacute;lection g&eacute;nomique. Nous d&eacute;montrons que grandes r&eacute;gions g&eacute;nomiques humaines, l&#39;ordre de centaines de kilobases, peuvent &ecirc;tre enrichies et res&eacute;quenc&eacute;es avec renum&eacute;rotation des tableaux. MGS, lorsqu&#39;il est combin&eacute; avec une technologie de nouvelle g&eacute;n&eacute;ration resequencing, pouvez activer res&eacute;quen&ccedil;age &agrave; grande &eacute;chelle dans les laboratoires de single-enqu&ecirc;teur.

S&eacute;lection g&eacute;nomique bas&eacute;e sur micror&eacute;seau pour haut d&eacute;bit res&eacute;quen&ccedil;age.

Abbiamo sviluppato un metodo generale, basata su microarray genomico selezione (MGS), in grado di selezionare e arricchente sequenze mirate da genomi eucarioti complessi senza la ripetizione bloccando i passi necessari per cromosomi artificiali batterici (BAC)-base di selezione genomica. Dimostriamo che grandi regioni genomic umani, dell&#39;ordine di centinaia di kilobasi, possono essere arricchiti e resequenced con risequenziazione matrici. MGS, quando combinato con una tecnologia di prossima generazione resequencing, pu&ograve; abilitare la risequenziazione su larga scala nei laboratori di singolo-investigatore.

Selezione basata su microarray genomica per risequenziazione di alto-rendimento.

Applying rapid genome sequencing technologies to characterize pathogen genomes.

Application de technologies de s&eacute;quen&ccedil;age de g&eacute;nome rapide afin de caract&eacute;riser les g&eacute;nomes de l&#39;agent pathog&egrave;ne.

Applicazione di tecnologie di sequenziamento del genoma rapido per caratterizzare i genomi di agente patogeno.

Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD and BMD) are X-linked recessive neuromuscular disorders caused by mutations in the dystrophin gene affecting approximately 1 in 3,500 males. The human dystrophin gene spans>2,200 kb, or roughly 0.1% of the genome, and is composed of 79 exons. The mutational spectrum of disease-causing alleles, including exonic copy number variations (CNVs), is complex. Deletions account for approximately 65% of DMD mutations and 85% of BMD mutations. Duplications occur in approximately 6 to 10% of males with either DMD or BMD. The remaining 30 to 35% of mutations consist of small deletions, insertions, point mutations, or splicing mutations, most of which introduce a premature stop codon. Laboratory analysis of dystrophin can be used to confirm a clinical diagnosis of DMD, characterize the type of dystrophin mutation, and perform prenatal testing and carrier testing for females. Current dystrophin diagnostic assays involve a variety of methodologies, including multiplex PCR, Southern blot analysis, multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), detection of virtually all mutations-SSCP (DOVAM-S), and single condition amplification/internal primer sequencing (SCAIP); however, these methods are time-consuming, laborious, and do not accurately detect duplication mutations in the dystrophin gene. Furthermore, carrier testing in females is often difficult when a related affected male is unavailable. Here we describe the development, design, validation, and implementation of a high-resolution comparative genomic hybridization (CGH) microarray-based approach capable of accurately detecting both deletions and duplications in the dystrophin gene. This assay can be readily adopted by clinical molecular testing laboratories and represents a rapid, cost-effective approach for screening a large gene, such as dystrophin.

Microarray-based mutation detection in the dystrophin gene.

