Name: bacterial id with 16s rrna gene sequencing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:55.000Z
Duration: 10 min 57 s
Channel: JoVE

1. 设置
<ol>
	<li>操作微生物时，必须遵循良好的微生物学操作规范。所有微生物，尤其是未知样本，均应视为潜在病原体。应采用无菌技术，以避免样本、研究人员或实验室受到污染。在接触细菌前后均应洗手，佩戴手套，并穿戴防护服。</li>
	<li>应对基因组DNA提取和PCR产物纯化实验方案进行风险评估。某些试剂可能具有危害性！</li>
	<li>16S rRNA测序必须使用纯培养物。在进行基因组DNA提取之前，需确保起始材料完全纯净。可通过划线接种法分离单菌落以获得纯培养。如有需要，可将单菌落分别在平板或液体培养基中进一步培养。</li>
	<li>所需实验设备：
	<ol>
		<li>用于PCR的PCR仪。PCR仪的功能是根据预设程序升高或降低温度。在设置程序时，需输入每个PCR步骤的温度和时间参数，以及循环总数。</li>
		<li>琼脂糖凝胶电泳系统。该系统用于根据DNA片段的大小和电荷进行分离。在本实验方案中，琼脂糖凝胶电泳将用于检测提取的基因组DNA和PCR产物的质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验方案
注意： 本演示方案适用于细菌纯培养物的 16S rRNA 基因测序，不适用于宏基因组学研究。
<ol>
	<li>培养细菌以分离基因组DNA（gDNA）。
	<ol>
		<li>在合适的培养基中培养目标微生物。此步骤可使用液体或固体培养基。选择最有利于生长的条件。实验设计时需注意，生长缓慢的细菌可能需要数天才能达到对数后期/稳定期。本方案中，Bacillus subtilis 168 在含LB培养基的摇床培养箱中，于37°C、200 rpm条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>gDNA的提取。
	<ol>
		<li>若细菌在固体培养基上培养，使用无菌接种环刮取部分菌体，并将其重悬于1 mL蒸馏水中。</li>
		<li>若细菌在液体培养基中培养，则取约1.5 mL过夜培养物。</li>
		<li>通过离心（1分钟，12,000 - 16,000 × g）收集菌体，弃去上清液，使用商业试剂盒或标准方法进行gDNA提取 [例如 CTAB总DNA制备法 (13) 或酚-氯仿抽提法 (14)]。本实验中，使用商业试剂盒从1.5 mL的B. subtilis 168过夜培养物（OD600 = 1.5）中提取gDNA。 
		注意1： 对于某些革兰氏阴性菌，此步骤可省略，直接通过煮沸法释放DNA。将菌体沉淀重悬于蒸馏水中，置于100 °C金属浴中孵育10分钟。 
		注意2： 革兰氏阳性菌细胞较难裂解，因此建议选用专为该类细菌设计的gDNA提取方法或试剂盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>gDNA质量检测。
	<ol>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取gDNA的质量。首先，将5 µL提取的gDNA与1 µL上样染料（6x）混合，加样至含有DNA染色试剂的0.8%琼脂糖凝胶中。</li>
		<li>加入分子量标准品，电泳运行至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>电泳结束后，在适当的凝胶成像系统（紫外光或蓝光）下观察结果。gDNA表现为一条浓重的高分子量条带（大于10 kb）。gDNA质量检测示例见图3。</li>
		<li>若gDNA通过质量控制（即 存在清晰的高分子量条带且无明显拖尾现象），则进行系列稀释：先标记3个微量离心管，分别标注为“10x”、“100x”和“1000x”。</li>
		<li>向上述3个管中各加入90 µL无菌蒸馏水。</li>
		<li>取10 µL gDNA溶液加入标记为“10x”的管中。</li>
		<li>充分吹吸混合（即 100 µL总体积），确保溶液均匀。然后从中取出10 µL转移至标记为“100x”的管中。</li>
		<li>按前述方式混匀后，重复操作，将10 µL溶液从“100x”管转移至“1000x”管。这些稀释后的样品将作为PCR反应的模板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="DNA电泳结果；基因组DNA（gDNA）分析和标记物比较的凝胶条带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图3"> 
图3：从Bacillus subtilis中提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1：M—分子量标记物（从上到下：10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp）。泳道2：gDNA—从Bacillus subtilis中提取的基因组DNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>通过PCR扩增16S rRNA基因。 
