Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. 准备工作
<ol>
	<li>应在实验记录本中编写一份流程图，列出所有材料、逐步实验步骤以及废弃物品的处理方法，并将记录本放置在实验工作区附近。</li>
	<li>工作台面应使用适当的消毒剂（70%乙醇）进行消毒，实验人员应穿戴洁净的实验服以降低污染风险，同时保护自身免受异常暴露危害。合适的防护装备包括但不限于实验服、乳胶或丁腈手套、护目镜、呼吸器和封闭式鞋子。全程必须严格保持无菌操作技术。</li>
	<li>配制90 mL 0.45%生理盐水。使用洁净的量筒量取90 mL无菌水，转移至已标记为0.45%生理盐水的洁净锥形瓶中。称取0.405 g氯化钠（Sigma-Aldrich NaCl S9888），加入标记为0.45%生理盐水的锥形瓶中。反复旋转摇动，直至无可见溶质残留。</li>
	<li>实验结束后，实验人员应重新对所有表面进行消毒，并根据OSHA指南丢弃任何不需要的微生物、稀释液原液、培养皿或一次性接种环。在洗手前可脱去实验防护服。</li>
</ol>
2. 培养基制备
<ol>
	<li>选择适合目标生物培养的培养基。在大多数情况下，液体培养基足以支持细菌生长。由于本实验旨在获取 Winogradsky 培养柱中的微生物，因此构建了一个包含碳酸钙、硫、纤维素和泥浆的培养柱，并静置 7 天。该培养柱可分为好氧、微好氧和厌氧区域。</li>
	<li>选择适合目标微生物涂布培养的培养基。通常通过向液体培养基中添加微生物级琼脂作为凝固剂。从上述培养柱的好氧、微好氧和厌氧区域取样时，LB 培养基/琼脂已足够适用。注意：本实验未采集微好氧区域的样品。然而，若需培养此类微生物，应使用烛缸法。在密封培养容器前引入一支燃烧的蜡烛，可形成低氧环境，适合微好氧菌的增殖。</li>
	<li>由于我们需要制备 250 mL 培养基，应使用 500 mL 或更大容量的锥形瓶，以防止灭菌过程中发生沸腾溢出。将其中一个标记为 &#34;Broth&#34;，另一个标记为 &#34;Agar&#34;。</li>
	<li>根据生产商推荐的浓度确定每种溶液所需的培养基用量。此处使用的 LB 琼脂按 25 g/L 与超纯水混合配制。我们所需体积为 250 mL，因此需配制 6.25 g LB 琼脂 / 250 mL 水的溶液。同理，LB 肉汤也按相同比例混合 LB 肉汤与水配制。由于未添加凝固剂，冷却后不会凝固。</li>
	<li>按照生产商推荐的比例称量培养基并将其与水混合。将 6.25 g LB 琼脂加入标记为 &#34;Agar&#34; 的锥形瓶中，将 6.25 g LB 肉汤加入标记为 &#34;Broth&#34; 的锥形瓶中。向每个锥形瓶中加入 250 mL 超纯水。</li>
	<li>用铝箔封住每个锥形瓶口，并在 121°C、15 psi 条件下使用高压灭菌锅对培养基灭菌至少 15 分钟。</li>
	<li>灭菌程序完成后，使用耐热手套或垫子将锥形瓶从灭菌锅中取出，并置于 40–50°C 水浴中。</li>
	<li>当温度降至适宜范围后，将标记为 &#34;Broth&#34; 的锥形瓶中的内容物倒入一个 250 mL 锥形瓶或圆底烧瓶中。将该 250 mL 烧瓶标记为 &#34;solution0&#34;。</li>
	<li>准备 10 个无菌的 100 mm × 15 mm 培养皿，并在上面标注日期、姓名、所用培养基类型以及将要取样的 Winogradsky 培养柱区域。</li>
	<li>将标记为 &#34;Agar&#34; 的锥形瓶从水浴中取出，开始向 10 个培养皿中倾注琼脂。每个培养皿中加入的琼脂量不应超过 15 mL。也可使用移液器配合 25 mL 血清移液管以提高准确性。用无菌移液枪头去除存在的气泡，盖上培养皿盖，静置过夜使其凝固。</li>
</ol>
3. 稀释液的配制
<ol>
	<li>准备10支可容纳20 mL或更大体积的试管，置于试管架中，并标记为T1-T10。每支试管的编号与其对应的稀释倍数一致（例如，T4 = 1×10-4 或 0.0001 或原液浓度的1/10,000）。</li>
	<li>用移液器向10支试管中各加入9 mL的0.45%生理盐水。</li>
	<li>生理盐水空白管现已准备好通过高压灭菌器进行灭菌。用铝箔覆盖每支试管，然后将其转移至可耐受高压灭菌的试管架中。在121°C、15 psi条件下至少灭菌15分钟。</li>
	<li>使用耐热手套取出灭菌后的空白管，待其冷却。当试管冷却至室温或触感不热时，盖上盖子并储存于4°C，待需要时使用。</li>
</ol>
4. 目标生物体的培养
<ol>