Duchenne et Becker dystrophies musculaires (DMD et BMD) sont li&eacute;es &agrave; le X r&eacute;cessifs troubles neuromusculaires caus&eacute;es par des mutations dans le g&egrave;ne de la dystrophine affectant environ 1 &agrave; 3 500 hommes. Le g&egrave;ne de la dystrophine humaine s&#39;&eacute;tend sur &gt; 2 200 Ko, soit environ 0,1 % du g&eacute;nome et se compose de 79 exons. Le spectre mutationnel de pathog&egrave;nes all&egrave;les, dont nombre de copie silenceur (CNV), sont complexes. Destructions repr&eacute;sentent environ 65 % de mutations de DMD et 85 % de mutations de BMD. Duplications se produisent dans environ 6 &agrave; 10 % des m&acirc;les avec DMD ou BMD. Les 30 &agrave; 35 % restants des mutations se composent de petites destructions, les insertions, les mutations ponctuelles, ou mutations d&#39;&eacute;pissage, dont la plupart introduire un codon stop pr&eacute;matur&eacute;. Analyse en laboratoire de la dystrophine peut servir &agrave; confirmer un diagnostic clinique de DMD, caract&eacute;riser le type de mutation de la dystrophine et effectuer les tests pr&eacute;nataux et support stable pour les femmes. Les tests de diagnostic actuellement de dystrophine impliquent une vari&eacute;t&eacute; de m&eacute;thodologies multiplex PCR, analyse Southern, amplification multiplex ligation-d&eacute;pendante sonde (MLPA), d&eacute;tecter pratiquement toutes les mutations-SSCP (DOVAM-S) et le s&eacute;quen&ccedil;age de l&#39;appr&ecirc;t int&eacute;rieur/amplification seule condition (SCAIP) ; Cependant, ces m&eacute;thodes sont fastidieux, laborieux et ne d&eacute;tectent pas avec pr&eacute;cision des mutations de duplication du g&egrave;ne de la dystrophine. En outre, transporteur stable chez les femmes est souvent difficile quand un m&acirc;le touch&eacute; connexe n&#39;est pas disponible. Nous d&eacute;crivons ici le d&eacute;veloppement, la conception, la validation et la mise en &oelig;uvre d&#39;une approche ax&eacute;e sur les puces haute r&eacute;solution hybridation g&eacute;nomique comparative (CGH) capable de d&eacute;tecter avec pr&eacute;cision les suppressions et les chevauchements dans le g&egrave;ne de la dystrophine. Ce dosage peut &ecirc;tre facilement adopt&eacute; par cliniques laboratoires mol&eacute;culaires et repr&eacute;sente une approche rapide et rentable pour le d&eacute;pistage d&#39;un g&egrave;ne important, tels que de la dystrophine.

D&eacute;tection de puces mutations dans le g&egrave;ne de la dystrophine.

Le distrofie muscolari di Duchenne e Becker (DMD e DMB) sono malattie neuromuscolari recessive legata al X causate da mutazioni nel gene della distrofina che colpisce circa 1 in 3.500 maschi. Il gene della distrofina umana abbraccia &amp;gt; 2.200 kb, o circa il 0,1% del genoma ed &egrave; composto da 79 esoni. Lo spettro mutazionale di malattia-causanti alleli, comprese le variazioni del numeri di copie esonico (CNV), sono complessi. Eliminazioni rappresentano circa il 65% delle mutazioni DMD e l&#39;85% delle mutazioni di BMD. Duplicazioni si verificano in circa 6-10% dei maschi con DMD o BMD. Il restante 30-35% delle mutazioni sono costituiti da piccole delezioni, inserzioni, mutazioni puntiformi, o mutazioni di splicing, la maggior parte dei quali introdurre un codone di stop prematuro. Analisi di laboratorio della distrofina possono essere utilizzato per confermare una diagnosi clinica di DMD, caratterizzano il tipo di mutazione di distrofina ed eseguire la diagnosi prenatale e vettore di prova per le femmine. Corrente distrofina analisi diagnostiche comportano una variet&agrave; di metodologie, tra cui analisi Southern blot, PCR multiplex, amplificazione multiplex legatura-dipendente sonda (MLPA), rilevamento di praticamente tutte le mutazioni-SSCP (DOVAM-S) e le sequenze di primer interno/amplificazione unica condizione (SCAIP); Tuttavia, questi metodi sono lunghe, laboriose e non rilevare accuratamente le mutazioni di duplicazione del gene della distrofina. Inoltre, carrier test nelle femmine &egrave; spesso difficile, quando non &egrave; disponibile un maschio interessato correlato. Qui descriviamo lo sviluppo, progettazione, validazione e attuazione di un approccio basato su microarray ad alta risoluzione ibridazione genomic comparativa (CGH) in grado di rilevare con precisione sia delezioni e duplicazioni del gene della distrofina. Questo dosaggio pu&ograve; essere facilmente adottato dai laboratori di test molecolare cliniche e rappresenta un approccio rapido e conveniente per lo screening un grande gene, come la distrofina.

