Name: bacterial growth stages and cell counts
Uploaded: 2023-04-30T07:10:02.000Z
Duration: 12 min 15 s
Channel: JoVE

1. 设置
<ol>
	<li>所需实验材料：液体培养基、凝固的琼脂培养基、锥形瓶、15 mL 试管、磷酸盐缓冲液（PBS）、细菌涂布器、70% 乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前必须灭菌。</li>
	<li>用 70% 乙醇对工作台进行消毒。在本生灯附近操作，以防止培养基污染。</li>
	<li>操作细菌时应使用适当的个人防护装备并遵循无菌操作技术。处理细菌培养物时必须穿戴实验服和手套。</li>
	<li>缓冲液、溶液和试剂的配制方法
	<ol>
		<li>磷酸盐缓冲液（PBS）(8)。</li>
		<li>LB 培养基（Luria-Bertani Broth）(9)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验方案
<ol>
	<li>培养基的制备
	<ol>
		<li>确定用于培养细菌的生长培养基，并分别在可高压灭菌的瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v 琼脂）培养基。此处使用LB肉汤和LB琼脂培养 Escherichia coli。</li>
		<li>将培养基装入瓶中，瓶盖稍松，于121 °C高压灭菌器中灭菌35分钟。</li>
		<li>对于琼脂培养基，高压灭菌后，将其置于50 °C水浴中冷却30分钟。冷却后，向每个100×15 mm圆形培养皿中倒入20–25 mL琼脂培养基。平板在室温下静置24小时后方可使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌的初始准备
	<ol>
		<li>从冷冻保存的菌种中，在选定的琼脂培养基平板上划线以分离单菌落。在适合目标细菌生长的条件下进行培养。此处将 E. coli 划线接种于LB琼脂平板，并在37 °C下培养过夜（16–18小时）。</li>
		<li>使用无菌接种环，从划线平板上挑取单个菌落，接种至含有4 mL液体培养基的15 mL试管中，并在适合目标细菌的条件下培养。此处将 E. coli 在37 °C、210 rpm振荡条件下培养过夜（16–18小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长曲线实验设置
	<ol>
		<li>培养瓶的准备
		<ol>
			<li>对适当大小的锥形瓶进行高压灭菌。通常采用培养基体积与锥形瓶总容积1:5的比例。此处使用500 mL锥形瓶装入100 mL LB培养基。</li>
			<li>使用移液管将无菌培养基转移至锥形瓶中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>稀释系列的制备
		<ol>
			<li>标记15 mL试管为-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8和-9，并向每管中加入9 mL PBS。这些数字对应用于计算CFU/mL的稀释倍数。每个取样时间点均需使用一组新的试管。（图2）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>琼脂平板的准备
		<ol>
			<li>在平板上标记取样时间和对应的稀释倍数。每个时间点的每个稀释度均需准备一个平板。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长曲线实验步骤
	<ol>
		<li>培养基接种
		<ol>
			<li>使用第2.2.2步制备的过夜液体培养物，按1:1000的接种体积将菌液接种至锥形瓶培养基中。此处将100 µL过夜培养液加入100 mL LB培养基中。</li>
			<li>轻轻旋转混匀培养基，使细菌均匀分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>时间点取样
		<ol>
			<li>生长条件设置
			<ol>
				<li>将锥形瓶置于目标细菌适宜的实验生长条件下。对于生长迅速的细菌，应频繁取样；对于生长缓慢的细菌，可延长取样间隔。此处 E. coli 在37°C、210转/分钟（rpm）振荡条件下培养，每1小时取样一次。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>光密度（OD600）测定