	注意：以下PCR方案针对特定的DNA聚合酶和引物对8F - 1492R（见表1）进行了优化。对于每种不同的聚合酶和引物对，均需对方案进行优化。
	<ol>
		<li>将所有试剂在冰上解冻。</li>
		<li>按照表2所示配制PCR主混合液。由于DNA聚合酶在室温下具有活性，因此反应体系的配制必须在冰上进行，i.e. PCR管和反应组分应始终置于冰上。为每个gDNA样本设置一个反应，并设置一个阴性对照反应。阴性对照是指不含gDNA模板的PCR混合液，用于确保反应体系中的其他组分未被污染。 
		注意：当样本数量较多时，通常会预先配制主混合液。主混合液是包含除模板外所有反应组分的溶液，有助于减少重复移液操作、避免移液误差，并确保样本间高度一致性。配制主混合液时，将各组分（除DNA模板外）的体积乘以待测样本的数量，在微量离心管中混合所有组分，并用移液器将总体积上下吹打数次以混匀。</li>
		<li>将49 µL主混合液分装至各个PCR管中。</li>
		<li>向含主混合液的PCR管中加入1 µL模板。阴性对照管中加入1 µL无菌水。为确保组分充分混匀，使用设定为30–50 µL的移液器轻柔地上下吹打约10次。</li>
		<li>设置PCR仪程序，如表3所示。</li>
		<li>将PCR管放入PCR仪中并启动程序。</li>
		<li>程序完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量。</li>
		<li>使用8F-1492R引物对进行成功的PCR扩增应产生一条大小约为1.5 kb的单一条带（图4）。若出现其他条带（i.e. 非特异性产物），可通过调整退火温度优化PCR程序。若存在预期大小的单一清晰条带，则进入下一步。本实验中，使用100倍稀释的gDNA模板进行PCR扩增所得产物最佳，因其具有清晰的预期大小条带且无非特异性产物，因此被选中用于纯化并送测序。</li>
		<li>在测序前，必须去除PCR反应中残留的引物、脱氧核糖核苷酸、聚合酶和缓冲液。可使用商业化的PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的分离。将PCR反应液加载到含有DNA结合基质的柱子上，PCR产物会结合在柱子上，而其他组分则随流动相穿过柱子。随后用洗涤缓冲液清洗柱子，最后用选定的缓冲液将DNA洗脱下来。请确认试剂盒提供的洗脱缓冲液适用于测序。</li>
		<li>将纯化后的PCR产物送交DNA测序。遵循所选测序机构对测序样本提交的指导要求。为获得最佳测序覆盖度，建议使用PCR扩增引物（即2.4.1节中使用的相同引物）作为测序引物。本实验中，使用引物8F和1492R对PCR产物进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>每反应体积</td>
			<td>每 x 个反应体积（主混合液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x 反应缓冲液</td>
			<td>1x</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>10 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>200 µM</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>1 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 引物 8F</td>
			<td>0.5 µM</td>
			<td>2.5 µL</td>
			<td>2.5 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 引物 1492R</td>
			<td>0.5 µM</td>
			<td>2.5 µL</td>
			<td>2.5 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion 聚合酶</td>
			<td>1 单位</td>
			<td>0.5 µL</td>
			<td>0.5 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA *</td>
			<td>-</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>32.5 µL</td>
			<td>32.5 µL × x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td></td>
			<td>50 µL</td>
			<td>49 µL × x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： PCR反应组分。* 使用步骤2.3中稀释10倍、100倍或1000倍的基因组DNA。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>98°C</td>
			<td>30 秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>98°C</td>
			<td>10 秒</td>