Rilevazione basata su microarray mutazione nel gene della distrofina.

Although gene expression has been studied in bacteria for decades, many aspects of the bacterial transcriptome remain poorly understood. Transcript structure, operon linkages, and information on absolute abundance all provide valuable insights into gene function and regulation, but none has ever been determined on a genome-wide scale for any bacterium. Indeed, these aspects of the prokaryotic transcriptome have been explored on a large scale in only a few instances, and consequently little is known about the absolute composition of the mRNA population within a bacterial cell. Here we report the use of a high-throughput sequencing-based approach in assembling the first comprehensive, single-nucleotide resolution view of a bacterial transcriptome. We sampled the Bacillus anthracis transcriptome under a variety of growth conditions and showed that the data provide an accurate and high-resolution map of transcript start sites and operon structure throughout the genome. Further, the sequence data identified previously nonannotated regions with significant transcriptional activity and enhanced the accuracy of existing genome annotations. Finally, our data provide estimates of absolute transcript abundance and suggest that there is significant transcriptional heterogeneity within a clonal, synchronized bacterial population. Overall, our results offer an unprecedented view of gene expression and regulation in a bacterial cell.

Structure and complexity of a bacterial transcriptome.

Bien que l&#39;expression des g&egrave;nes a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;e chez les bact&eacute;ries pendant des d&eacute;cennies, beaucoup d&#39;aspects de la transcriptome bact&eacute;rien reste mal compris. Structure de transcription, les liens de l&#39;op&eacute;ron et informations sur abondance absolue toutes les donnent un aper&ccedil;u pr&eacute;cieux de la fonction du g&egrave;ne et de la r&eacute;glementation, mais aucun n&#39;a jamais d&eacute;termin&eacute; sur une &eacute;chelle de g&eacute;nome d&#39;une bact&eacute;rie. En effet, ces aspects de la transcriptome procaryote ont &eacute;t&eacute; explor&eacute;es &agrave; grande &eacute;chelle dans quelques cas seulement, et par cons&eacute;quent, on conna&icirc;t la composition absolue de la population de l&#39;ARNm au sein d&#39;une cellule bact&eacute;rienne. Nous rapportons ici l&#39;utilisation d&#39;une approche ax&eacute;e sur le s&eacute;quen&ccedil;age de haut-d&eacute;bit dans l&#39;assemblage de la premi&egrave;re vue de la r&eacute;solution globale, single-nucleotide d&#39;un transcriptome bact&eacute;rienne. Nous avons &eacute;chantillonn&eacute; le Bacillus anthracis transcriptome sous diff&eacute;rentes conditions de croissance et ont montr&eacute; que les donn&eacute;es fournissent une carte pr&eacute;cise et &agrave; haute r&eacute;solution des sites de d&eacute;but de transcription et de la structure de l&#39;op&eacute;ron dans tout le g&eacute;nome. En outre, les donn&eacute;es de s&eacute;quence identifi&eacute; des r&eacute;gions pr&eacute;c&eacute;demment nonannotated avec importante activit&eacute; transcriptionnelle et am&eacute;lior&eacute; l&#39;exactitude des annotations existantes de g&eacute;nome. Enfin, nos donn&eacute;es fournissent des estimations de l&#39;abondance absolue de transcription et sugg&egrave;rent qu&#39;il y a une h&eacute;t&eacute;rog&eacute;n&eacute;it&eacute; significative transcriptionnelle au sein d&#39;une population bact&eacute;rienne clonale et synchronis&eacute;e. Dans l&#39;ensemble, nos r&eacute;sultats offrent une vue sans pr&eacute;c&eacute;dent de l&#39;expression des g&egrave;nes et de r&eacute;gulation dans une cellule bact&eacute;rienne.