			<ol>
				<li>在每个时间点（包括起始时间点 t = 0），取出1 mL细菌培养物，加入分光光度计比色皿中。</li>
				<li>擦净比色皿外壁，测定600 nm波长处的光密度值。若OD600读数大于1.0，则取100 µL培养物与900 µL新鲜培养基按1:10稀释，测定光密度后将读数乘以10，作为最终OD600值。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>菌落形成单位（CFU/mL）测定
			<ol>
				<li>在每个时间点，取出1 mL细菌培养物，加入标记为-1的玻璃试管（内含9 mL PBS）中。</li>
				<li>进行系列稀释：从-1管开始，依次将1 mL菌液转移至后续稀释管（至-9管），每次转移后充分涡旋混匀。（图2）</li>
				<li>对每个稀释度，取100 µL细胞悬液加入相应标记的固体培养基琼脂平板上。（图2）</li>
				<li>使用经乙醇灭菌、通过本生灯火焰灼烧并接触琼脂表面冷却的涂布棒，将100 µL细胞悬液均匀涂布，直至琼脂表面干燥。</li>
				<li>将涂布后的平板倒置，置于适合细菌生长的温度下培养。此处 E. coli 在37°C下培养。</li>
				<li>培养结束后，待菌落清晰可见时，计数每个平板上的细菌菌落数量，并记录各时间点所有平板的菌落数及其对应的稀释倍数。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析与结果
<ol>
	<li>光密度（OD600）生长曲线图
	<ol>
		<li>以半对数坐标绘制光密度（OD600）随时间的变化曲线。（图3）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌落形成单位（CFU/mL）生长曲线图
	<ol>
		<li>针对每个时间点，选择菌落数在30–300个之间的稀释平板。将菌落数乘以稀释倍数，再乘以10，因为涂布的100 µL样品在计算CFU/mL时被视为额外的1:10稀释。 
		<img src="/files/ftp_upload/10511/10511eq1.jpg" alt="菌落形成单位公式：CFU=(菌落数)×10^(-稀释倍数)×10，微生物学计算。" data-altupdatedat="1761830439000"></li>
		<li>以半对数坐标绘制菌落形成单位随时间的变化曲线。（图4）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光密度与菌落形成单位的关系
	<ol>
		<li>以线性坐标绘制菌落形成单位与光密度的关系，仅使用OD600 ≤ 1.0的数据点，因为在OD600超过1.0时，OD600与CFU/mL之间的相关性准确性下降。此处绘制了前六个时间点的数据。（图5）</li>
		<li>生成线性回归趋势线，并显示方程和R2值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定细菌倍增时间
	<ol>
		<li>利用菌落形成单位的生长曲线图，在对数生长期选择曲线上斜率最陡的两点，用于计算倍增时间。</li>
		<li>倍增时间的计算
		<ol>
			<li><img align="center" src="/files/ftp_upload/10511/10511eq2.jpg" alt="倍增时间公式，ΔTime/ΔGenerations，与生长速率分析相关的方程。" data-altupdatedat="1761830439000"></li>
			<li>ΔTime = t2 - t1，其中t1为时间点1，t2为时间点2</li>
			<li><img align="center" src="/files/ftp_upload/10511/10511eq3.jpg" alt="用于计算代数的指数生长方程；数学公式。" data-altupdatedat="1761830439000">，其中b为t2时刻的细菌数量，B为t1时刻的细菌数量，n为代数。该式推导自：<img src="">。</li>
			<li>使用以下公式计算倍增时间： 
			<img src="/files/ftp_upload/10511/10511eq2.jpg" alt="倍增时间公式，ΔTime/ΔGenerations，与生长速率分析相关的方程。" data-altupdatedat="1761830439000"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