	<li>从先前划线的平板上挑取单菌落，或取50 µL冻存菌种，接种至&#34;solution0&#34;中。将接种后的&#34;solution0&#34;置于37°C摇床中过夜培养（如需要可进行振荡），以使目标生物有足够时间增殖。（注意：应覆盖容器以防止污染。若目标生物为需氧菌，应使用无菌纱布和棉塞防止污染。若需分析Winogradsky柱中的不同区域，可直接从每个目标区域（本研究中包括需氧区和厌氧区）取1克样品，并将其重悬于T1中，随后进行步骤5.3。）</li>
</ol>
5. 连续稀释
<ol>
	<li>从培养箱中取出标有&#34;Nutrient broth&#34;的烧瓶，并剧烈振荡。</li>
	<li>用移液器将1 mL &#34;solution0&#34;加入标记为T1的试管中。涡旋振荡T1。若需评估Winogradsky微宇宙样品，先称取目标区域1克并加入T1，再进行涡旋振荡。（注意：此处使用1 mL仅为简化操作，也可使用更小或更大的稀释液体积）。</li>
	<li>从试管T1中取出1 mL液体，加入试管T2中。涡旋振荡T2。</li>
	<li>从试管T2中取出1 mL液体，加入试管T3中。涡旋振荡T3。</li>
	<li>从试管T3中取出1 mL液体，加入试管T4中。涡旋振荡T4。</li>
	<li>从试管T4中取出1 mL液体，加入试管T5中。涡旋振荡T5。</li>
	<li>从试管T5中取出1 mL液体，加入试管T6中。涡旋振荡T6。</li>
	<li>从试管T6中取出1 mL液体，加入试管T7中。涡旋振荡T7。</li>
	<li>从试管T7中取出1 mL液体，加入试管T8中。涡旋振荡T8。</li>
	<li>从试管T8中取出1 mL液体，加入试管T9中。涡旋振荡T9。</li>
	<li>从试管T9中取出1 mL液体，加入试管T10中。</li>
</ol>
6. 涂布平板法
<ol>
	<li>从T1中吸取100 µL稀释后的样品，直接滴加到培养皿中。此步骤可根据需要对每个试管重复操作，但非必需。</li>
	<li>取一支无菌的一次性涂布棒，或对玻璃涂布棒进行火焰灭菌。以顺时针/逆时针方向移动涂布棒的水平部分，使样品在培养皿内均匀分布。</li>
	<li>对需要评估的Winogradsky柱的每个区域重复上述操作。</li>
	<li>将培养皿置于37°C培养箱中培养24小时。对于厌氧微生物，应使用厌氧培养箱。</li>
</ol>
7. 划线接种
<ol>
	<li>选择目标生物体的合适稀释度。例如，溶液4 将得到初始浓度的1/10,000稀释度。通常，1/1,000的稀释度th (T3/溶液)，1/1,000,000th (T6/溶液6) 和 1/1,000,000,000th (T9/溶液9用于计数微生物。</li>
	<li>使用一次性无菌塑料接种环，或已用火焰灼烧不少于10秒的可重复使用金属接种环，浸入第5步所需的溶液中。校准后的接种环应转移0.01 mL液体。（注意：灼烧后的接种环从热源取出后，不得立即接触细菌）</li>
	<li>将培养皿盖子的一侧略微抬起，仅使接种环能够进入琼脂表面。小心地以锯齿状方式将接种环在培养基表面滑动，注意不要划破琼脂。随后盖好培养皿盖子。</li>
	<li>使用新的一次性接种环，或对可重复使用的接种环重新灭菌。</li>
	<li>将培养板旋转约1/3圈rd （约118°），并降低之字形运动的频率。</li>
	<li>再次使用新的一次性接种环，或在最后一次旋转前重新灭菌金属接种环，并进一步减少之字形划线频率。降低培养皿盖。</li>
	<li>重复步骤 7.2 至 7.6，直至完成三个不同稀释度的划线，每个稀释度至少使用三个培养皿，每次使用新的一次性接种环，或重新灼烧可重复使用的接种环（图2).</li>
	<li>将划线的培养皿置于37°C培养箱中过夜培养。对于厌氧微生物，应使用厌氧培养箱。</li>
</ol>
8. 数据分析与结果
<ol>
	<li>从培养7天的温克尔曼柱（Winogradsky column）的有氧区和无氧区分别采集菌群样品。这两个区域分别适合异养菌和厌氧铁氧化菌的生长。</li>
	<li>将柱体组织块在接种前进行系列稀释，随后划线或涂布于LB琼脂平板上。</li>
	<li>划线结果显示，所检测的每个温克尔曼柱区域均含有混合菌群。涂布平板的结果与此相似。</li>
	<li>为计算CFU/mL或CFU/g，需取三个平板上菌落数的平均值，将该平均值乘以稀释倍数，再除以接种体积。例如，若在接种了0.1 mL溶液6（T6）的平板上平均计数到65个菌落，则按前述公式计算可得650,000,000 CFU/mL。</li>
	<li>现在可从每个平板上挑选分离的单菌落，用于富集实验，以确定其物种身份。</li>
</ol>