Structure et complexit&eacute; d&#39;un transcriptome bact&eacute;rienne.

Anche se l&#39;espressione del gene &egrave; stata studiata in batteri per decenni, molti aspetti del transcriptome batterico restano scarsamente comprensibili. Struttura di trascrizione, collegamenti operone e informazioni su abbondanza assoluta tutti forniscono preziose intuizioni in funzione del gene e regolazione, ma nessuno &egrave; mai stato determinato su una scala genome-wide per qualsiasi batterio. Infatti, questi aspetti del transcriptome procariotico sono stati esplorati su larga scala in solo pochi casi, e di conseguenza poco si sa circa la composizione assoluta della popolazione mRNA all&#39;interno di una cellula batterica. Qui riportiamo l&#39;uso di un approccio basato su sequenziamento high-throughput nell&#39;assemblare la prima vista risoluzione completa, singolo nucleotide di un transcriptome batterica. Abbiamo campionata del Bacillus anthracis transcriptome sotto una variet&agrave; di condizioni di crescita e ha mostrato che i dati forniscono una mappa accurata e ad alta risoluzione dell&#39;operone struttura in tutto il genoma e siti di inizio trascrizione. Ulteriormente, i dati di sequenza identificate in precedenza nonannotated regioni con significativa attivit&agrave; transcriptional e migliorato l&#39;esattezza delle annotazioni del genoma esistenti. Infine, i nostri dati forniscono stime di abbondanza assoluta trascrizione e suggeriscono che ci &egrave; significativo transcriptional eterogeneit&agrave; all&#39;interno di una popolazione batterica clonale, sincronizzata. Nel complesso, i nostri risultati offrono una visione senza precedenti di espressione del gene e regolazione in una cellula batterica.

Struttura e la complessit&agrave; di un transcriptome batterica.

Novel methods of targeted sequencing of unique regions from complex eukaryotic genomes have generated a great deal of excitement, but critical demonstrations of these methods efficacy with respect to diploid genotype calling and experimental variation are lacking. To address this issue, we optimized microarray-based genomic selection (MGS) for use with the Illumina Genome Analyzer (IGA). A set of 202 fragments (304 kb total) contained within a 1.7 Mb genomic region on human chromosome X were MGS/IGA sequenced in ten female HapMap samples generating a total of 2.4 GB of DNA sequence. At a minimum coverage threshold of 5X, 93.9% of all bases and 94.9% of segregating sites were called, while 57.7% of bases (57.4% of segregating sites) were called at a 50X threshold. Data accuracy at known segregating sites was 98.9% at 5X coverage, rising to 99.6% at 50X coverage. Accuracy at homozygous sites was 98.7% at 5X sequence coverage and 99.5% at 50X coverage. Although accuracy at heterozygous sites was modestly lower, it was still over 92% at 5X coverage and increased to nearly 97% at 50X coverage. These data provide the first demonstration that MGS/IGA sequencing can generate the very high quality sequence data necessary for human genetics research. All sequences generated in this study have been deposited in NCBI Short Read Archive (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra, Accession # SRA007913).

Combining microarray-based genomic selection (MGS) with the Illumina Genome Analyzer platform to sequence diploid target regions.