生长曲线对于理解细菌的生长动力学和生理特性具有重要价值。通过生长曲线，我们可以确定细菌在不同培养条件下的响应情况，并定义特定细菌的最佳生长参数。菌落形成单位和光密度曲线均包含有价值的信息，可用于描述延迟期的持续时间、达到的最大细胞密度，并可用于计算细菌的倍增时间。生长曲线还允许在相同培养条件下对不同细菌进行比较。此外，光密度提供了一种标准化初始接种量的方法，从而提高其他实验的一致性。
在设计生长曲线实验时，选择何种方法需要仔细考虑。菌落形成单位（colony forming unit）作图法是生成生长曲线的首选方法，能更准确地反映分批培养中的活细胞数量。菌落形成单位作图法还可在会干扰光密度测量的条件下测定细菌生长情况。然而，该方法耗时较长，需要大量试剂，且必须手动操作。光密度作图法准确性较低，仅能对菌落形成单位进行估算，且需为每种独特的细菌建立标准曲线。光密度法主要因其便捷性而被采用，因其耗时少，所需试剂也较少。光密度法最具吸引力之处在于，分光光度培养箱可自动生成生长曲线，从而极大增加可同时测试的培养条件数量，并避免了需持续照看培养物的需要。

生长曲线：利用菌落形成单位和光密度测量生成生长曲线

Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements

来源：Andrew J. Van Alst1，Rhiannon M. LeVeque1，Natalia Martin1，和 Victor J. DiRita1 
1 美国密歇根州东兰辛市密歇根州立大学微生物学与分子遗传学系
生长曲线可提供有关细菌生长动力学和细胞生理学的宝贵信息。通过生长曲线，我们能够确定细菌在不同生长条件下的响应情况，并定义特定细菌的最佳生长参数。典型的生长曲线经历四个生长阶段：迟缓期、指数期、稳定期和衰亡期（1）。
<img alt="细菌生长曲线图，显示迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期；时间与生长关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10511/10511fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图 1"> 
图 1：细菌生长曲线。 在分批培养中生长的细菌会经历四个生长阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。迟缓期是指细菌达到能够快速生长和分裂的生理状态所需的时间。对数期是细胞生长和分裂最快的阶段，此时DNA复制、RNA转录和蛋白质合成均以恒定且快速的速率进行。稳定期的特征是由于营养物质限制和/或有毒中间产物的积累，细菌生长速度减慢并趋于平稳。衰亡期是由于严重缺乏营养物质而导致细胞裂解的阶段。
延滞期是指细菌达到能够快速生长和分裂的生理状态所需的时间。这种延滞的出现是因为细菌需要一定时间来适应新的环境。一旦在延滞期中合成了必要的细胞组分，细菌便进入对数生长期，在此阶段，DNA复制、RNA转录和蛋白质合成均以恒定且快速的速率进行（2）。对数生长期中细胞快速生长与分裂的速率可通过世代时间（即倍增时间）来计算，该时间代表了细菌在给定条件下能够复制的最快速度（1）。倍增时间可用于比较不同的生长条件，以确定哪种条件更有利于细菌生长。对数生长期是可重复性最高的生长状态，因为此时整个细菌群体的细胞生理状态具有一致性（3）。对数期之后是稳定期，此时细胞生长趋于平稳。稳定期的出现是由于营养物质的耗尽和/或有毒代谢产物的积累所致。细菌细胞在此阶段仍可存活，但复制和细胞分裂的速率显著降低。最后一个阶段是死亡期，严重的营养耗竭导致细胞裂解。生长曲线中提供的最有价值的信息包括延滞期的持续时间、倍增时间以及达到的最大细胞密度。
分批培养物中细菌的定量可通过菌落形成单位和光密度测量来确定。通过菌落形成单位（CFU）进行计数可提供细菌细胞数量的直接测量结果。CFU 的标准计量单位是每 1 mL 培养液中存在的可培养细菌数量（CFU/mL），该数值通过连续稀释和涂布平板技术确定。对于每个时间点，对分批培养物进行 1:10 的系列稀释，并使用细胞涂布器将每个稀释度的 100 µl 涂布于平板上。
<img alt="Serial dilution plating diagram; batch culture dilutions for microbial colony counting experiment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10511/10511fig2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 连续稀释涂布平板示意图 从批量培养物进行稀释涂布的一般流程。通过将前一稀释度的1 mL样品转移至含有9 mL PBS的下一试管中，依次进行1:10的系列稀释。从每个稀释度试管中取100 µL，使用涂布器进行涂布，此步骤相当于额外的1:10稀释，因其为十分之一量。th 在计算CFU/mL时，体积为1 mL。将平板培养至克隆菌落生长后进行孵育和计数。