通过平板法进行细菌计数和菌株分离时，需要目标生物体的浓度处于可操作范围内。因此，成功接种依赖于梯度稀释。上述技术仍是微生物学检测与实验的基础。尽管这些方法本身设计简单，但实验人员可通过调整稀释倍数和平板接种技术来优化结果，同时不损害每种方法的可靠性。绘制细菌生长的四个阶段有助于表征目标微生物。这四个阶段——迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期——以细菌复制能力的变化为标志。迟缓期因生理适应而生长缓慢；对数期是活菌数呈指数增长的快速增殖阶段；随后由于环境限制及毒素积累进入稳定期；最终进入细胞数量开始下降的衰亡期。该过程可通过从 Time0 开始，每小时对 Solution0 进行一次连续稀释（或采用单步稀释以避免混淆），共持续8小时来实现（每次稀释后应将 Solution0 放回摇床培养箱中继续培养）。取 Time0 样品的某一稀释度，计算其 CFU/ml 的 log10 值，并将其绘制在Y轴上；对 Time1 样品重复此计算（确保使用与 Time0 相同的稀释倍数计算 CFU/mL）；依此类推，直至将所有时间点（Time1–Time8）的数据绘制在X轴上。

连续稀释与涂布：微生物计数

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

来源：Jonathan F. Blaize1，Elizabeth Suter1 和 Christopher P. Corbo1 
1 生物科学系，瓦格纳学院，1 Campus Road，纽约州史泰登岛，10301
由于原核生物数量庞大、易于呈指数级增殖、种群内物种多样性高，且具有特定的生理需求，因此对其进行定量评估可能十分繁琐。此外，细菌的增殖具有四个阶段（迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期），进一步加大了这一挑战。准确估算微生物浓度对于成功进行微生物的鉴定、分离、培养和表征至关重要（6）。因此，一个多世纪以来，微生物学家一直采用连续稀释法及多种平板接种技术，在临床、工业、制药以及学术实验室环境中可靠地定量细菌和病毒载量（2,4,6）。该方法的最早描述可追溯至1883年，当时德国科学家兼医生罗伯特·科赫（Robert Koch）发表了关于致病微生物的研究成果（2）。科赫常被称为现代细菌学之父，他所创立的这些技术已成为全球范围内对可培养或不可培养微生物进行计数的金标准。
连续稀释是通过将初始溶液（溶液0）依次重悬于固定体积的液体稀释剂（空白管）中，对已知或未知的实体（溶质、生物体等）进行系统性减少的过程。这些空白管通常含有0.45%的生理盐水，但其成分也可根据需要调整（7）。尽管实验人员可自行选择每次稀释所用的稀释剂体积，但通常选用10的倍数，以便实现样品的对数级递减。例如，溶液0中含有10 mL营养肉汤，其中悬浮着总共100个E. coli细胞。若从中取出1 mL溶液0并加入9 mL生理盐水（稀释剂1）中，则新得到的溶液（溶液1）中E. coli的浓度为初始浓度的1/10th。在此例中，新溶液（溶液1）将含有10个E. coli细胞。重复此过程，从溶液1中取出1 mL加入另一管含9 mL生理盐水（稀释剂2）的试管中，可得到溶液2，其中仅含有一个E. coli细胞。由于每一份新溶液（9 mL稀释剂 + 1 mL溶液）总体积均为10 mL，因此可得出该稀释过程的稀释倍数为10，即进行了10倍的连续稀释（图1）。由于本例中起始仅有100个细胞，且每次稀释倍数为10，因此仅需两步即可达到最低浓度——1个细胞。