			<td rowspan="3">25–30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>60°C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72°C</td>
			<td>45 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>72°C</td>
			<td>7 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存</td>
			<td>4°C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：扩增16S rRNA基因的PCR程序。
<img alt="凝胶电泳示意图；DNA分离；条带表示分子量标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图4"> 
图4：使用引物8F和1492R以gDNA为模板扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。B. subtilis的gDNA样本（见图3）分别稀释10倍、100倍和1000倍，以测试最佳扩增效果。泳道1：M — 分子量标记物（从上到下：10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp）。泳道2： 使用10倍稀释模板的PCR反应。泳道3： 使用100倍稀释模板的PCR反应。泳道4： 使用1000倍稀释模板的PCR反应。泳道5： （C-）阴性对照（无DNA模板的反应）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 数据分析与结果
注意： 使用正向（此处为 8F）和反向（此处为 1492R）引物对 PCR 产物进行测序。因此，将生成两组数据序列，一组对应正向引物，另一组对应反向引物。每条序列至少生成两种类型的文件：i）包含 DNA 序列的文本文件；ii）DNA 色谱图，用于显示测序运行的质量。
<ol>
	<li>对于正向引物，打开色谱图并仔细检查序列。高质量序列的理想色谱图应具有间距均匀的峰，且背景信号极少或没有（图5A）。</li>
	<li>如果色谱图质量不高，则应弃用该序列，或根据以下情况对序列文本文件进行修订：
	<ol>
		<li>在整个色谱图中出现双峰表明存在多个DNA模板。当细菌培养物不纯时可能出现这种情况。此类序列应予弃用（图5B）。</li>
		<li>模糊的色谱图可能由同一位置出现不同颜色的峰引起。最常见的错误之一是在同一位置出现两种不同颜色的峰，以及测序软件对碱基的错误指认（图5C）。应手动校正任何错误指认的核苷酸，并在文本文件中进行编辑。</li>
		<li>低分辨率色谱图可能导致“宽峰”，常引起这些区域核苷酸计数错误（图5D）。此类错误难以纠正，因此在后续比对步骤中可能出现的错配不应被视为可靠。</li>
		<li>在序列的5'端和3'端常可见色谱图读取质量差以及多峰现象。某些测序软件会自动去除这些低质量片段（图5E），且这些核苷酸不会包含在文本文件中。如果您的序列未被自动截短，请识别末端的低质量片段（例如 信号微弱、峰重叠、分辨率下降），并从文本文件中删除相应碱基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="DNA测序色谱图、基因突变检测、序列比对、数据分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图5"> 
图5：DNA测序故障排除示例。A）高质量色谱图序列的示例（峰间距均匀、峰信号明确）。B）通常出现在色谱图起始区域的低质量序列。灰色区域被视为低质量区域，测序软件会自动将其去除；也可手动进一步裁剪更多碱基。C）出现双峰（由箭头指示）。红色箭头所指的核苷酸被测序仪读为“T”（红色峰），但蓝色峰信号更强，也可能被解读为“C”。D）重叠峰表明存在DNA污染（i.e. 模板不止一个）。E）分辨率下降，即所谓的“宽峰”（由矩形标记），导致无法可靠地判读碱基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>重复步骤3.1和3.2，针对反向引物进行操作。</li>
	<li>最后，将正向和反向测序结果拼接成一条连续的序列。一次良好的测序反应可获得长达1100 bp的序列。考虑到PCR产物长度约为1500 bp，使用正向和反向引物获得的序列应存在部分重叠。
	<ol>
		<li>使用DNA序列组装程序合并这两个序列， 例如 一种免费工具，例如 CAP3（http://doua.prabi.fr/software/cap3）（15）。</li>
		<li>将两条序列以FASTA格式插入指定的文本框中。点击“提交”按钮，并等待结果返回。</li>
		<li>在结果标签页中，点击“Contigs”以查看组装后的序列，点击“Assembly details”以查看比对的详细信息。 
		注1： 如果使用 CAP3 软件进行重叠群组装，则无需将反向引物序列转换为反向互补序列；但如果使用其他程序，此步骤可能是必需的。 
		注释2： FASTA 格式是一种用于表示核苷酸序列的文本格式。FASTA 文件中的第一行（描述行）以符号“>”开头&gt;“，后接序列的名称或唯一标识符。描述行之后是核苷酸序列。请按以下格式粘贴您的序列： 
		 