然后将平板在过夜培养后孵育，并对克隆菌落进行计数。选择长出30-300个菌落的稀释平板，用于计算特定时间点的CFU/mL（4, 5）。当菌落数少于30时，CFU/mL的计算结果会因随机变异而产生较大误差；而菌落数超过300时，由于菌落拥挤和重叠，可能导致计数偏低。根据该平板对应的稀释倍数，可计算出每批培养物在各个时间点的CFU值。
光密度可通过分光光度计快速估算细菌细胞数量。光密度用于衡量光粒子穿过1 cm培养液后被光电二极管传感器检测到的吸光程度（6）。培养液的光密度相对于培养基空白对照进行测定，并随细菌密度增加而升高。对于细菌细胞，测量光密度时通常采用600 nm波长（OD600）（4）。通过建立菌落形成单位与光密度之间的标准曲线，可利用光密度测量值快速估算批量培养液中的细菌细胞数量。然而，当OD600达到0.3时，该相关性即开始减弱，因为此时细胞开始改变形态并在培养基中积累胞外产物，从而影响光密度读数与菌落形成单位之间的关系（7）。这种误差在稳定期和衰亡期更为显著。
在此，大肠杆菌在37°C条件下于Luria-Bertani（LB）肉汤中培养30小时（7）。同时绘制了CFU/mL和光密度生长曲线，并建立了光密度与CFU之间的标准曲线。
<img alt="大肠杆菌OD600生长曲线，光密度与时间关系，细菌培养动力学，数据分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10511/10511fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图3"> 
图3. Escherichia coli 在600 nm波长下的光密度（OD600）生长曲线。 光密度值通过分光光度计直接测定，以无菌LB培养基作为空白对照。当OD600值大于1.0时，将100 µl菌液与900 µl新鲜LB培养基混合，进行1:10稀释，再次测定后乘以10，得到实际OD600值。此步骤是为了避免高细胞密度下分光光度计测量准确性下降的问题。从曲线可见，迟缓期持续约1小时，随后在2至7小时之间转入对数生长期，之后生长趋于平缓，进入稳定期。衰亡期并无明显转折，但在15小时后光密度开始逐渐下降。
<img alt="大肠杆菌生长曲线图，菌落形成单位/毫升（CFU/mL）随时间变化，显示细菌增殖趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10511/10511fig4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图 4"> 
图 4. 大肠杆菌（Escherichia coli）每毫升菌落形成单位（CFU/mL）生长曲线。 每个时间点的 CFU/mL 值均根据含有 30–300 个菌落的稀释平板计算得出。从曲线可见，迟缓期持续约 2 小时，随后在 2 至 7 小时之间转入对数生长期，之后开始趋于平缓，进入稳定期。衰亡期并无明显转折，但从 15 小时起 CFU/mL 逐渐下降，峰值为 2 × 109，至 30 小时时降至约 5 × 108。
<img alt="大肠杆菌CFU/ml与OD600标准曲线，带回归线的图表，显示细菌生长分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10511/10511fig5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
图5. CFU/mL与OD600之间的标准化曲线。 可通过线性回归将这两个单位关联起来，从而利用光密度值近似估算细菌细胞密度。光密度可用于快速估算批量培养物中的CFU/mL值。本图中仅绘制了前六个时间点，因为在OD600超过1.0之后，OD600与CFU/mL之间的关系准确性下降，这是由于细菌进入稳定期后细胞形态发生变化且胞外产物开始积累，而稳定期通常在OD600达到1.0后不久即出现。培养基中细胞形态的改变以及胞外产物的增加会影响光密度读数，因此也会影响光密度与培养物中细菌数量之间的对应关系。
倍增时间已确定为15分钟19秒。根据该数据，可以直观展示大肠杆菌在LB培养基中的生长能力，并可用于不同培养基或细菌之间的比较。