Nouvelles m&eacute;thodes de s&eacute;quen&ccedil;age cibl&eacute; des r&eacute;gions uniques de g&eacute;nomes eucaryotes complexes ont g&eacute;n&eacute;r&eacute; beaucoup d&#39;enthousiasme, mais il manquent des d&eacute;monstrations critiques de ces efficacit&eacute; de m&eacute;thodes en ce qui concerne la variation appelant et exp&eacute;rimental de g&eacute;notypes diplo&iuml;des. Pour r&eacute;soudre ce probl&egrave;me, nous avons optimis&eacute; la s&eacute;lection g&eacute;nomique microarray (MGS) pour utilisation avec les Illumina Genome Analyzer (IGA). Un ensemble de 202 fragments (304KO total) contenus dans une r&eacute;gion g&eacute;nomique de 1,7 Mb sur le chromosome humain X &eacute;taient MGS/IGA s&eacute;quenc&eacute; dans dix &eacute;chantillons de HapMap femelles g&eacute;n&eacute;rant un total de 2,4 Go de s&eacute;quence d&#39;ADN. &Agrave; un seuil minimal de couverture de 5 X, 93,9 % de toutes les bases et 94,9 % des sites de s&eacute;gr&eacute;gation ont &eacute;t&eacute; appel&eacute;s, tandis que 57,7 % des bases (57,4 % de s&eacute;gr&eacute;gation des sites) ont &eacute;t&eacute; appel&eacute;s &agrave; un seuil de X 50. Exactitude des donn&eacute;es dans les sites connus de s&eacute;gr&eacute;gation &eacute;tait 98,9 % pour une couverture de 5 X, s&#39;&eacute;levant &agrave; 99,6 % pour une couverture de 50 X. Pr&eacute;cision aux sites homozygotes a 98,7 % pour une couverture de l&#39;ordre des X 5 et 99,5 % pour une couverture de 50 X. Pr&eacute;cision aux sites h&eacute;t&eacute;rozygotes &eacute;tait l&eacute;g&egrave;rement inf&eacute;rieure, il &eacute;tait encore sup&eacute;rieur &agrave; 92 % pour une couverture de 5 X, pour atteindre pr&egrave;s de 97 % pour une couverture de 50 X. Ces donn&eacute;es constituent la premi&egrave;re d&eacute;monstration que le s&eacute;quen&ccedil;age de MGS/IGA peut g&eacute;n&eacute;rer les donn&eacute;es de s&eacute;quence de tr&egrave;s haute qualit&eacute; n&eacute;cessaires pour la recherche en g&eacute;n&eacute;tique humaine. Toutes les s&eacute;quences g&eacute;n&eacute;r&eacute;es dans cette &eacute;tude ont &eacute;t&eacute; d&eacute;pos&eacute;s dans l&#39;Archive de lecture courte NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra, adh&eacute;sion # SRA007913).

Combinant s&eacute;lection g&eacute;nomique microarray (MGS) avec la plate-forme Illumina Genome Analyzer aux r&eacute;gions de s&eacute;quence cible diplo&iuml;de.

Nuovi metodi di sequenziamento mirato delle regioni uniche da complessi genomi eucariotici hanno generato una grande quantit&agrave; di eccitazione, ma mancano critiche dimostrazioni di questi efficacia di metodi rispetto alla variazione sperimentale e chiamata genotipo diploide. Per risolvere questo problema, abbiamo ottimizzato la selezione genomica basata su microarray (MGS) per uso con Illumina Genome Analyzer (IGA). Un insieme di 202 frammenti (totale 304 kb) contenuto all&#39;interno di una regione genomica di 1,7 Mb sul cromosoma umano X erano MGS/IGA sequenziato in dieci campioni HapMap femmine generando un totale di 2,4 GB di sequenza del DNA. A una soglia di copertura minima di 5 X, 93.9% di tutte le basi e 94,9% di segregare i siti sono stati denominati, mentre il 57,7% delle basi (57,4% di segregare siti) sono stati chiamati a una soglia X 50. Accuratezza dei dati noti siti segregating era 98,9% al 5 di copertura X, al 99,6% a copertura X 50. Precisione presso siti omozigoti era 98,7% a copertura di sequenza X 5 e 99,5% a copertura X 50. Sebbene precisione presso siti eterozigoti era modestamente inferiore, era ancora oltre 92% al 5 di copertura X ed &egrave; aumentato di quasi il 97% di copertura X 50. Questi dati forniscono la prima dimostrazione che il sequenziamento MGS/IGA pu&ograve; generare i dati di sequenza molto alta qualit&agrave; necessari per le ricerche di genetica umana. Tutte le sequenze generate in questo studio sono state depositate nell&#39;archivio di lettura breve NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra, SRA007913 # adesione).