		&gt;序列正向引物 
		请将文本文件中的序列粘贴至此处 
		&gt;序列反向引物 
		请在此处粘贴来自文本文件的序列</li>
	</ol>
	</li>
	<li>访问基础局部比对搜索工具（BLAST；https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）网站，进行数据库搜索。
	<ol>
		<li>选择“核苷酸BLAST”工具，将您的序列与数据库进行比对。</li>
		<li>将您的序列（在步骤 3.5 中组装的重叠群）输入“查询序列”文本框，然后在下拉菜单中选择数据库“16S rRNA 序列（细菌和古菌）”。</li>
		<li>点击页面底部的“BLAST”按钮，系统将返回最相似的序列。示例 BLAST 结果如下所示 图6在本实验中，排名最高的结果是 B. subtilis 菌株168，与BLAST数据库中可获取的序列显示100%一致性。</li>
		<li>如果最佳匹配结果未显示100%一致性，请进入比对结果检查错配情况。点击最佳匹配项后，系统将跳转至比对详情页面。比对的核苷酸之间会以短垂直线连接，而错配的核苷酸之间则存在间隙。返回测序公司提供的色谱图，再次仔细核对错配区域的序列。若发现其他错误，应予以修正。使用修正后的序列重新运行BLAST分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="DNA序列比对结果，包括基因序列、最大得分、总得分、E值和登录号。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图6"> 
图6： 核苷酸BLAST结果示例。以枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株纯培养物的16S rRNA基因序列作为查询序列。结果显示，与预期一致，排名第一的匹配序列为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株，序列相似性达100%（已加下划线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