<img alt="连续稀释示意图；通过十个试管逐步降低溶液浓度的过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图1：原液的连续稀释。 取1 mL原液（溶液0）加入含有9 mL 0.45%生理盐水（稀释液1）的1号试管中；该混合物即为溶液1。然后取1 mL新配制的溶液1加入2号试管中，重复此操作。以同样方式继续取样并重新混悬，直至最后一个试管，每一步均将原液浓度稀释10倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
连续稀释是获得目标生物体可操作浓度的最简单技术，该方法常与平板划线法和涂布法相结合，而这两种方法只是微生物学家所使用的众多平板接种技术中的两种。这种方法的优势在于，实验者可以分离出单一物种的纯菌株，或从混合种群中分离出不同的菌株（7）。划线法的操作是将生物体接种到固体培养基上（通常由琼脂糖构成），在提供适当营养的条件下，生物体即可生长。使用无菌接种环在培养基表面轻轻划过（留下细微的划线痕迹），并按照严格的正弦波模式移动，可使生物体的分布与实验者划线波形的频率成比例。将培养皿分为三区或四区（即分区划线法），并在进入培养皿新区域时逐步减少划线频率，可逐渐降低该区域内可生长的微生物数量，从而形成单个菌落，而非无法计数的细菌菌苔。涂布法不会进一步稀释样品；而是使用无菌玻璃涂布棒将一定体积的悬浮液均匀涂布在整个培养皿表面（图2）。在涂布平板上生长出的菌落来源于单个细胞，培养皿上每个菌落均可计数，用于估算特定悬浮液中每毫升的菌落形成单位数量（CFU），表示为 CFU/mL（6）（图3）。软琼脂培养法和影印培养法分别是上述技术的变体，分别可用于噬菌体的分离和突变体的筛选（1,7）。
<img alt="Anaerobic and aerobic microbial dilution process diagram; tube dilution, bacterial growth zones." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
图2：用于细菌计数和菌株分离的平板划线法 在培养皿底部标记鉴定信息（细菌名称、日期、培养基），并将培养皿均分为三等份。选择适当的原始样品稀释液后，取一支无菌（一次性或火焰灭菌）接种环，浸入试管（此处为 T3）中。将培养皿盖一侧微微抬起，仅使接种环可进入琼脂表面。以“之”字形方式轻轻滑动接种环，均匀涂布于培养基表面，注意避免划破琼脂。旋转培养皿约三分之一圈rd （约118°），并减少之字形运动的频率。再旋转一次，并进一步降低之字形运动的频率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三重条带法示意图；细菌培养，培养皿，分离技术，微生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图 3"> 
图 3：涂布平板法。 取1 g好氧区样品重悬于T1溶液中，然后进行系列稀释。使用无菌玻璃或一次性塑料涂布棒将接种物均匀涂布于每个培养皿表面。对1 g厌氧区样品重复上述操作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
与系列稀释法类似，生物体浓度也采用对数尺度来表示。在标准的100 mm × 15 mm培养皿中生长的菌落数量，可通过识别孤立的生长簇进行人工计数（或借助计算机处理实现自动化计数）。菌落数少于30或超过300时，应分别定义为“无法计数”（TFTC）或“过多无法计数”（TNTC）。对于后者情况，应进行系列稀释以降低浓度，然后再重新划线接种新的培养皿。取三个独立培养皿中各自独立菌落的平均数量，再乘以稀释倍数，即可得到CFU/mL；以CFU/mL的log10值对时间作图，可得出该生物体的平均世代时间（7）。