菌落形成单位和光密度的曲线图是可视化生长动力学的两种方法。通过确定CFU/mL与OD600之间的关系，光密度曲线图也可用于估计随时间变化的CFU/mL值。使倍增时间最短的条件被认为是该特定细菌生长的最优条件。

来源：Andrew J. Van Alst1，Rhiannon M. LeVeque1，Natalia Martin1 和 Victor J. DiRita1  
1 密歇根大学医学院微生物学与分子遗传学系，美国密歇根州...

细菌通过一种称为细胞分裂的过程进行繁殖，产生两个完全相同的子细胞。如果生长条件适宜，细菌种群将呈指数级增长。细菌生长曲线描绘了培养物中细菌数量随时间的变化关系。典型的生长曲线经历四个阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。迟缓期是指细菌达到能够快速生长和分裂状态所需的时间。此后，细菌进入以细胞快速生长和分裂为特征的对数期。在此期间，细菌培养物的对数生长速率可用倍增时间来表示，即细菌在特定条件下能够繁殖的最快速率。接下来是稳定期，由于环境中营养物质的耗尽，细菌细胞的生长趋于平稳，生长速率与死亡速率达到平衡。最后，细菌进入衰亡期，此时细菌数量急剧下降，严重的营养耗竭导致细胞裂解。有两种技术可用于定量测定培养物中的细菌数量并绘制生长曲线。第一种是通过菌落形成单位（CFUs）进行测定。为获得CFUs，需在规律的时间点进行一系列10倍递增的9个稀释梯度。以本例中的第一个稀释梯度（即稀释度-1）为例，其中包含9 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）和1 mL细菌培养液，从而实现1:10的稀释倍数。随后，取1 mL该溶液转移至下一个试管（即稀释度-2），得到1:100的稀释倍数。此过程依次进行至最后一个试管（即稀释度-9），最终实现1:10亿的稀释倍数。此后，取每种稀释液各100 µL涂布于平板上。平板经培养后，计数克隆形成的菌落。对于每个时间点，选择长出30至300个菌落的稀释平板，用于计算该时间点每毫升的菌落形成单位数（CFUs/mL）。测量细菌浓度的第二种常用方法是光学密度法。通过分光光度计，可立即测定菌液相对于空白培养基的光学密度。通常采用600纳米波长（也称为OD600）进行测定，其数值随细胞密度的增加而升高。虽然光学密度法的精确度低于菌落形成单位（CFU），但其优势在于可即时获得结果，且所需试剂相对较少。这两种技术可结合使用，建立标准曲线，从而更准确地估算菌液中的细菌数量。在本视频中，您将学习如何从大肠杆菌（E. coli）的时间序列稀释样品中获取CFU和OD600的测量数据。随后，将分别根据CFU和OD600的测量结果绘制两条生长曲线，并通过标准曲线将二者关联起来。处理细菌时，必须使用适当的个人防护装备，例如实验服和手套，并遵守正确的无菌操作技术。此后，用70%乙醇对工作台进行消毒。首先，分别在可高压灭菌的瓶中制备LB液体培养基和LB固体琼脂培养基。将瓶盖部分旋紧后，在121摄氏度的高压灭菌器中对培养基灭菌35分钟。接着，将琼脂培养基置于50摄氏度的水浴中冷却30分钟。冷却后，向每个培养皿中倒入20至25 mL培养基。此后，将平板在室温下静置24小时使其凝固。为制备后续用于产生液体细菌培养物的单菌落分离株，使用先前冻存的菌种，并采用适当的划线分离技术，将大肠杆菌（E. coli）在LB琼脂平板上进行划线分离。将平板置于37°C培养过夜。之后，将经火焰灭菌的接种环在琼脂表面冷却，然后从划线平板上挑选一个单菌落。将其接种至15 mL试管中的4 mL液体培养基中。随后，在37°C、210 rpm振荡条件下培养大肠杆菌过夜。为了制备用于生长曲线实验的1:1000体积细菌培养物，首先取一个已灭菌的500 mL锥形瓶。然后使用50 mL刻度吸管将100 mL无菌培养基转移至该锥形瓶中。