鉴定细菌种类对于不同领域的研究人员以及医疗保健人员都具有重要意义。16S rRNA测序最初由研究人员用于确定细菌之间的系统发育关系。随着时间的推移，该技术已应用于宏基因组学研究，以分析环境样本的生物多样性，并在临床实验室中作为鉴定潜在病原体的方法。该方法能够快速、准确地鉴定临床样本中存在的细菌，有助于患者更早诊断和更快接受治疗。

16s rrna测序：一种基于pcr技术鉴定细菌物种的方法

16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

来源：Ewa Bukowska-Faniband1，Tilde Andersson1，Rolf Lood1 
1 瑞典隆德大学隆德临床科学系感染医学部，生物医学中心，隆德 221 00
地球是数百万种细菌物种的栖息地，每种细菌都具有特定的特征。细菌物种的鉴定被广泛应用于微生物生态学中，以确定环境样本的生物多样性，以及应用于医学微生物学中，以诊断感染患者。细菌可通过传统的微生物学方法进行分类，例如显微镜检查、在特定培养基上培养、生化和血清学试验以及抗生素敏感性检测。近几十年来，分子微生物学方法彻底改变了细菌鉴定技术。其中一种常用的方法是16S核糖体RNA（rRNA）基因测序。该方法不仅比传统方法更快、更准确，而且还能鉴定那些在实验室条件下难以培养的菌株。此外，在分子水平上对菌株进行区分，能够辨别表型相同的细菌（1-4）。
16S rRNA 与19种蛋白质组成的复合物结合，形成细菌核糖体的30S亚基（5）。它由16S rRNA基因编码，该基因由于在核糖体组装中具有关键功能，因此存在于所有细菌中且高度保守；然而，该基因也包含可变区，可作为特定物种的“指纹”。这些特性使得16S rRNA基因成为用于细菌鉴定、比较以及系统发育分类的理想遗传片段（6）。
16S rRNA基因测序基于聚合酶链式反应（PCR）(7-8)，随后进行DNA测序(9)。PCR是一种分子生物学方法，通过包含以下步骤的多个循环来扩增特定的DNA片段：
i) 双链DNA模板的变性 
ii) 与模板互补的引物（短寡核苷酸）的退火 
iii) DNA聚合酶酶促引物延伸，合成新的DNA链
该方法的示意图如图1所示。
<img alt="聚合酶链式反应过程示意图，展示通过变性和合成循环进行的DNA扩增。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图1"> 
图1：PCR反应的示意图概览。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
影响PCR反应成功的关键因素有多个，其中之一是DNA模板的质量。可采用标准实验方案或商业试剂盒从细菌中分离染色体DNA。应特别注意获得不含可能抑制PCR反应的污染物的DNA。
16S rRNA基因的保守区域允许设计通用引物对（一条正向引物和一条反向引物），这些引物能够结合并扩增任何细菌物种中的目标区域。目标区域的大小可能有所不同。某些引物对可以扩增大部分16S rRNA基因，而另一些则仅扩增其部分区域。表1展示了常用引物的示例，其结合位点如图2所示。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列 (5'→3')</td>
			<td>正向/反向</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8F b)</td>
			<td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td>
			<td>正向</td>
			<td>-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td>正向</td>
			<td>-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F</td>
			<td>GTGCCAGCMGCCGCGGTAA</td>
			<td>正向</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>911R</td>
			<td>GCCCCCGTCAATTCMTTTGA</td>
			<td>反向</td>
			<td>-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1391R</td>
			<td>GACGGGCGGTGTGTRCA</td>
			<td>反向</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1492R</td>
			<td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td>
			<td>反向</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于扩增16S rRNA基因的标准寡核苷酸示例a)。 
a) 使用不同引物组合扩增出的PCR产物预期长度可通过计算正向引物与反向引物结合位点之间的距离来估算（见图2），例如，使用引物对8F-1492R扩增的PCR产物大小约为1500 bp，使用引物对27F-911R扩增的产物大小约为900 bp。 
b) 也称为fD1
<img alt="DNA扩增引物示意图；用于PCR分析的基因组区域及引物位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图2"> 
图2： 16S rRNA序列及其引物结合位点的代表性示意图。保守区域以灰色表示，可变区域用斜线填充。为了获得最高分辨率，使用引物8F和1492R（名称基于其在rRNA序列上的位置）扩增整个序列，从而实现对该基因多个可变区域的测序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
PCR循环条件即 变性、引物退火和DNA合成所需的温度和时间取决于所用聚合酶的类型以及引物的特性。建议遵循特定聚合酶生产商提供的使用指南。
PCR程序完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。成功的PCR应产生一条大小符合预期的单一条带。在测序前必须对产物进行纯化，以去除PCR反应中存在的残余引物、脱氧核苷酸、聚合酶和缓冲液。纯化的DNA片段通常送往商业测序服务机构进行测序；然而，部分机构也可在本单位的核心设施内自行完成DNA测序。
DNA序列由计算机从DNA色谱图中自动生成，必须仔细检查其质量，因为有时需要进行人工编辑。在此步骤之后，将基因序列与16S rRNA数据库中已收录的序列进行比对，识别出相似区域，并获得最相似的序列。

16S rRNA测序：一种基于PCR技术鉴定细菌物种的方法

来源：Ewa Bukowska-Faniband1，Tilde Andersson1，Rolf Lood1  
1 临床科学隆德系，感染医学科，生物医学中心，...