Combinando selezione genomica basata su microarray (MGS) con la piattaforma Illumina Genome Analyzer per regioni di sequenza bersaglio diploide.

La malattia di Crohn (CD) &egrave; altamente ereditabile. NOD2 &egrave; emerso come il gene di suscettibilit&agrave; principale tra gli individui dell&#39;ascendenza europea; Tuttavia, non sembra che NOD2 contribuiscono alla suscettibilit&agrave; CD tra molte popolazioni non europee. Popolazione afro-americana (AA) odierna rappresenta una mescolanza di Africa occidentale (80%) ed europeo (20%) ascendenza. Poich&eacute; gli strumenti basati sul genotipo stanno diventando sempre pi&ugrave; disponibili per CD, &egrave; importante che noi convalidare le varianti di rischio in popolazioni diverse, quali admixed AAs.

Comuni varianti di rischio NOD2 in afro-americani con la malattia di Crohn sono dovuti esclusivamente alla recente commistione caucasica.

Maladie de Crohn (MC) est hautement h&eacute;ritable. NOD2 a &eacute;merg&eacute; comme le g&egrave;ne de susceptibilit&eacute; principal chez les personnes d&#39;ascendance europ&eacute;enne ; Cependant, NOD2 ne semble pas contribuer &agrave; la susceptibilit&eacute; de CD parmi de nombreuses populations extra-europ&eacute;ennes. La population afro-am&eacute;ricaine (AA) d&#39;aujourd&#39;hui repr&eacute;sente un m&eacute;lange d&#39;Afrique de l&#39;Ouest (80 %) et l&#39;ascendance (20 %). &Eacute;tant donn&eacute; que les outils bas&eacute;s sur le g&eacute;notype deviennent de plus en plus disponibles pour CD, il est important que nous validons les variantes de risque dans des populations diff&eacute;rentes, tels que l&#39;AAs inusit&eacute;s.

Variantes de risque NOD2 communes dans les Afro-am&eacute;ricains avec la maladie de Crohn sont dues exclusivement au m&eacute;lange de race blanche r&eacute;cente.

Crohn's disease (CD) is highly heritable. NOD2 has emerged as the main susceptibility gene among individuals of European ancestry; however, NOD2 does not appear to contribute to CD susceptibility among many non-European populations. Today's African American (AA) population represents an admixture of West African (80%) and European (20%) ancestry. Since genotype-based tools are becoming increasingly available for CD, it is important that we validate the risk variants in different populations, such as admixed AAs.

Article	Year
Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing. Nature methods\| PubMed ID: 17934469	2007
Applying rapid genome sequencing technologies to characterize pathogen genomes. Analytical chemistry\| PubMed ID: 18320606	2008
Microarray-based mutation detection in the dystrophin gene. Human mutation\| PubMed ID: 18663755	2008
Structure and complexity of a bacterial transcriptome. Journal of bacteriology\| PubMed ID: 19304856	2009
Combining microarray-based genomic selection (MGS) with the Illumina Genome Analyzer platform to sequence diploid target regions. Annals of human genetics\| PubMed ID: 19573206	2009
Common NOD2 risk variants in African Americans with Crohn's disease are due exclusively to recent Caucasian admixture. Inflammatory bowel diseases\| PubMed ID: 22447396	2012

David T. Okou

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