接着，依次标记九个15 mL试管，编号为1至9。这些编号对应于用于计算菌落形成单位（CFU）的稀释倍数。随后，向每个试管中加入9 mL的1×PBS缓冲液。之后，标记已准备好的琼脂平板，注明将要培养的时间点和对应的稀释倍数。以本例中的大肠杆菌（E. coli）为例，在起始时间点之后，每隔一小时取一次样。使用预先准备的过夜液体E. coli培养物，按1:1000的体积比接种至已灭菌的500 mL锥形瓶中的培养基中。轻轻旋转培养基，使细菌均匀分布。在空白校准分光光度计后，使用无绒布清洁比色皿。接着，将1 mL菌液加入比色皿中，并将其放入分光光度计，测定零时点的菌液光密度。随后，将大肠杆菌在37°C、210 rpm振荡条件下培养。在零时点之后的每个时间点，从锥形瓶中取出另1 mL细菌培养物，并重复光密度测定。若光密度读数大于1.0，则取100 µL细菌培养物与900 µL新鲜培养基混合稀释，再次测定光密度。该数值乘以10即为OD 600测定值。为获得每个时间点的菌落形成单位（CFU）测量值，需在每个时间点从锥形瓶中额外取出 1 mL 细菌培养液。将细菌培养液加入标号为 -1 的试管中，并涡旋混匀。随后进行梯度稀释：首先将 1 mL 从 -1 管转移至 -2 管，涡旋混匀；再将 1 mL 从 -2 管转移至 -3 管，涡旋混匀。以此类推，连续进行系列转移，直至 -9 管。将 100 µL 细胞悬液分别涂布到对应标记的培养皿上，每个稀释度对应一个平板。对于每个稀释度，先将涂布棒在乙醇中消毒，再通过本生灯火焰灼烧灭菌，并在琼脂表面远离接种区域处轻触冷却。然后使用涂布棒将细胞悬液均匀涂布，直至琼脂表面变干。将平板倒置于 37 °C 培养箱中孵育。待菌落清晰可见后，计数每个平板上的细菌菌落数量。记录每个时间点各平板的菌落数及其对应的稀释倍数。为了绘制 OD 600 生长曲线，在确保所有数据点已正确输入表格后，选择所有时间点及其对应的数据。为了生成菌落形成单位（CFU）生长曲线图，需选择每个时间点菌落数在 30 至 300 个细菌范围内的稀释平板。将菌落计数乘以稀释倍数，再乘以 10。这是因为涂布的 100 微升样品在计算每毫升菌落形成单位时被视为额外的 1:10 稀释。之后，在半对数坐标系中绘制菌落形成单位随时间的变化曲线。分别通过 OD 600 和 CFU 测量获得的这些曲线图可提供有关大肠杆菌生长动力学的宝贵信息。光学密度与菌落形成单位之间存在关联，因此可根据 OD 600 测量值估算每毫升的 CFU 数量，从而在后续实验中节省时间和材料。为此，将菌落形成单位（CFU）与光密度（OD 600）在 OD 600 读数小于或等于 1.0 的范围内以线性刻度作图。随后，生成一条 Y = MX + B 形式的线性回归趋势线，其中 M 为斜率，B 为 y 轴截距。右键单击数据点，选择“添加趋势线”并选择“线性”。然后，勾选“在图表上显示公式”和“在图表上显示 R 平方值”选项。R 平方值是衡量数据与拟合回归线接近程度的统计指标。在本示例中，前 6 个时间点的数据被绘制，其中 x 轴为 OD 600，y 轴为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。在今后相同培养条件下进行的实验中，可将这些斜率和 y 轴截距值代入该方程，以根据 OD 600 读数估算 CFU 数量。接下来，观察菌落形成单位的生长曲线图。在对数生长期，找出两点之间斜率最陡的两个时间点。为计算倍增时间，首先计算所选时间点之间的时间变化量。然后，使用此处所示公式计算代数变化量。其中，小写 b 表示时间点三的细菌数量，大写 B 表示时间点二的细菌数量。最后，将时间变化量除以代数变化量。在本示例中，倍增时间为 0.26 小时，即 15 分钟 19 秒。通过比较不同实验处理条件下的倍增时间，可确定特定细菌物种的最佳生长条件。因此，在所测试的条件中，倍增时间最短的处理条件即为最优。