地球上有数百万种细菌，每种都有其独特的特征。在评估环境样本时，鉴定这些细菌种类至关重要。医生也需要区分不同的细菌种类，以诊断感染患者。为了鉴定细菌，可以采用多种技术，包括通过显微镜观察其形态，或在特定培养基上培养以观察菌落形态。近年来，遗传分析作为一种细菌鉴定技术也日益普及，这在一定程度上得益于16S核糖体RNA基因测序技术的应用。细菌核糖体是由两个亚基组成的蛋白质与RNA复合物。其中较小的亚基为30S亚基，含有16S rRNA，该rRNA由基因组DNA中的16S rRNA基因编码。由于16S rRNA的某些区域在核糖体组装中具有关键功能，因此这些区域高度保守；而其他对功能影响较小的区域则在不同细菌物种之间可能存在差异。16S rRNA中的可变区域可作为细菌物种独特的分子指纹，使我们能够区分表型相同的菌株。获得高质量的基因组DNA样本后，即可开始对编码16S rRNA的基因进行PCR扩增。PCR是一种常用的分子生物学方法，包括多个循环步骤：双链DNA模板的变性、通用引物对的退火（用于扩增该基因的高度保守区域），以及DNA聚合酶介导的引物延伸。某些引物可扩增大部分16S rRNA编码基因，而另一些则仅扩增其片段。PCR完成后，可通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。若扩增成功，凝胶上应出现一条单一的条带，其大小取决于所用的引物对，最长可达约1500 bp，接近16S rRNA基因的全长。经过纯化和测序后，所获得的序列可输入BLAST数据库，与参考的16S rRNA序列进行比对。由于该数据库返回的是基于最高相似性的匹配结果，因此可用来确认目标细菌的身份。在本视频中，您将观察16S rRNA基因测序的全过程，包括PCR、DNA序列分析与编辑、序列拼接以及数据库搜索。处理微生物时，必须遵循良好的微生物操作规范，包括使用无菌技术并穿戴适当的个人防护装备。在对目标微生物或环境样本进行适当的风险评估后，获取待测培养物。本示例中使用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的纯培养物。首先，在适当的条件下，将目标微生物接种于合适的培养基中进行培养。本示例中，将枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）在LB液体培养基中，于37摄氏度、200 rpm振荡培养箱中过夜培养。随后，取1.5毫升该B. subtilis过夜培养物，使用 commercially available kit 提取基因组DNA（gDNA）。为检测所提取DNA的质量，首先将5 µL提取的gDNA与1 µL DNA凝胶上样染料混合。然后将样品上样至含有DNA染色试剂（如SYBR Safe或EtBr）的0.8%琼脂糖凝胶中。随后，将1 kb分子量标准品上样至凝胶，电泳运行至前沿染料距离凝胶底部约0.5 cm处。凝胶电泳完成后，在蓝光透射仪上观察凝胶结果。gDNA应呈现为一条位于10 kb以上位置的浓染条带，且拖尾现象 minimal。此后，为对基因组DNA（gDNA）进行连续稀释，将三支微量离心管分别标记为10X、100X和1000X。然后，使用移液器向每支试管中加入90微升无菌蒸馏水。接着，向10X管中加入10微升gDNA溶液。将全部液体上下吹打数次，确保溶液充分混匀。随后，从10X管中取出10微升溶液并转移至100X管中。按前述方法混匀溶液。最后，将100X管中的10微升溶液转移至1000X管中。开始PCR实验前，先将所需试剂在冰上解冻。然后配制PCR预混液。由于DNA聚合酶在室温下具有活性，因此反应体系的配制必须在冰上进行。将49微升预混液分装至各PCR管中。接着，向每个实验管中加入1微升模板，向阴性对照管中加入1微升无菌水，并通过上下吹打混匀。随后，根据表格中描述的程序设置PCR仪。将PCR管放入热循环仪中，并启动程序。程序完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测产物的质量，方法如前所述。使用所述方案成功进行反应应产生一条大小约为1.5千碱基的单一条带。在本示例中，含有100倍稀释基因组DNA（gDNA）的样品产生了质量最高的产物。接下来，使用 commercially available kit 对最佳的PCR产物（本例中为100倍稀释的gDNA）进行纯化。现在可将纯化后的PCR产物送样进行测序。在此示例中，使用正向和反向引物对PCR产物进行测序。因此，将生成两组数据，每组包含一条DNA序列和一个DNA色谱图：一组对应正向引物，另一组对应反向引物。首先，检查由每个引物生成的色谱图。理想的色谱图应具有间距均匀的峰，且背景信号极低或无背景信号。如果色谱图显示双峰，则PCR产物中可能存在多个DNA模板，该序列应予以舍弃。如果色谱图在同一位置出现不同颜色的峰，则测序软件可能错误识别了核苷酸。此类错误可在文本文件中手动识别并校正。色谱图中出现宽峰表明分辨率下降，导致相应区域的核苷酸计数错误。此类错误难以校正，后续任何步骤中的碱基错配均应视为不可靠。色谱图读取质量差（表现为出现多个峰）通常发生在序列的5'端和3'端。某些测序程序会自动去除这些低质量区域。如果您的序列未被自动截除，请识别出低质量片段，并从文本文件中删除相应的碱基。使用DNA组装程序将两个引物序列组装成一个连续的序列。请注意，使用正向和反向引物获得的序列应存在部分重叠。在DNA组装程序中，将两个序列以FASTA格式插入相应的输入框中。然后点击提交按钮，并等待程序返回结果。要查看组装后的序列，请点击结果标签页中的“Contigs”。然后，通过选择“assembly details”来查看比对的详细信息。访问基础局部比对搜索工具（BLAST）的网站，并选择核酸 BLAST 工具，以将您的序列与数据库进行比对。将您的序列输入到查询序列文本框中，并在下拉菜单中选择适当的数据库。最后，点击页面底部的 BLAST 按钮，等待工具返回数据库中与之最相似的序列。在此示例中，最佳匹配结果为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168 菌株，其与 BLAST 数据库中的序列具有 100% 的一致性。如果最佳匹配结果与您预期的物种或菌株的一致性未达到 100%，请点击与您的查询序列最接近的序列，以查看比对详情。比对的核苷酸之间将用短的垂直线连接，而不匹配的核苷酸之间则会留有空隙。针对识别出的不匹配区域，可对序列进行修订，并根据需要重复 BLAST 搜索。