来源：Jonathan F. Blaize1，Elizabeth Suter1 和 Christopher P. Corbo1  
1 生物科学系，瓦格纳学院，校园路1号，史泰登岛...

有时，为了鉴定和研究细菌，我们首先需要从样品中分离并富集它们。例如，从温诺格拉斯基柱（Winogradsky Column）获得的样品是混合的，意味着其中含有多种细菌物种或菌株，因此研究单个细菌或统计其中存在的不同种类会具有挑战性。为此，通常采用连续稀释和平板接种技术，以可靠地定量细菌载量并分离单个菌落。连续稀释是一种通过在固定体积的液体稀释剂中连续重悬，从而系统性降低生物体（本例中为细菌）浓度的过程。通常稀释剂的体积为10的倍数，以便于实现样品中生物体的对数级减少。例如，首先从目标Winogradsky区带中取出1克沉积物，加入到10毫升适当的液体培养基中；然后取1毫升该第一代稀释液，加入另一支含有9毫升培养基的试管中。此过程可重复进行，直至制备出若干种不同浓度的细菌悬液。在本例中，连续稀释是细菌计数的关键步骤，因为来自Winogradsky柱的混合样品中含有数量未知且通常较大的细菌群体。接下来，划线接种和平板涂布分别可用于样品中细菌的分离和计数。划线接种的操作方法是：将稀释后的样品接种到添加了营养物质的固体培养基的一个区域，该区域被分为三个部分。然后以之字形方式将接种物在平板的每一部分上进行划线。随着在平板不同区域连续划线，并且每次仅从上一区域交叉一次，样品被逐渐稀释。这意味着，只需使用一个稀释度的样品进行划线，即可在后续区域获得单个菌落。培养后，通过观察划线平板上菌落的形态特征，可获得有助于区分不同细菌种类的信息。或者，如果主要目标是测定样品中细菌的数量，则可采用涂布平板法。在涂布平板法中，将单个样品的等分试样均匀涂布于固体培养基表面。通常，由于我们并不知晓混合样品中的细菌数量，因此需对每个稀释度或其中具有代表性的稀释度制备涂布平板。培养后，可通过这些涂布平板进行菌落计数。任何菌落数少于30的平板均应弃去，因为菌落数过少会导致较大误差。同样，菌落数超过300的平板也应弃去，因为菌落过于密集或重叠可能导致菌落数被低估。若记录下这些保留平板的菌落数，乘以稀释倍数，再除以涂布的体积，即可得到每毫升悬液中的菌落形成单位（CFU）。在本视频中，您将学习如何通过连续稀释法、涂布平板法和划线平板法，对含有已知细菌的样品以及温哥华柱不同区域中的微生物群落进行定性和定量评估。首先，穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。接着，用70%乙醇对工作区域进行消毒，并擦拭台面。然后，准备两个500毫升的锥形瓶，分别标记为“肉汤”和“琼脂”。配制LB琼脂溶液时，将约6.25克LB琼脂、3克技术级琼脂和250毫升蒸馏水加入标记为“琼脂”的锥形瓶中，混合均匀。然后，通过将 2.5 克 LB 培养基和 100 毫升蒸馏水加入标记为“broth”的锥形瓶中来配制 LB 肉汤。将锥形瓶高压灭菌后，使用耐热手套从高压灭菌器中取出，并置于 40 至 50 摄氏度的水浴中。当锥形瓶温度降至 50 摄氏度时，小心地将肉汤溶液分成三份，每份 100 毫升，并将每份标记为“0”。接下来，准备 10 个无菌培养皿，并用日期、名称、所用培养基类型以及将要采集微生物的 Winogradsky 柱区域进行标记。从琼脂瓶中吸取 15 毫升琼脂加入每个培养皿中。然后用移液器吸头去除任何气泡，盖上培养皿盖，在实验台面上静置过夜使其凝固。第二天，用70%乙醇擦拭台面。然后，将10个20毫升试管标记为T1至T10，并放入试管架中。向每个试管中加入9毫升0.45%生理盐水。