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Education

教育

JoVE Science Education

Advanced Biology

高级生物学

Microbiology

微生物学

生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

bacterial growth stages and cell counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth.

Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and protein production all happen at a steady, rapid pace. The doubling time, also called generation time, describes how long it takes for the population to double. It is useful for comparing which growth conditions are better for a bacterium.

Stationary phase comes after exponential growth slows down and levels off. Nutrient limits and toxic intermediates can cause this plateau. Cells are still alive in this stage, but replication and division are much lower. Death phase follows when severe nutrient depletion leads to cell lysis, or cell breaking apart.

Bacterial numbers in batch culture can be measured by CFU and by optical density. CFU gives a direct count of culturable cells in 1 mL of culture, or CFU/mL. To measure it, the culture is serially diluted 1:10, and 100 µl from each dilution is spread on a plate. After overnight incubation, the plate with 30 to 300 colonies is used to calculate CFU/mL. Counts below 30 can be less reliable, and counts above 300 can be underestimated because colonies crowd together.

Optical density gives a fast estimate of cell density using a spectrophotometer. The reading measures how much light passes through 1 cm of culture and is taken against a media blank. For bacteria, OD600, or optical density at 600 nm, is commonly used. As the culture becomes denser, the OD increases. A standard curve linking OD600 and CFU/mL can turn an instant OD reading into an estimate of bacterial count.

This relationship is most reliable only at lower densities. It can start to break down around 0.3 OD600, and the error becomes greater during stationary and death phases. As cells change shape and release extracellular products into the medium, the OD reading no longer tracks CFU as closely. In the example shown, Escherichia coli is grown in Luria-Bertani, or LB, broth at 37°C for 30 hours. The OD600 curve is measured directly, and values above 1.0 are diluted 1:10, then multiplied by 10 because the spectrophotometer becomes less accurate at high density.

The example E. coli culture shows lag phase to about 1 hour on the OD600 curve and about 2 hours on the CFU/mL curve. Exponential growth runs from about 2 to 7 hours, then the culture plateaus in stationary phase. After about 15 hours, both OD and CFU begin to decline, although the death phase is gradual rather than abrupt. The CFU/mL curve peaks near 2 x 10^9 and falls to about 5 x 10^8 by 30 hours. A linear standard curve between CFU/mL and OD600, based on the earlier time points, lets OD estimate cell density. From these data, the doubling time was calculated as 15 minutes and 19 seconds, which helps compare growth in different media or between different bacteria.

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

该集合展示了微生物调查的关键工具，包括适当的无菌技术和电镀，如何使用选择性培养基和丰富样品，以及混合或纯样品的培养方法。此外，它着眼于识别微生物分离物的常见方法，以及细菌基因操作的程序。

Track bacterial growth through lag, exponential, stationary, and death phases. Learn how CFU/mL and OD600 measurements estimate cell density in E. coli.

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Description

Transcript

Tags