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16S rRNA测序:基于PCR的技术，用于识别细菌物种

bacterial id with 16s rrna gene sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays.

Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster and more accurate than conventional approaches. It can also identify bacteria that are hard to grow in the lab. At the molecular level, it can separate strains that look the same under the microscope.

The 16S rRNA molecule forms part of the bacterial ribosome, which is the cell structure that helps make proteins. It joins with 19 proteins to form the 30S subunit of the ribosome. The 16S rRNA gene is present in bacteria and is highly conserved because it has an essential role. It also contains variable regions that act like fingerprints for different species.

This method uses polymerase chain reaction, or PCR, followed by DNA sequencing. PCR is a technique that copies a chosen DNA fragment through repeated cycles. Each cycle includes denaturation, when double-stranded DNA separates; annealing, when short primers bind; and extension, when DNA polymerase builds a new strand. A schematic overview of these steps is shown in the source material.

Successful PCR depends on several factors, including the quality of the DNA template. Bacterial chromosomal DNA can be isolated with standard protocols or commercial kits. The DNA should be free of contaminants that can block the PCR reaction. Conserved parts of the 16S rRNA gene make it possible to design universal primer pairs, one forward and one reverse, that can bind and amplify the target region in many bacterial species.

The target region can be different sizes. Some primer pairs amplify most of the 16S rRNA gene, while others amplify only part of it. Common examples include 8F, 27F, 515F, 911R, 1391R, and 1492R. The expected PCR product size depends on the distance between the primer binding sites. For example, the 8F-1492R pair gives a product of about 1500 bp, while 27F-911R gives about 900 bp. To get the highest resolution, 8F and 1492R are used to amplify the full sequence so several variable regions can be read.

PCR cycling conditions depend on the polymerase and the primers, so manufacturers’ guidelines should be followed. After PCR, the products are checked by agarose gel electrophoresis. A successful reaction shows a single band of the expected size. The product is then purified before sequencing so leftover primers, deoxyribonucleotides, polymerase, and buffer are removed. The purified DNA is usually sent to a commercial sequencing service, although some institutions use their own core facilities.

The DNA sequence is generated automatically from a chromatogram and then checked carefully for quality. Manual editing may be needed. After that, the sequence is compared with entries in a 16S rRNA database. Matching regions are found, and the most similar sequences are reported, which helps identify the bacterial species.

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

该集合展示了微生物调查的关键工具，包括适当的无菌技术和电镀，如何使用选择性培养基和丰富样品，以及混合或纯样品的培养方法。此外，它着眼于识别微生物分离物的常见方法，以及细菌基因操作的程序。

Learn how 16S rRNA gene sequencing uses PCR, gel checking, purification, and database matching to identify bacterial species in samples.

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

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