现在，将10个试管的管盖轻轻盖上，不要旋紧，然后转移至可高压灭菌的试管架中。待灭菌程序完成后，使用耐热手套取出生理盐水空白管，使其冷却。将试管在室温下存放，直至温度降至约22摄氏度。为了培养目标生物体（本示例中为大肠杆菌），从先前划线的平板上挑取单菌落，接种于100毫升的零号溶液中。然后盖上试管，于37°C过夜培养。为评估温克尔曼柱的不同区域，取需氧区约1克样品加入T1管中，并通过涡旋振荡重悬。随后，取厌氧区约1克样品，重复此操作。从培养箱中取出含有接种了大肠杆菌的溶液零的试管并振荡。然后，用移液器将一毫升该溶液加入T1试管中，并涡旋混匀。从T1中取出一毫升溶液转移至T2，涡旋混匀。重复此过程至T10试管。为评估瓦诺格拉德斯基柱的好氧区和厌氧区，从先前制备的各T1试管中分别取出一毫升溶液，转移至相应的T2试管中。然后，如前所述继续进行T10试管的系列稀释。进行涂布平板操作时，从每个T3试管中吸取100微升稀释后的样品，分别加入对应的培养皿中。然后使用无菌涂布棒轻轻将样品均匀涂布于培养皿表面，并盖上皿盖。按照前述方法，对T6和T9稀释度的样品重复上述操作。将含有需氧微生物的平板置于37°C恒温培养箱中，培养24小时；将含有厌氧微生物的平板置于设定为37°C的厌氧培养箱中，培养24小时。次日，从恒温培养箱和厌氧培养箱中取出T3、T6和T9稀释度的平板，转移至实验台面。每次操作一个平板，用无菌接种环在培养基表面以“之”字形方式划线，随后盖上培养皿盖。接着，将培养皿旋转1/3圈，对接种环进行灼烧灭菌，以减少前次“之”字形划线的密度。再次灭菌接种环后，将培养皿再旋转1/3圈，最后一次降低“之”字形划线的密度，然后盖上皿盖。按照前述演示方法，对剩余平板重复此分区划线操作。随后，将已完成划线的含需氧微生物的平板置于37°C恒温培养箱中过夜培养，将含厌氧微生物的平板置于设定为37°C的厌氧培养箱中过夜培养。从一个七天大的温哥华氏柱（Winogradsky Column）的好氧区和厌氧区分别收集培养物。随后，将这些培养物进行系列稀释，再于LB琼脂平板上划线和涂布。划线结果显示，所检测的各个温哥华氏区均含有混合菌群，涂布平板也得到类似结果。由混合菌群划线的平板上会形成形态、大小、质地和颜色各异的细菌菌落。相比之下，接种已知生物大肠杆菌（E. coli）的划线和平板涂布培养则显示出均一的菌群。通常，最准确的每毫升菌落形成单位（CFU）计算方法是：取三个相同样品、相同稀释倍数的涂布平板的平均菌落数，乘以稀释倍数，再除以涂布的样品体积（毫升）。最后，可从每个平板上挑选分离的单菌落，用于进一步的富集实验，以确定其物种身份。

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连续稀释和电镀:微生物枚举

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

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enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

该集合展示了微生物调查的关键工具，包括适当的无菌技术和电镀，如何使用选择性培养基和丰富样品，以及混合或纯样品的培养方法。此外，它着眼于识别微生物分离物的常见方法，以及细菌基因操作的程序。

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

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